Bildgebung der subzellulären Kalziumdynamik in Neuronen von Caenorhabditis elegans

Nehmen Sie zwei separate transgene Caenorhabditis elegans-Stämme auf Objektträgern mit Agar-Pads. Die Pads enthalten eine Rolllösung mit einem Lähmungsmittel, das die Bewegung minimiert.

Der ventrale Nervenstrang (VNC) der Würmer enthält exzitatorische Interneurone, die in einem Stamm zytoplasmatische Kalziumindikatoren und im anderen mitochondriale Kalziumindikatoren exprimieren.

Legen Sie ein Deckglas auf, um die Würmer zu rollen, richten Sie den VNC zur Visualisierung aus und positionieren Sie sie dann unter einem Fluoreszenzmikroskop.

Verwenden Sie sichtbares Licht, um die Würmer zu lokalisieren, und wechseln Sie dann in den Fluoreszenzmodus.

In ruhenden Neuronen hält ein niedriger intrazellulärer Kalziumspiegel die Indikatoren ungebunden, was zu einer schwachen Fluoreszenz führt.

Spontane neuronale Aktivität öffnet spannungsgesteuerte Kalziumkanäle und ermöglicht so den Kalziumeinfluss.

Im Stamm mit zytoplasmatischen Indikatoren bindet Calcium an die Indikatoren und erhöht so die zytoplasmatische Fluoreszenz.

Überschüssiges zytoplasmatisches Kalzium gelangt durch Kanäle in die Mitochondrien. Bei dem Stamm mit mitochondrialen Indikatoren erhöht die Kalziumbindung die mitochondriale Fluoreszenz.

Bilden Sie die Neuronen in beiden Stämmen ab, um die subzelluläre Kalziumdynamik zu überwachen.

Bereiten Sie in einem 13 x 100 Millimeter großen Glaskulturröhrchen 3 Milliliter 10%igen Agar vor, indem Sie Agar in molekularer Qualität in M9 auflösen und einige Sekunden lang in der Mikrowelle erhitzen. Um die Agar-Pads herzustellen, bereiten Sie zunächst zwei Objektträger vor, indem Sie zwei Lagen Laborklebeband hinzufügen. Platzieren Sie dann einen Objektträger zwischen den beiden Objektträgern. Schneiden Sie die Spitze einer 1.000-Mikroliter-Pipettenspitze ab und pipettieren Sie damit einen kleinen Tropfen Agar auf die Mitte des Deckglases.

Glätten Sie den Agar, indem Sie einen weiteren Schieber auf den Agar drücken. Schneiden Sie den Agar nach dem Abkühlen mit der Öffnung eines 10-Milliliter-Röhrchens in eine kleine Scheibe und entfernen Sie dann den umgebenden Agar. Bereiten Sie als Nächstes die Wurmwalzlösung vor, indem Sie Muscimol-Pulver in M9 auflösen, um einen 30-Millimolar-Stamm zu erhalten. Verdünnen Sie das Material im Verhältnis eins zu eins mit Polystyrolkügelchen, um die Walzlösung herzustellen.

Um den Wurm für die Bildgebung zu positionieren, geben Sie zunächst 1,6 Mikroliter der Rolllösung auf die Mitte des Agarpads. Übertragen Sie dann mit einem bevorzugten Wurmstocher einen Wurm des gewünschten Alters in die Rolllösung auf dem Agarpad. Warten Sie etwa fünf Minuten, bis das Muscimol die Wurmbewegung reduziert hat, und lassen Sie dann ein 22 x 22 Millimeter großes Deckglas auf das Agarpad fallen.

Zur Darstellung von Neuriten im ventralen Nervenstrang rollen Sie den Wurm, indem Sie das Deckglas leicht verschieben. Um den Wurm auf das Mikroskop zu montieren, geben Sie einen Tropfen Tauchöl auf das Deckglas. Finde den Wurm mit einem Objektiv mit geringer Vergrößerung im Hellfeld. Wechseln Sie dann zum 100X-Objektiv und lokalisieren Sie den AVA-Neurit mithilfe der Beleuchtung des GCaMP oder mito-GCaMP mit dem 488-Nanometer-Bildgebungslaser.