Name: In-vivo-Elektroporation von Morpholinos in das Regenerations Adult Zebrafisch Leitwerk (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-29T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 22 s
Description: Lernen Sie die In-vivo-Elektroporation von Morpholinos zur gezielten Protein-Knockdown im regenerierenden Schwanzflossengewebe von Danio rerio. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung essenzieller Gene für die Geweberegeneration.

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Die Autoren möchten die Freimann Life Science Center und Center for Zebrafisch-Forschung Mitarbeiter danken für ihre Pflege und Wartung des Zebrafisch.

1. Resuspendieren Morpholino <ol><li> Verdünnen von 300 nM Fluorescein-markierten Morpholino in 100 ul Nuklease-freies Wasser zu einer etwa 3 mM Lösung zu machen. Der Morpholino-Lösung wird in mehrere Paraffin versiegelt Mikrozentrifugenröhrchen aliquotiert und bei Raumtemperatur gelagert und lichtgeschützt aufbewahren. </li><li> Um die genaue Konzentration bestimmen, Morpholino, verdünnen 5 ul der Morpholino-Lösung (oder Wasser als Blindprobe) in 95 ul 0,1 N HCl. Stellen Sie eine Grundlinie auf einem Spektrophotometer bei 265 nm mit dem Wasser leer, und dann bestimmen, das Lesen der verdünnten Lösung Morpholino. Multiplizieren Sie den Morpholino-Absorption bestimmt durch seine konstante und mit dem Verdünnungsfaktor, um die Konzentration in ng / ul bestimmen. Das Morpholino konstanten wird wie folgt berechnet: Morpholino konstant = Molekulargewicht der Morpholino-X 1000/molar Absorption. Das Molekulargewicht und molarer Extinktion für die Morpholino können auf dem &quot;gefunden werdenOligo-Eigenschaften &quot;Blatt mit dem Produkt geliefert. Teilen Sie den Morpholino-Konzentration in ng / ul, durch das Molekulargewicht, um die Konzentration in mM zu bestimmen. Verdünnen Sie die Morpholino, falls notwendig, zu einer funktionierenden Konzentration, in der Regel 1,2 mm. </li></ol> 2. Fin Amputation <ol><li> Anesthetize erwachsenen Zebrafisch entweder Tricaine oder 2-Phenoxyethanol 1,0 mg / ml Wasser in dem Tank. </li><li> Amputieren die Rippe mit einem sterilen Skalpell oder Rasierklinge proximal zu dem ersten Verzweigungspunkt lepidotrichial. Dies sollte in der gleichen proximal / distalen Position auf jedem Tier (z. B. 7 Knochensegmente distal von der Rippe Gürtel) durchgeführt werden. WICHTIG: achten Sie darauf, perfekt senkrecht geschnitten, um den anterioren / posterioren Ebene des Tieres. Winkelschnitte wird in unebenem fin Auswuchs der dorsalen und ventralen Hälften der Flosse führen. </li><li> Bringen Sie den Fisch mit einem Tank. Wir pflegen in der Regel die Fische bei 33 ° C, um die Regeneration zu erhöhen. Je nach experimentellem Design, wAIT 0-2 Tage nach der Amputation (dpa) Flosse für Regeneration, um vor der Einführung des Morpholino beginnen. Alternative Ansätze sind in der Diskussion besprochen, unten. </li></ol> 3. Morpholino Injektion <ol><li> Der Tag vor dem Einspritzen des Morpholino, machen eine Injektion Platte (Abbildung 2). Achten Sie darauf, ausgeschnitten eine Kerbe an einem Ende des Brunnens, die Stabilisierung der Fisch für die Mikroinjektion Prozedur hilft. </li><li> Bei 2 dpa, bereiten Sie das Mikro-Einspritzvorrichtung und Morpholino-Lösung. </li><li> Verdünnen Sie die Fluorescein-markierten Morpholino auf die richtige Konzentration (empfehlen, beginnend mit 1,2 mM) und in einem 65 ° C warmes Wasserbad, für 5 Minuten. </li><li> Ziehen Sie die Nadel aus Glas für die Mikro-Injektion mit einer Nadel Abzieher. </li><li> Legen Sie die Nadel mit der Morpholino (Hinweis: je nachdem, ob Sie Back-Füllung oder laden Sie Ihre Front-Nadel wird entscheiden, ob Sie die Nadel zuerst laden, oder schneiden Sie die Spitze zuerst). </li><li> Schneiden Sie die Spitze vor der Nadel in einemn Winkel. </li><li> Befolgen Sie die Anweisungen Ihres Mikro-Einspritzsystem, um eine etwa 5 nl Blase der Morpholino pro Injektion zu injizieren. Größere Mengen von Morpholino könnte stören das Gewebe. </li><li> Betäuben die Fische und auf Injektion Platte. Entfernen Sie das gesamte überschüssige Flüssigkeit und richten Sie die Nadel an die entsprechende Stelle, knapp distal des knöchernen ray (Abbildung 3). Mit Hilfe eines Mikroskops und Mikroinjektion Apparat geeignet für Morpholino-Injektionen (siehe Tabelle der spezifischen Reagenzien), injizieren die Morpholino in die Flosse von vorne nach hinten, wie in Abbildung 3 dargestellt. Die Injektion von hinten nach vorne bewirkt, dass der Finne Gewebe aufzurollen während der Injektion und ist sehr schwierig. </li><li> Führen Sie die Nadel vorsichtig in das regenerative Gewebe, genau distal zu jedem knöchernen ray (mit &quot;1&quot; in Abbildung 3) und schieben, bis distal im Blastem befindet (&quot;2&quot; in Abbildung 3). Achten Sie darauf, die Nadel durch die Push-enReifen fin. Wenn die Nadel korrekt lokalisiert ist, spritzen sie den Morpholino (dh klicken Sie auf eine Zeit). Bei 1,2 mm, wird das Fluorescein-markierte Morpholino Lösung gelb-grün, selbst bei normalen Lichtverhältnissen. Mit jeder Injektion, ein gelbes &quot;puff&quot; von Morpholino-Lösung visualisiert werden können, hilft die Lokalisierung der Injektion zu dem Blastem. Etwa 75 nl (10-15 Klicks) von Morpholino-Lösung sollte pro knöchernen ray injiziert werden. ~ 1 Sek. Pause zwischen zwei Klicks. Wir injizieren nur die Rückenseite, mit dem ventralen wie Elektroporation, nur Kontrolle. Alternativ könnte man wiederholen Sie diese ganze Prozedur mit einem Morpholino Kontrolle auf der ventralen Hälfte der Flosse. </li></ol> 4. Die Elektroporation der Morpholino <ol><li> Unmittelbar nach der Injektion der Morpholino, entfernen Sie die Injektion Platte aus dem Mikro-Injektionsgeräts. Füllen Sie die Injektion Platte gut mit der Anästhesie-Lösung, bis der Fisch unter Wasser. Die Elektroporation wird unter der Wasserlinie durchgeführt. </li> &lt;li&gt; Ein 3 mm Durchmesser Platinplatte Pinzette Elektrode (650-P3 CUY Pinzette, Protech International) lokalisiert die Impulse, um etwa die Hälfte der Flosse. Achten Sie darauf, die Elektroden an der Flosse Gewebe berühren. Um sicherzustellen, dass die Elektroden nicht berühren fin Gewebe, drehen Sie den Fisch auf seiner dorsalen Seite und schauen Sie geradeaus auf der Mittellinie für die Elektroporation. </li><li> Elektroporieren sowohl die dorsalen und ventralen Seiten der Finne mit einem CUY21 Square Wave Electroporator (Protech International, Inc.) (für eine nicht-spezifische Effekte zu steuern Elektroporation). Wischen Sie die Elektroden mit einem feuchten Kimwipe nach jeder Elektroporation, um alle Blasen, die sich gebildet haben können, zu entfernen. Wenn sie nicht entfernt werden, ein Mini-Ladung aufbaut, die anzieht das Gewebe in Richtung der Elektrode. Die Elektroporation Parameter sollten auf zehn aufeinander folgenden Pulsen von 50 ms eingestellt werden, bei 15 V mit einer 1 sec Pause zwischen den Impulsen. </li><li> Den Fisch auf einen Objektträger oder eine Petrischale und schnell Bild der Flosse, und achten Sie auf note der dorsal / ventral Orientierung. Dieses Bild wird für das Nachwachsen Analyse am nächsten Tag verwendet werden. Bringen Sie den Fisch in den Tank. </li></ol> 5. Analyse <ol><li> Wenn das Zielprotein, die in Expression wurde geklopft für die richtige Finne Regeneration erforderlich ist, sollte ein dramatischer Unterschied zwischen den dorsalen und ventralen Hälften der Flosse klar sein, 1 Tag nach der Elektroporation (Abbildung 5B). </li><li> Bei 3 dpa, nehmen Sie ein anderes Bild von der Flosse eines jeden Fisch und die Zuordnung dieses Bild mit den entsprechenden 2 dpa-Bild (Abbildung 5B). Die natürlichen Schwankungen in der Seitenflosse Pigmentierung Muster zwischen Tieren können Sie korrekt zu identifizieren einzelnen Fische. </li><li> Mit NIH Image, verfolgen Sie die 2 und 3 dpa dpa Bereiche sowohl der dorsalen und ventralen Hälften (5B). </li><li> Um% Bereich des dorsalen gegen die ventrale Verwendung folgender Formel bestimmen: (- Dorsal Dorsal 2dpa 3DPA) / (Ventrale 3DPA -<html> Ventrale 2dpa) x 100 =%-Bereich </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse <ol><li> Wir haben immer Assay zur Flosse Auswuchs bei 3 dpa, oder 24 HPE (Stunden nach der Elektroporation). Zu diesem Zeitpunkt sollte die Fluorescein-markiertem Morpholino vorhanden sein in der dorsalen Hälfte der Lamelle (Supplemental 1 und 6A). Es ist normal, um zu sehen, einige nachgestellte bis auf die Ebene der Amputation. </li><li> Es sollte kein Unterschied zwischen den dorsalen und ventralen Seiten in der Seitenflosse injiziert und durch Elektroporation mit der Steuerung Morpholinos (6B) sein. </li><li> Wenn die experimentellen Morpholino zielt ein essentielles Protein für Flosse Auswuchs, sollte ein dramatischer Unterschied zwischen den dorsalen und ventralen Seiten beobachtet werden (Abbildung 6c). </li><li> Wenn die Elektrode berührt die Flosse bei der Elektroporation, wird das Gewebe erscheinen braun (fast in Erscheinung verbrannt) und nekrotisch. </li></ol>&quot;Src =&quot; / files/ftp_upload/3632/3632fig1.jpg &quot;/&gt; Abbildung 1. Schematische Darstellung der verschiedenen Ereignisse, die während fin Regeneration auftreten. Die zugrunde liegenden Zeiten für jedes Ereignis in Stunden nach der Amputation (HPA) angegeben und entsprechen einem Tank Temperatur von 33 ° C. <img alt="2" src="/files/ftp_upload/3632/3632fig2.jpg" /> Abbildung 2. A. Schematische Darstellung der Einspritzplatte, die aus Agarose hergestellt ist und enthält eine kleine, gut, um den Fisch während des Mikroinjektion Morpholino halten. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3632/3632fig3.jpg" /> Abbildung 3. Schematische Darstellung der Morpholino Mikroinjektion. A. Legen Sie den Fisch in die Schüssel mit dem Kopf des Fisches in der Kerbe ausgeschnitten des Brunnens, die helfen, die Fische bleiben stabil wird. B. Bei geringer Vergrößerung, ordnen Sie die Nadel, so dass es ist in der Nähe des regenerierende Gewebe der Rippe. C </strong&gt; Bei höherer Vergrößerung, spritzen sie den Morpholino distalen jedem knochigen Fin Ray (dh in jedem Blastem). Die Nadel sollte in das Gewebe direkt distal des knöchernen ray (1), und dann weiter zu dem Ort des Blastem (2). Hinweis: Die grünen Punkte im Schaltplan sind nur dazu gedacht, um den Ort der Injektion zu zeigen. Der Morpholino kann kurz visualisiert werden als grün / gelb &quot;puff&quot; nach jeder Injektion, jedoch ist diese nicht fortbestehen wie in der schematischen gezeigt. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/3632/3632fig4.jpg" /> Abbildung 4. Schematische Darstellung der Finne Elektroporation. A. Nach Mikroinjektion, legen Sie den Fisch in einer Petrischale voller Anästhesie und elektroporieren sowohl die dorsale und ventrale Hälften. B. Achten Sie darauf, nicht berühren fin Gewebe. Die Elektroden sollten ~ 1 mm von dem Gewebe platziert werden. <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/3632/3632fig5.jpg" /> <strong&gt; Abbildung 5. Schematische Darstellung der Methoden zur Flosse Auswuchs Hemmung zu berechnen. A. Nehmen Sie ein Bild von der Flosse eines jeden Fisch bei 2 dpa, entweder unmittelbar vor oder nach Morpholino-Injektion und Elektroporation. Verfolgen Sie die regenerierbaren Gewebes sowohl der dorsale (grün) und ventralen (blau) Hälften der Flosse mit NIH Image, (schwarz gestrichelte Linien). B. Bei 3 dpa, nehmen Sie ein anderes Bild von jeder Rippe und wieder verfolgen die dorsalen und ventralen Bereichen von Nachwachsen mit NIH Image. C. Subtrahieren Sie die Fläche des erneuten Wachstums bei 2 dpa vom Gesamtbetrag Nachwachsen bei 3 dpa sowohl für die dorsalen und ventralen haves. Der Bereich der dorsalen Prozent gegenüber ventralen Nachwachsen kann mit folgender Formel berechnet werden: ((D 3DPA - D 2 dpa) / (V 3DPA - V 2dpa)) x 100. Prozent Hemmung = 100 - Prozent Area. <img alt="6" src="/files/ftp_upload/3632/3632fig6.jpg" /> 6. Beispiele für erwarteteErgebnisse. A. Fluoreszenzbild, die eine Fluorescein-markierten Kontroll-Mor in der dorsalen Hälfte der Rippe, 24 Stunden nach der Elektroporation (HPE). B. Hellfeldaufnahme einer Rippe, die injiziert und wurde durch Elektroporation mit einem Kontroll-Mor in der dorsalen Hälfte . Das Bild zeigt gleich das Nachwachsen der beiden dorsalen und ventralen Hälften einer Flosse, 24 HPE. C. Hellfeldaufnahme einer Flosse, die injiziert und mit einem experimentellen Morpholino in der dorsalen Hälfte wurde elektroporiert. Das Bild zeigt die Hemmung des erneuten Wachstums auf der dorsalen / injizierte Seite. Die Linie zeigt die Menge an Nachwachsen bei 2 dpa, unmittelbar vor der Morpholino-Injektion und Elektroporation. <img alt="7" src="/files/ftp_upload/3632/3632fig7.jpg" /> Abbildung 7. Schematische Darstellung einer alternativen Injektion und Elektroporation Verfahren zur Target-Proteine ​​bei der Wundheilung und Blastembildung beteiligt. A. Spritzen Sie die Morpholinozwischen den einzelnen knöchernen Fin Ray auf der dorsalen Hälfte der Flosse. B. elektroporieren die Morpholino wie normal. C. amputieren die Flosse unmittelbar proximal (~ 1 knöchernen Segment) an der Injektionsstelle. D. Die Fluorescein-markierten Morpholino beobachtet werden kann Wunde in Epithel und Blastem bei 24 HPE. <img alt="8" src="/files/ftp_upload/3632/3632fig8.jpg" /> Abbildung 8. Mit der Technik zur Wunde Epithel und Blastembildung zielen. A. Hellfeldaufnahme einer Flosse bei 24 hPa, die injiziert und wurde durch Elektroporation mit einer Kontrollgruppe Morpholino unmittelbar vor der Amputation. B. Fluoreszenzbild von Flosse in Panel A. Hinweis gezeigt dass das injizierte dorsalen Hälfte der Flosse zeigt eine gute Aufnahme der Morpholino in der regenerierbaren Gewebes. C -. C &quot;Höhere Vergrößerung des dorsalen Hälfte der Flosse in Panels gezeigt A und B. Die Injektionsstellen sind oft noch sichtbar (Pfeilspitzen), Aber viele Zielzellen migriert haben, um in Epithel und Wunde Blastembildung (Pfeil) zu beteiligen. <img alt="Abbildung 9" src="/files/ftp_upload/3632/3632fig9.jpg" /> Abbildung 9. Mit der Technik, um Zellen, die das Blastem. A. Fluoreszenz und Hellfeld eingefügten Bilder zeigen eine Flosse injiziert und elektroporiert mit Morpholino sowohl auf der dorsalen und ventralen Hälften bilden die Migration anzusprechen. Der Finne wurde dann bei zwei Ebenen amputiert. Die dorsale Hälfte reduziert wurde unmittelbar distal der Injektionsstelle, wo, wie das ventrale Hälfte 9-10 knöchernen Segmenten distal der Injektionsstelle wurde geschnitten. B. Bei 24 hPa, zeigen die Fluoreszenz-und Hellfeld eingefügten Bilder, die Morpholino wurde zum dorsalen migriert regenerieren (1), aber nicht die ventrale regenerieren (2), was anzeigt, dass nur die Zelle unmittelbar proximal zu dem Schnitt Seite auf Blastembildung teilnehmen. Die beiden weißen Pfeile zeigen den Pegel jedes AmputationEbene. Panels mit 1 und 2 auf der rechten Seite des Bildes zeigen eine höhere Vergrößerung Blick auf die dorsale und ventrale Hälften der Flosse, beziehungsweise. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3632/Suppl_Fig1_JoVE.mov">Zusätzliche 1.</a> Ein Video eines konfokalen z-Stapel einem Bereich entsprechend der Position eines Blastem einer Rippe injiziert und mit einer Steuerung elektroporiert Morpholino ist. Das Bild wurde bei 24 HPE übernommen. Da eine einzelne Fluoresceinmoleküls nicht visualisiert werden können, können nicht alle der Morpholino visualisiert oder quantifiziert. Allerdings geben diese Bilder einen Eindruck von den verschiedenen Graden der Aufnahme, die sichtbar gemacht werden kann in den Zellen, aus einzelnen punktförmigen Punkte, um ganze Zellen voll von fluoreszierenden Morpholino. Auf dem Standbild, wird die Orientierung gezeigt. Maßstab: 25 Mikron.

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</ol>

Wir haben nichts zu offenbaren.

Hier beschreiben wir eine leistungsstarke loss-of-function-Ansatz bedingt Knockdown Proteine ​​von Interesse während der Finne Regeneration in adulten Zebrafisch. Diese Technik wurde verwendet, um Gene zu studieren Gap Junction-, Signal-Rezeptoren, Transkriptionsfaktoren, und microRNAs während regenerative fin Auswuchs 16, 20-22. Wir erwarten, dass diese Technik auch verwendet werden, um Gene für die Wundheilung und Blastembildung durch Anpassung der Technik erforderlich zu untersuchen. Zum Beispiel, injizierten wir elektroporiert und eine Kontrolle Morpholino in den Raum zwischen den knöchernen Flossenstrahlen auf der dorsalen Hälfte der Finne vor der Amputation (Abbildung 7). Wir haben dann die Flosse unmittelbar distal der Injektion Flugzeug amputiert. 24 hPa, beobachteten wir, dass die Morpholino-Zielzellen hatte distal, um sowohl die Wunde Epithel und Blastem (Abbildung 8) bilden migriert, was darauf hinweist, dass die Zellen während dieser frühen Phasen der Regeneration kann auch TargETED. Die Technik hat ein paar bemerkenswerte Einschränkungen. Zum Beispiel ist die Fluoreszenz von Fluorescein-nicht beibehalten folgenden Fixierung und Verarbeitung für die Immunhistochemie, die es unmöglich, eine bestimmte zelluläre Phänotyp (dh Zell-Proliferation) mit der Menge an Morpholino in einer Zelle korreliert ist. Darüber hinaus ist es nicht gelungen, dauerhaft die Elektroporation von Plasmiden in der Regeneration Heckflosse, obwohl eine vorherige Gruppe auch taten die erfolgreiche Elektroporation von DNA in Flossengewebes 23. Schließlich haben wir festgestellt, dass die Morpholino nur wirksam für ~ 48 Stunden nach der Elektroporation 21, die mit dieser Technik in seiner jetzigen Form für die Prüfung Gene bei der Differenzierung von neuen Zelltypen beteiligt ist untersagt. Zusätzliche Tests und Modifikation des Verfahrens, kann überwunden werden diese aktuellen Einschränkungen. Darüber hinaus ist es möglich, dass diese Technik verwendet werden könntenan Proteine ​​der Zellwanderung vom darunter liegenden Gewebe zum Blastem beteiligt zu testen. Zum Beispiel, injizierten wir und Elektroporation ein Steuersignal Morpholino in beide Seiten der Rippe (wie in 7 beschrieben) vor der Amputation. Wir haben dann die dorsale Hälfte der Finne unmittelbar distal der Injektion Flugzeug amputiert und wir amputiert die Bauchflosse viel mehr distal. Bei 24 hPa, hatten die Morpholino-positive Zellen auf der Rückenseite von der Injektionsstelle, um die darüber liegende Epithel und Wunde Blastem migriert. Das war jedoch nicht der Fall ist auf der Bauchseite (Abbildung 9). Dies stützt die Idee, dass nur die Zellen, die die Amputation Ebene zugrunde liegen, in der regenerative Reaktion teilnehmen. Diese Daten legen nahe, dass auch Proteine ​​für die Hypothese aufgestellt, um die Zellwanderung erforderlich getestet werden konnte mit Hilfe dieser Technik werden.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> CUY21-Edit oder CUY21-SC Rechtecksignal Elektroporator </td><td> Protech International </td><td> CUY21EDIT oder CUY21SC </td><td> Beide Geräte arbeiten nach diesem Protokoll </td></tr><tr><td> 3 mm Durchmesser Paddle-Elektroden </td><td> Protech International </td><td> CUY 650-P3 </td><td></td></tr><tr><td> Morpholino </td><td> GeneTools, LLC </td><td></td><td> Morpholino sollte kundenspezifisch angefertigt, um Ihre Protein von Interesse sein </td></tr><tr><td> 2-Phenoxyethanol </td><td> Sigma </td><td> 77.861-1L </td><td> Anästhesie; verdünnten 1:1000 in Fisch System Wasser für Verfahren, 1:500 für Sterbehilfe </td></tr><tr><td> Micro-injectian der Pumpe </td><td> World Precision Instruments </td><td> PV830 Pneumatische PicoPump </td><td> Viele verschiedene Systeme Mikroinjektion verwendet werden könnten </td></tr><tr><td> Micro-Manipulator </td><td> World Precision Instruments </td><td> MMJR </td><td> Rechtshänder (MMJL für Linkshänder) </td></tr><tr><td> Micro-Injektionsnadeln, 1,0 mm Außendurchmesser </td><td> World Precision Instruments </td><td> 1B100F-4 </td><td> Dies sind Borosilikatglas Kapillaren, in eine Nadel gezogen </td></tr><tr><td> Nadelhalter </td><td> World Precision Instruments </td><td> 5430-ALL </td><td> Pico Düsensatz, stellen Sie sicher, Inset der Pipette 1,0 mm Dichtung </td></tr><tr><td> Nadel-Abzieher </td><td> Sutter </td><td> P-97 </td><td> Andere Mikropipette / Nadel Abzieher sollte auch funktionieren </td></tr><tr><td> Mikroskop </td><td> Leica, Nikon, Zeiss </td><td> Anzahl variiert je nach Hersteller </td><td> Jede Stereomikroskop mit 20X-Optik und die Fähigkeit, mit Mikromanipulatoren arbeiten </td></tr></tbody></table>

in-vivo-elektroporation von morpholinos in das regenerations adult zebrafisch leitwerk

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

Bestimmte Arten von Urodelen und Knochenfische regenerieren kann ihren Geweben. Zebrafisch haben zu einem weit verbreiteten Modell, um die spontane Regeneration der adulten Geweben wie Herz 1, Retina 2, Rückenmark 3, Sehnerv 4, sensorischer Haarzellen 5 und Rippen 6 zu untersuchen. Der Zebrafisch Rippe ist eine relativ einfache Ansatz, die leicht manipuliert wird, um mehrere Stufen in epimorphe Regeneration zu studieren. Wundheilung, Blastembildung und Flosse Auswuchs: Klassischerweise wurde fin Regeneration durch drei Phasen gekennzeichnet. Nach Amputation Teil der Flosse, wuchert das umgebende Epithel und wandert über die Wunde. Bei 33 ° C, tritt dieser Prozess innerhalb von sechs Stunden nach der Amputation (hPa, 1B) 6,7. Als nächstes zugrunde liegenden Zellen aus verschiedenen Linien (z. B. Knochen, Blut, Gliazellen, Fibroblasten) Wiedereinstieg in den Zellzyklus zu einem proliferativen Blastem, während die darüber liegende Epidermis weiter zu vermehren (1D) 8. Auswuchs tritt als Zellen proximal zu dem Blastem in ihre jeweiligen Linien neu zu differenzieren, um neues Gewebe (1E) 8 zu bilden. Abhängig von der Höhe der Amputation, wird die volle Regeneration in einer Woche bis zu einem Monat abgeschlossen. Die Expression einer großen Anzahl von Gen-Familien, darunter wnt, Hox-, FGF, MSX, Retinsäure, sch, Kerbe, BMP und Aktivin A-beta-Gene, ist hochreguliert während bestimmter Phasen der Regeneration fin 16.09. Allerdings haben die Rolle dieser Gene und ihren codierten Proteinen während der Regeneration schwierig zu beurteilen, wenn ein spezifischer Inhibitor für das Protein existiert 13, eine temperaturempfindliche Mutante besteht, oder ein transgenes Tier (entweder Überexpression des Wildtyp-Proteins oder eine dominant -negatives Protein) wurde 7,12 erzeugt. Wir entwiped ein Reverse genetische Technik, um schnell und einfach testen Sie die Funktion eines Gens während der Finne Regeneration. Morpholino-Oligonukleotide werden häufig verwendet, um den Verlust von spezifischen Proteinen während der Zebrafisch, Xenopus, Huhn und Maus Entwicklung 17-19 studieren. Morpholinos Basenpaar mit einem komplementären RNA-Sequenz entweder Block-prä-mRNA-Splicing oder mRNA-Translation. Wir beschreiben ein Verfahren zur effizienten Einführung Fluorescein-markierten Antisense-Morpholino in Regenerieren Zebrafisch Rippen den Zuschlag Expression des Zielproteins. Der Morpholino wird in jede Blastem der regenerierenden Zebrafisch Schwanzflosse Mikro-Injektion und Elektroporation in die umliegenden Zellen. Fluorescein liefert die Ladung zu den Morpholino elektroporieren und die Morpholino im Flossengewebes visualisieren. Dieses Protokoll erlaubt bedingten Protein Knockdown, um die Rolle von spezifischen Proteinen während der regenerativen fin Auswuchs zu untersuchen. In der Discussion beschreiben wir, wie dieser Ansatz angepasst werden, um die Rolle von spezifischen Proteinen während der Wundheilung oder Blastembildung, sowie ein potentieller Marker für Zellmigration in Blastembildung zu untersuchen.

Wir beschreiben ein Verfahren zur bedingten Knockdown die Expression eines Zielproteins im Erwachsenenalter Zebrafisch Flossenregeneration. Diese Technik beinhaltet Mikrospritzvorrichtung und Elektroporation Antisense-Oligonukleotid in Morpholinos Flossengewebes das Testen des Proteins Rolle in verschiedenen Stadien der Flossenregeneration, einschließlich Wundheilung, Blastembildung und regenerative Auswachsen ermöglicht.

In-vivo-Elektroporation von Morpholinos in das Regenerations Adult Zebrafisch Leitwerk

Bestimmte Arten von Urodelen und Teleostei können ihr Gewebe regenerieren. Zebrafische sind zu einem weit verbreiteten Modell geworden, um die spontane Regeneration zu untersuchen ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Expression eines spezifischen Proteins in der regenerierenden Schwanzflosse des adulten Zebrafisches zu hemmen oder herunterzuregulieren. Dies wird erreicht, indem zunächst die Schwanzflosse amputiert und eine geringe Menge an Gewebe zur Regeneration zugelassen wird. Anschließend wird Morpholino-Lösung in jede Blase der einen Flossenhälfte mikroinjiziert.Der Morph-Phänotyp wird anschließend in die Zellen der Blase elektroporiert, und die andere Hälfte der Flosse dient aus Kontrollgründen ebenfalls der Elektroporation. Schließlich wird der Einfluss einer verminderten Expression des Zielproteins auf das regenerative Wachstum analysiert. Letztendlich zeigen die Ergebnisse eine Hemmung der Geweberegeneration durch vergleichende Analyse des regenerativen Wachstums der injizierten und nicht injizierten Hälften der Flosse.Die Implikationen dieser Technik reichen bis in die Therapie der Wundheilung und regenerative Medizin, da sie das Potenzial besitzt, Gene und Signalwege aufzudecken, die für die Gewebebildung unerlässlich sind. Um fluoresceinmarkiertes Morino herzustellen, lösen Sie 300 Nanomol in 100 Mikroliter nukleasefreiem Wasser. Um eine ungefähr dreimillimolare Lösung herzustellen, portionieren Sie die Lösung in mehrere mit Paraffin versiegelte Mikrozentrifugenröhrchen und lagern Sie diese bei Raumtemperatur, geschützt vor Licht. Um die exakte Morfo-Konzentration zu bestimmen, siehe den schriftlichen Protokolltext für Details.Betäuben Sie ausgewachsene Zebrafische entweder mit Trica oder zwei Phenoxyethanol bei einer Konzentration von einem Milligramm pro Milliliter in Beckenwasser. Sobald der Fisch vollständig betäubt ist, legen Sie ihn auf den sauberen Deckel einer Petrischale und amputieren mit einem sterilen Skalpell oder einer sterilen Rasierklinge die Flosse proximal zum ersten Lipidtrachealverzweigungspunkt. Es ist wichtig, die Flosse exakt senkrecht zur anterioren-posterioren Ebene des Tieres zu schneiden, da schräge Schnitte zu einer ungleichmäßigen Regeneration der dorsalen und ventralen Flossenanteile führen. Bringen Sie den Fisch anschließend zurück in das Becken und halten Sie ihn bei 33 Grad Celsius, um die Regenerationsrate je nach experimentellem Design zu erhöhen.Null bis zwei Tage nach der Amputation für die Flossenregeneration. Um vor der Einführung des Morpholinos zu beginnen, stellen Sie am Tag vor der Morpholino-Injektion eine Injektionsplatte mit 2 % Agarose her, die an einem Ende der Vertiefung eine ausgeschnittene Kerbe aufweist, um den Fisch während des Injektionsvorgangs zu stabilisieren. Unmittelbar vor der Injektion verdünnen Sie das mit Fluorescein markierte Morpholino sowie die RNAs und DNAs in wasserfreiem Wasser auf die richtige Konzentration und inkubieren die Lösung in einem Wasserbad bei 65 Grad Celsius.Laden Sie fünf Minuten lang eine zuvor vorbereitete Injektionsnadel auf und schneiden Sie die Spitze schräg ab. Betäuben Sie anschließend den Fisch und legen Sie ihn auf die Injektionsplatte. Entfernen Sie alle überschüssige Flüssigkeit und stellen Sie die Platte auf den Tisch eines Stereomikroskops.Orientieren Sie die Nadel direkt distal zur knöchernen Strahlung. Führen Sie die Nadel vorsichtig in das regenerative Gewebe unmittelbar distal zu jedem knöchernen Strahl ein und schieben Sie sie distal vor, bis sie in der Blastemregion positioniert ist. Wenn die Nadel korrekt lokalisiert ist, befolgen Sie die Anweisungen des Mikroinjektionssystems und injizieren Sie pro Injektion einen Tropfen von fünf Nanoliter der Morpholino-Lösung.Bei jeder Injektion ist ein gelber Wölkchen der Morpho-Lösung sichtbar, das dabei hilft, die Injektion an der Blastemregion entlang der Mittellinie dorsalwärts zu lokalisieren. Injizieren Sie etwa 75 Nanoliter Morpho pro Knochenstrahl auf der dorsalen Seite und lassen Sie die ventrale Seite als Elektroporationskontrolle, unmittelbar nach der Morpho-Injektion. Entfernen Sie die Injektionsplatte vom Mikroinjektionsapparat.Füllen Sie die Vertiefung der Injektionsplatte mit der Anästhesielösung, bis der Fisch vollständig bedeckt ist. Um sicherzustellen, dass die elektroporierten Elektroden das Flossengewebe nicht berühren, drehen Sie den Fisch auf die dorsale Seite und blicken Sie senkrecht entlang der Körpermitte für die Elektroporation. Stellen Sie die Elektroporationsparameter auf 10 aufeinanderfolgende Impulse von jeweils 50 Millisekunden bei 15 Volt ein, mit einer Pause von einer Sekunde zwischen den Impulsen, unter Verwendung von Platin-Platten-Elektroden in Form von Pinzetten mit einem Durchmesser von drei Millimetern, die eng beieinander, aber ohne Berührung platziert werden.Die Flossen wurden sowohl an der dorsalen als auch an der ventralen Seite elektroporiert, um eine Ladungsansammlung durch eventuell entstehende Blasen zu verhindern. Wischen Sie die Elektroden nach jeder Elektroporation mit einem angefeuchteten Kimmtuch ab. Legen Sie den Fisch schließlich auf einen Objektträger oder eine Petrischale und nehmen Sie schnellstmöglich ein Bild der Flosse auf, wobei darauf zu achten ist, dass die dorsoventrale Orientierung vermerkt wird.Dieses Bild wird am folgenden Tag für die Regenerationsanalyse verwendet. Bringen Sie den Fisch zurück in den Behälter, falls das Zielprotein für eine ordnungsgemäße Flossenregeneration erforderlich ist. Ein deutlicher Unterschied zwischen der dorsalen und ventralen Hälfte der Flosse sollte einen Tag nach der Elektroporation oder drei Tage nach der Amputation sichtbar sein.Machen Sie ein weiteres Bild der Flosse und vergleichen Sie diese Aufnahme mit einem entsprechenden Bild vom zwei Tage nach der Amputation, das nach der Elektroporation aufgenommen wurde. Verwenden Sie NIH Image, um die Bereiche zwei und drei Tage nach der Amputation sowohl für die dorsale als auch für die ventrale Hälfte nachzuverfolgen. Um den prozentualen Anteil des dorsalen gegenüber dem ventralen Flossenwachstum zu bestimmen, verwenden Sie die folgende Formel.Die Menge dorsal drei Tage nach Amputation minus dorsal zwei Tage nach Amputation, dividiert durch die Menge ventral drei Tage nach Amputation minus ventral zwei Tage nach Amputation, multipliziert mit 100, ergibt den prozentualen Flächenanteil. Bei der Untersuchung des Finsauswuchses drei Tage nach Amputation oder 24 Stunden nach Elektroporation sollte das mit Fluorescein markierte Morino in der dorsalen Hälfte der Flosse nachweisbar sein. Es ist normal, dass sich etwas Signal bis auf die Höhe der Amputationsebene erstreckt.Wenn ein Kontroll-Morpholino in die dorsale Hälfte der Flosse 24 Stunden nach der Elektroporation injiziert wird, ist ein gleichmäßiges Wachstum im Vergleich zur ventralen Seite zu beobachten, wie hier gezeigt. Die Injektion der dorsalen Flossenhälfte mit einem experimentellen Morpholino hemmt das Nachwachsen auf dieser Seite. Nach diesem Verfahren.Andere Methoden wie Immunhistochemie, C-zwei-Hybridisierung, Echtzeit-PCR und Immunsouthern können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise, welche genetischen Signalwege für die Regeneration erforderlich sind.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Eine Methode, um Morpholinos direkt liefern in der Zebrafisch otocyst bei 24hpf entwickelt worden. Mit Mikroinjektion von Morpholinos in das Lumen des otic Vesikel und Elektroporation, um das Eindringen Effekt, konnten wir die Wirkung von Morpholinos auf das Gehirn zu umgehen und erhalten Wirkungen, die spezifisch an das Innenohr.

Direkte Lieferung von MIF Morpholinos Into the Zebrafisch Otocyst durch Injektion und Elektroporation Beeinflusst Inner Ear Entwicklung

Eine Methode, bedingt Knockdown ein Zielprotein Ausdruck in der erwachsenen Zebrafisch Retina beschrieben, das geht intravitreal Injektion antisense Morpholinos und Elektroporation sie in der Netzhaut. Das resultierende Protein ist für mehrere Tage, die Prüfung des Proteins Rolle bei der Regeneration oder intakten Netzhaut ermöglicht klopfte.

In-vivo-Elektroporation von Morpholinos in die Adult Zebrafisch Retina

Das Protokoll beschreibt den gezielten Knockdown der Genexpression im Zebrafisch durch Morpholino-Injektion in den Schwanz.

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In diesem Artikel zeigen wir ein Verfahren zur Manipulation der Genexpression in den Zellen des ventrikulären erwachsenen Zebrafisch telencephalon Verwendung von Antisense-Morpholino-Oligonukleotide. Wir präsentieren diese Methode als eine effiziente und schnelle Protokoll, das für funktionelle Studien in der erwachsenen Gehirn von Wirbeltieren eingesetzt werden können.

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Lernen Sie die In-vivo-Elektroporation von Morpholinos zur gezielten Protein-Knockdown im regenerierenden Schwanzflossengewebe von Danio rerio. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung essenzieller Gene für die Geweberegeneration.

In-vivo-Elektroporation von Morpholinos in das Regenerations Adult Zebrafisch Leitwerk

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