RNAi-vermittelte Gen-Knockdown und In Vivo Diurese Assay in Adult Female Aedes aegypti Moskitos

Dieses Videoprotokoll demonstriert eine effektive Technik, um ein bestimmtes Gen in einem Insekt auszuschalten und einen neuartigen Bioassay zur Messung der Ausscheidungsrate durchzuführen. Die Technik, die wir heute demonstrieren werden, kombiniert einen RNAi-vermittelten Gen-Knockdown mit einem in vivo Diurese-Assay. Es kann verwendet werden, um die Diurese bei verschiedenen Portweinarten zu untersuchen, und wir haben es tatsächlich entwickelt, um die Funktion von Aquaporin-Wasserkanälen bei zwei verschiedenen Mückenarten zu untersuchen.

Das Protokoll, das ich heute vorstellen werde, besteht aus zwei Teilen. Die erste Demonstration zeigt, wie man ein einfaches Mückeninjektionsgerät konstruiert und doppelsträngige RNA für den RNA-vermittelten Gen-Knockdown vorbereitet und in die Thoraxmücken injiziert. Die zweite Demonstration zeigt, wie die Ausscheidungsraten in Mücken gemessen werden können, wobei ein in vivo-Bioassay als erster Schritt verwendet wird, um einen RNAi-vermittelten Gen-Knockdown durchzuführen, spezifische Dublett-strangige RNAs gegen Gene von Interesse und kontrollierte Dublett-Stränge RNAs werden synthetisiert. Zu den zusätzlichen Geräten und Materialien, die benötigt werden, gehört ein Aspirator mit Auffangfläschchen für die Mückensammlung.

Pinzette mit feiner Spitze, CO2-Fliegenkissen, das an eine CO2-Gasflasche Ethanol angeschlossen ist, um das Fliegenpad-Stereomikroskop bei Bedarf mit Nadelabzieher der Lichtquelle zu reinigen. Glaskapillarnadeln mit markierten Ein-Millimeter-Schritten, ein Mikroinjektor zum Injizieren von Mücken, ein Behälter zum Platzieren von Mücken nach der Injektion und eine Nahrungsquelle für die Mücken nach der Injektion, wie z. B. 20% Saccharose, eingeweichter Wattebausch oder in Wasser eingeweichte Rosinen. Ein einfacher Mikroinjektor kann mit einer Schere konstruiert werden.

Eine Metallnadel, eine Glaskapillare, eine Ein-Milliliter-Spritze, eine Ein-Milliliter-Pipettenspitze aus Kunststoff und ein Schlauch, der auf eine Länge von etwa 40 Zentimetern geschnitten ist. Die Spitze der Spritzennadelnabe wird bei 0,2 Milliliter Skalenmarkierung abgeschnitten und der Gummikolbenkopf entfernt. Mit einer Metallnadel wird ein Loch in den Kolbenkopf gestanzt.

In das Loch wird eine Glaskapillare eingesetzt und der Kopf wieder in die Spritze eingesetzt. Die Spitze der Spritze wird dann in ein Ende des Schlauchs und eine Pipettenspitze aus einem Milliliter aus Kunststoff in das andere Ende gesteckt. Dieser wird als Mundstück verwendet.

Alternativ kann eine 10-Milliliter-Spritze verwendet werden, um den für die Injektion erforderlichen Luftdruck zu erzeugen. Setze als nächstes eine Glaskapillarnadel in das Kopfloch des Gummikolbens ein und breche die Spitze der Nadel ab, so dass die Breite groß genug ist, damit Flüssigkeit durchfließen kann. Tauchen Sie die Injektionsnadel in die vorbereitete D-S-R-N-A-Probe und ziehen Sie die flüssige Probe in die Injektionsnadel, indem Sie die Flüssigkeit mit einem Mundstück oder einer Spritze aufsaugen.

Sammeln Sie Mücken mit einem batteriebetriebenen Sauger in ein Auffangfläschchen. Setzen Sie eine Kappe über das Fläschchen und legen Sie sie auf ein sauberes CO2-Pad, um Mücken zu betäuben. Alternativ können Mücken auf Eis betäubt werden.

Entsorgen Sie alle männlichen Stoffe, bevor Sie mit dem Injektionsprozess beginnen. Sie können auf dem CO2-Pad mit einer Feder oder einem Pinsel manipuliert werden. Fassen Sie die Mücken mit einer Pinzette an den Beinen oder Flügeln, um Verletzungen zu vermeiden.

Wenn Sie bereit sind, die erste Mücke zu injizieren, stützen Sie vorsichtig eine Seite des Brustkorbs, indem Sie die Spitze der Nadel mit der Pinzette in die andere Seite des Brustkorbs einführen. Es ist besser, in einen dünnen Teil der Nagelhaut zu injizieren und zu vermeiden, die Nadel zu tief in den Brustkorb zu drücken. Sobald die Nadel an Ort und Stelle ist, blasen Sie die Flüssigkeit in die Mücke.

Doppelsträngig. RNA dispergiert sich in der Hämolymphe und wird von den Zellen aufgenommen, was einen RNA-Augen-vermittelten Knockdown der Zieljeans auslöst. Nach der Injektion werden die Mücken zur Lagerung in einen Behälter gelegt.

Zum Beispiel eine Ein-Pint-Wachslinie, ein Pappbecher mit Netzabdeckung, die mit dem Pappdeckel gesichert ist. Sobald alle Mücken in den Behälter gelegt wurden, sollte der Behälter zur Inkubation in eine klimatisierte Kammer gestellt werden, und die Mücke sollte auch mit einer Nahrungsquelle wie 20% Saccharose, Seife und Wattebällchen versorgt werden, die auf der Netzabdeckung platziert werden Für Generationen. Die Diurese von Insekten ist heutzutage als einfaches Modellsystem für Studien für Forscher attraktiv.

Techniken wie RNAi können verwendet werden, um die Diurese auf molekularer Ebene zu untersuchen. Die in diesem Video gezeigten Techniken sollen eine einfache Möglichkeit bieten, die Diurese in vivo zu untersuchen. Weibliche Mücken beginnen innerhalb von zwei Minuten nach der Injektion mit PBS-Puffer Urin auszuscheiden, daher ist es wichtig, Gewichtsmessungen durchzuführen, bevor sie mit der Ausscheidung beginnen.

Im zweiten Teil dieses Protokolls werde ich zeigen, wie man einen in vivo Diurese-Assay an Jedi-Mücken durchführt. Zusätzliche Materialien und Geräte, die im Knockdown-Protokoll nicht benötigt wurden, aber in diesem Protokoll benötigt werden, RPBS-Pufferlösung und eine analytische Präzisionswaage für die Durchführung von Gewichtsmessungen, die Waage sollte in der Lage sein, eine Genauigkeit von 10 Milligramm zu erreichen. Vor der Sammlung der Mücken wird das Gewicht eines leeren Auffangfläschchens mit einer Kappe unter Verwendung der analytischen Präzisionswaage aufgezeichnet. Dieses Fläschchen wird für alle nachfolgenden Messungen verwendet.

Nehmen Sie die anfängliche Gewichtsmessung von fünf Weibchen, indem Sie das Fläschchen mit den Mücken mit der Kappe auf die Präzisionswaage legen. Sobald Sie fünf weibliche Mücken betäubt haben, sollten Sie sie auf dem CO2-Pad ausrichten, um einen leichteren Zugang mit dem Mikroinjektor zu ermöglichen. Wenn die Nadel in den Brustkorb eingeführt wird, bläst du PBS-Puffer in die Mücke.

Legen Sie die Mücken nach der Injektion vorsichtig in das Auffangfläschchen und verschließen Sie es. Nehmen Sie die erste Gewichtsmessung der fünf injizierten Mücken vor, indem Sie das Feldauffangfläschchen mit der Kappe auf die Präzisionswaage setzen. Das Gewicht der Gruppe von fünf Mücken kann berechnet werden, indem das Gewicht des Feldauffangfläschchens mit Kappe genommen und das Gewicht des leeren Auffangfläschchens mit dem Kappengewicht subtrahiert wird.

Messungen der Mücke sollten in 30-Minuten-Intervallen durchgeführt werden, dies kann jedoch je nach Ausscheidungsrate auf kürzere oder längere Intervalle eingestellt werden. Sammeln Sie nach 30 Minuten die Gruppe von fünf Mücken mit einem Aspirator in dasselbe Sammelfläschchen mit Verschluss. Nehmen Sie dann die nächste Gewichtsmessung vor, indem Sie das Feldauffangfläschchen mit Kappe auf die Präzisionswaage setzen.

Der Diurese-Assay wurde bei unterschiedlichen Temperaturen mit zwei Mückenarten ADA aegypti und kyx kti durchgeführt. Die Ausscheidungsrate in der ersten Stunde nach der Injektion wird in Prozent angegeben. Das Diagramm zeigt einen starken Anstieg der Diurese mit steigender Temperatur.

Wir beobachteten auch einen Unterschied in der Ausscheidungsrate zwischen den beiden Mückenarten. Es gibt eine breite Palette zukünftiger Anwendungen für den hier vorgestellten in vivo Diurese-Assay. Zusätzlich zu reversen genetischen Methoden wie RNAI kann es verwendet werden, um die Auswirkungen von Medikamenten auf die Diurese von Insekten zu untersuchen, z. B. Signaltransduktionshemmer usw.

Es ist auch ein leistungsstarker Assay, um den Prozess der xeno-biotischen Clearance in der Zielinstanz zu untersuchen.