Speichel, Speicheldrüse, und Hämolymphe Abholung Ixodes scapularis Zecken

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Zecken, Blut, Lymphdrüsen und Speichel von aktiv fütternden ex ODI scapularis Zecken zu sammeln. Dies wird erreicht, indem zuerst das Bein der Zecke am distalen Gelenk amputiert wird, um die Hämoschlaffe auszustoßen. Als nächstes werden Speicheldrüsen entnommen, indem die Zecke in phosphatgepufferter Kochsalzlösung präpariert, die Speicheldrüsen lokalisiert und in einen sauberen PBS-Pool überführt werden.

Der Speichel wird gesammelt, indem Pilocarpin auf die Zecken im Rücken der Mikropipette aufgetragen wird, das Ome der Zecke in ein gepooltes Kapillarröhrchen eingeführt wird und die Zecke in das Röhrchen speicheln kann. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die zeigen, dass Mikroorganismen in der Hämolymphe oder den Speicheldrüsen über Immunfluoreszenz oder Protein vorhanden sind. Proteininteraktionen mit Speichelproteinen und anderen Ergebnissen.

Im Allgemeinen werden Personen, die neu in der Hämolymphe sind, Schwierigkeiten haben, da es schwierig ist, die Zecke zu immobilisieren, ohne den Mitteldarm zu reißen und dadurch die Hämolymphe zu kontaminieren. Im Allgemeinen können Menschen Schwierigkeiten mit der Speichelsammlung haben, da nicht alle Zecken speicheln. Daher ist es wichtig, zu versuchen, Speichel von Zecken zu sammeln, die sich kurz vor der Erschöpfung befinden.

Im Allgemeinen werden Personen, die neu in der Speicheldrüsensammlung sind, Schwierigkeiten haben, da die Speicheldrüsen unter den Zeckenresten schwer zu lokalisieren sind. Und wenn diese Speicheldrüsen einmal lokalisiert sind, können sie während der Waschschritte leicht platzen und verloren gehen. Nachdem Sie aktiv fressende Zecken vorsichtig von einem tierischen Wirt entfernt haben, legen Sie sie fünf Minuten lang in 3%iges topisches Wasserstoffperoxid.

Übertragen Sie die Zecken für 10 Minuten auf 70%iges Ethanol an die Oberfläche und sterilisieren Sie sie. Entfernen Sie die Zecken von 70%igem Ethanol, indem Sie sie mit einem Pap-Stift auf Gallenpapier gießen. Zeichnen Sie einen Kreis auf ein vernünftiges beschichtetes Mikroskop.

Schieben Sie eine Zecke und platzieren Sie sie innerhalb des Pat-Pen-Kreises unter einem Präpariermikroskop. Drücke mit einer Pinzette sanft auf den Rücken der Zecke. Zeige die Beine der Zecke und mache sie bewegungsunfähig.

Amputieren Sie dann mit einem Einwegskalpell mit feiner Spitze das Bein oder die Beine der Zecke am distalen Gelenk. Nachdem das Bein oder die Beine geschnitten wurden, üben Sie weiterhin Druck auf den Rücken der Zecke aus, damit die Häma-Lymphe aus den Beinen austritt. Auf die Rutsche.

Bewegen Sie die Zecke vorsichtig auf dem Objektträger, um die Häma-Lymphe zu verteilen und die Speicheldrüsen von einem Zeckenfleck zu entfernen. Mehrere 25 Mikroliter Züge phosphatgepufferte Kochsalzlösung auf ein Mikroskop. Schieben Sie eine Zecke und platzieren Sie sie in eines der PBS-Becken unter dem Präpariermikroskop.

Verwende eine Pinzette mit feiner Spitze, um die Zecke zu stabilisieren, indem du die Mundwerkzeuge oder die Rückseite der Zecke festhältst. Führen Sie die feine Pinzette in die Rückseite der Zecke ein und schneiden Sie den Rücken der Zecke auf, um die Organe freizulegen. Finde das Paar Speicheldrüsen, das sich beidseitig neben den Beinen der Zecke befindet.

Wenn die Drüsen unter den Zeckenresten nicht sichtbar sind, bringen Sie den Hauptzeckenteil, der noch die Drüsen enthält, in ein frisches PBS-Pool, um die Störung und den Verlust der Speicheldrüsen mit einer feinen Pinzette zu reduzieren. Entferne die Speicheldrüsen von der Zecke und lege sie in ein frisches PBS-Pool. Übertragen Sie die Drüsen in einen anderen sauberen 25-Mikroliter-PBS-Pool und wiederholen Sie diese Wäsche vorsichtig.

Gehen Sie weitere drei bis vier Schritte vor, um äußere Mikroorganismen und Zeckenreste zu entfernen. Legen Sie die Drüsen in ein sauberes Becken mit PBS auf einem vernünftigen, beschichteten Objektträger. Nachdem Sie eine fast angeschwollene Zecke von einem tierischen Wirt entfernt haben, kleben Sie sie an ein Ende eines Glasobjektträgers.

Das Klebeband sollte etwa zu drei Vierteln nach oben gelegt werden. Der Rücken der Zecke zum Kopf hin, wobei die Mundwerkzeuge der Zecke an der Stelle, an der das Klebeband auf den vorderen Rand der Rückenfläche der Zecke trifft, freiliegend bleiben: Pipette von fünf Mikrolitern Pilocarpinlösung. Lassen Sie das Klebeband das Pilocarpin über den Rücken der Zecke leiten, ohne dass das Pilocarpin mit den Mundwerkzeugen der Zecke in Berührung kommt.

Legen Sie ein Stück ungiftige Modelliermasse auf das Mikroskop. Schiebe mit einer Pinzette mit feiner Spitze etwa einen Zentimeter von den Mundwerkzeugen der Zecke weg. Brechen Sie die Spitze eines gezogenen Kapillarrohres auf den gewünschten Durchmesser ab.

Während Sie die Zecke unter einem Präpariermikroskop betrachten, setzen Sie den Hyperstein der Zecke vorsichtig in das Kapillarrohr ein, so dass sich die Pulpa des Oberkiefers entlang der Außenseite des Kapillarrohrs befinden kann. Drücke das gegenüberliegende Ende des Kapillarrohrs in die Modelliermasse, um das Kapillarrohr an Ort und Stelle zu halten. Platzieren Sie als nächstes die montierte speichelbringende Zecke in eine dunkle Kammer mit hoher Luftfeuchtigkeit.

Kippen Sie die Rutsche so, dass der Hyperstein auf den Boden des Behälters zeigt, damit die Schwerkraft das Sammeln des Speichels unterstützen kann. Stellen Sie den Behälter bei Raumtemperatur auf und überwachen Sie die speichelnden Zecken in der ersten Stunde genau. Entfernen Sie das Kapillarrohr aus dem Hyperstein der Zecken und sammeln Sie den Speichel, während er entsteht.

Verwenden Sie einen Nudelpipettenknollen, indem Sie ihn aus den Kapillarröhrchen ausstoßen. Setzen Sie das Kapillarrohr wieder auf den Hyperstein und kontrollieren Sie die Akkumulation stündlich für mindestens vier Stunden und fahren Sie mit dem Sammeln des Speichels fort, während er erzeugt wird. Wenn die Zecken nicht speicheln oder wenn mehr Speichel benötigt wird.

Induzieren Sie den Speichelfluss, indem Sie den Hyperstein mit dem Kapillarrohr massieren. Zum Schluss fügen Sie dem Speichel 0,1 Volumen Proteasehemmer-Cocktail hinzu und lagern Sie ihn bis zur Verwendung bei minus 80 Grad Celsius. Diese Abbildung zeigt ein Beispiel für eine nicht kontaminierte Hämolymphe.

Sobald die Beine amputiert sind, wird eine klare Flüssigkeit abgesondert. Ist der Mitteldarm gerissen, erscheint die Hämolymphe trüb und gilt als kontaminiert, wie hier gezeigt. Hier ist ein konfokales Immunfluoreszenzbild von Speicheldrüsen zu sehen, die mit 10 Mikrogramm pro Milliliter auf Borrelia burgdorferi gefärbt wurden.

Fluoreszierende Isonat-konjugierte Kaninchen-Antib-Burgdorferi-Pfeile kennzeichnen beberg Dre in den Speicheldrüsen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, werden Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie eine vollgestopfte Zecke für Speicheldrüsen zerlegen und Häma-Lymphe sammeln können. Sie werden auch verstehen, wie man Speichel von einer erwachsenen Exo-Scapularis-Hündin sammelt.