Ein Maus-Closed-Brust-Modell von Myokardischämie und Reperfusion

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die Durchführung eines geschlossenen Brustmodells für Zeit, verzögerte Myokardischämie und Reperfusion, um die Modulation der Reperfusionsverletzung und der Entzündungsreaktion durch das chirurgische Trauma selbst zu reduzieren. Dies wird erreicht, indem zunächst eine stumpfe Thorakotomie im linken vierten Interkostalraum durchgeführt wird. Der zweite Schritt besteht darin, eine Ligatur mit einer Okklusionsvorrichtung um die linke vordere absteigende Arterie oder LAD zu legen.

Als nächstes werden die Ligaturenden zu einer Schlaufe verknotet und in das Unterhautgewebe eingesetzt, nachdem der Brustkorb geschlossen wurde und sich die Maus fünf Tage lang erholen konnte. Hängende Gewichte werden verwendet, um eine kontrollierte Ischämie und Reperfusion zu erzeugen, während EKGs aufgezeichnet werden. Letztendlich werden TC-Färbung oder Histologie verwendet, um die Infarktgröße zu zeigen.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie offenen Thoraxmodellen der Myokardischämie und der Reperfusion besteht darin, dass bei dieser Technik die Entzündungsreaktion durch das chirurgische Trauma selbst abgestumpft wird. Nachdem Sie die Sedierung bestätigt haben, beginnen Sie den Eingriff, indem Sie Enthaarungscreme auf den Hals und die linke Brust der Maus auftragen. Wischen Sie die Creme nach einer Minute ab und tragen Sie Povidon-Jod zur lokalen Hautdesinfektion auf.

Injizieren Sie dann Buprenorphin subkutan zur Schmerzlinderung. Verwenden Sie als Nächstes eine kleine Schere, um einen Schnitt in der Mitte der Halshaut zu machen, und stumpfen Sie dann die Drüsen und Muskeln ab, die die Luftröhre bedecken. Schalten Sie dann das Beatmungsgerät ein und stellen Sie die Atemfrequenz auf 105 pro Minute und das Atemzugvolumen auf 200 Mikroliter ein.

Ziehen Sie nun mit einer Pinzette an der Zunge des Tieres und führen Sie dann vorsichtig ein 22-Gauge-Metallrohr in das Maul des Tieres ein. Bestätigen Sie die Intubation durch direkte Visualisierung des Schlauchs in der Luftröhre und durch Bewegung des Brustkorbs. Umgehen Sie schließlich die Induktionsbox, indem Sie auf Abgasschläuche umschalten, um eine Kontamination des Laborraums zu verhindern.

Beginnen Sie mit einem Hautschnitt in der linken Mittelklavikularlinie der intubierten Maus und präparieren Sie dann das Unterhautgewebe stumpf in Richtung Achselhöhle. Identifizieren Sie nun den Rand des Musculus pectoralis major und präparieren Sie ihn dann stumpf vom darunter liegenden Musculus pectoralis minor. Ziehen Sie den Musculus pectoralis minor nach rechts, um einen direkten Blick auf den Brustkorb zu erhalten.

Identifizieren Sie den vierten Interkostalraum und verwenden Sie dann die Spitzen einer Pinzette, um den Interkostalraum stumpf zu durchdringen und zu überspannen, um das Einführen von Retraktoren zu ermöglichen. Stellen Sie die Retraktoren mit Gummibändern ein, die am Operationstisch befestigt sind, bis Sie freie Sicht auf das Herz, einschließlich des linken Orakels, haben. Ziehen Sie dann vorsichtig das Perikard ab, ohne das Herz zu verletzen.

Identifizieren Sie schließlich das LAD, indem Sie das linke Vorhoforakel von der Vorderwand des linken Ventrikels abheben. Beginnen Sie damit, die konische Nadelspitze einer Acht-T-Prolinnaht in eine U-Form zu biegen. Führen Sie dann die Nadel tief genug unter dem LAD durch das Myokard, dass die Nadel nicht durch das Gewebe sichtbar ist.

Schneide nun das Nadelende der Naht ab, so dass an jeder Seite ein Zentimeter Naht sichtbar ist. Weichen Sie ein Stück PE 10-Schlauch mindestens zwei Minuten lang in alkoholischer Desinfektion wie den beiden Propanol ein. Dann wurde ein ein Millimeter langes Rohrstück abgefangen, um ein Euter zu erzeugen.

Zum Schluss fädeln Sie beide Nahtanden durch das Euter. Dann werden mit einer Kult-Nahtnadelführung der Größe drei beide Nahtenden aus dem oberen Interkostalraum herausgeführt. Beginnen Sie mit einer Naht mit sechs Auten Prolene, um sowohl die oberen als auch die unteren Rippen im geöffneten Interkostalraum des Tieres zusammenzubinden.

Bevor Sie dann den Brustkorb schließen, klemmen Sie den Exspirationsschlauch ein, um die Ektase zu öffnen und die Lunge für einige Atemzyklen aufzublasen. Stellen Sie das Tidalvolumen des Ventilators auf 200 Mikroliter ein. Binden Sie nun beide Enden der acht TLAD-Ligaturen zusammen, damit sie eine nächste Verbindung bilden.

Das EKG führt zur Maus. Haken Sie die Gewichte an die achte OTT-Schlaufe und lassen Sie sie vorsichtig hängen. Es sollte innerhalb weniger Herzschläge eine signifikante ST-Erhöhung geben.

Lösen Sie dann die Gewichte und legen Sie die Schlaufe in eine Unterhauttasche. Verschließen der Haut mit sechs einfachen Knotennähten. Lassen Sie die Maus schließlich nach der Extubation unter einer Wärmelampe erholen.

Führen Sie nach fünf Tagen Genesung das Myokardischämie-Protokoll durch, wie im schriftlichen Text beschrieben, am Ende der gewünschten Reperfusionszeit, schneiden Sie die Brusthaut eines anästhesierten intubierten Tieres in der Mittellinie zum Xiphoid. Öffnen Sie dann den Bauch und schneiden Sie das Zwerchfell unterhalb des Brustkorbs durch, wobei Sie den Brustkorb auf beiden Seiten der Mittelklavikularlinie aufschneiden. Fixieren Sie nun die flatternde vordere Brustwand mit der Naht, um einen ungehinderten Zugang zum Herzligatur zu erhalten.

Der LAD ist der kniffligste Teil dieses Verfahrens. Es erfordert Feinmotorik und eine ruhige Hand. Bereiten Sie die achte Nahtschlaufe vorsichtig vor.

Schneiden Sie die Schlaufe ab und binden Sie den Knoten, um den LAD zu ligieren. Injizieren Sie dann 10% Damblau langsam in den linken Vorhof und aspirieren Sie von Zeit zu Zeit. Auch hier färbte sich die Oberfläche des gefährdeten Bereichs blau, was selten vorkommt.

Als nächstes injizieren Sie Kaliumchlorid in den linken Vorhof, verriegeln das Herz in der Diastole für die Beurteilung der gleichen Infarktgröße und schneiden Sie dann das Herz heraus, wobei so viel zusätzliches Herzgewebe wie möglich übrig bleibt, um die Dissektion des Organs zu erleichtern. Waschen Sie das herausgeschnittene Herz in PBS und frieren Sie es dann in Isop Pentan und flüssigem Stickstoff ein. Alternativ können Herzen in einen Gefrierschrank gestellt werden, bis sie leicht eingefroren sind.

Wenn das Herz vollständig eingefroren ist, richten Sie das Gewebe so aus, dass es senkrecht zur Längsachse des Herzens geschnitten wird, und schneiden Sie dann das Gewebe in ein Millimeter große Scheiben. Legen Sie jede Scheibe in eine einzelne Vertiefung einer 96-Well-Platte und inkubieren Sie die Scheiben dann 20 Minuten lang in 1,5 % TTC bei 37 Grad Celsius. Anschließend die Scheiben über Nacht mit 4%Formaldehyd fixieren.

Legen Sie die Scheiben am nächsten Tag auf einen Objektträger und bedecken Sie die Scheiben dann mit einem weiteren Objektträger. Verwenden Sie am Ende jeder Folie einen Millimeter Abstandshalter aus Metall, die die beiden Folien mit Büroklammern zusammenhalten. Nehmen Sie abschließend ein digitales Bild von beiden Seiten jeder Scheibe auf.

Verwenden Sie ein Softwareprogramm wie Image J für die P-Telemetrie, nachdem Sie den Brustkorb eines anästhesierten intubierten Tieres zu beiden Seiten der Mittelklavikularlinie geöffnet haben, wie gerade gezeigt. Entfernen Sie überschüssiges Herzgewebe und stumpf den Thymus, der die Aortenwurzel bedeckt, stumpf. Fassen Sie anschließend mit einer Pinzette die aufsteigende Aorta und schneiden Sie das Herz mit so wenig zusätzlichem Herzgewebe wie möglich heraus.

Waschen und drücken Sie anschließend das Herz vorsichtig in kardioplegischer Lösung und legen Sie das Herz in eine P 35-Schale, die mit weiterer kardioplegischer Lösung gefüllt ist. Füllen Sie eine 24-Gauge-IV-Leitung mit Zinkformel und Fixiermittel, kanülieren Sie nun die aufsteigende Aorta und schneiden Sie dann ein Loch zwischen dem linken Orakel und dem linken Vorhof. Führen Sie einen 26-Gauge-Katheter in den linken Vorhof ein, an dem ein 16 Zentimeter langer Schlauch befestigt ist.

Zum Schluss durchbluten Sie das Herz mit einem Zinkform- und Fixiermittel. Legen Sie das Herz nach 10 Minuten für maximal 24 Stunden bei sieben Grad Celsius in eine mit Fixiermittel gefüllte Tube. In dieser Abbildung werden die Infarktgröße und der prozentuale Anteil der Risikofläche, die entlang der Y-Achse dargestellt werden, für Mäuse verglichen, die sich einer 30-minütigen Ischämie unterzogen haben, gefolgt von einer 120-minütigen Reperfusion, dargestellt durch den schwarzen Balken, mit Mäusen, die sich einer 30-minütigen Ischämie unterzogen haben, gefolgt von drei Zyklen von 20 Sekunden.

Bei jeder Reperfusion und Okklusion oder ischämischen Nachbedingung, die durch den roten Balken dargestellt wird, ist zu beachten, dass es in der Ischämie-Reperfusionsgruppe einen signifikant höheren Prozentsatz an Infarktgröße gibt als bei den IPC-Mäusen. Diese Abbildung zeigt, wie die weißen Infarktbereiche von den roten Risikobereichen und von den blauen nicht verschlossenen Bereichen unterschieden werden können. Hier ist ein repräsentativer Ausschnitt eines weißen Infarktbereichs mit roter TTC-Färbung für lebensfähige Myo-Karte dargestellt.

Es ist zu beachten, dass aufgrund der konischen Form des linken Ventrikels in der Nähe der Spitze die Epimyokardin im rosa und blauen äußeren Bereich, die mit dem Sternchen gekennzeichnet sind, als glatter Bereich erscheinen und für die planimetrische Messung nicht berücksichtigt werden sollten. Am wichtigsten ist, dass scheinoperierte Tiere, die sich allen chirurgischen Eingriffen mit Ausnahme von Ischämie und Reperfusion unterzogen hatten, im Vergleich zu Tieren, die einen Myokardinfarkt erlitten, eine geringe Expression von Zytokin-RNA aufwiesen. Wie in diesem Balken zu sehen ist, exprimieren Tiere, die sich einer 30-minütigen Ischämie und einer 120-minütigen Reperfusion unterzogen haben, signifikante Werte von IL one beta.

Aber Tiere, die kontrolliert wurden, und scheinbetriebene Tiergruppen taten dies nicht. In ähnlicher Weise exprimierten Tiere, die sich einer ischämischen Reperfusion unterzogen, im Vergleich zu Tieren in Kontroll- und scheinoperierten Gruppen ebenfalls signifikante IL-Sechs-Werte. Schließlich wurde keine signifikante Produktion der myokardialen TNF-Alpha-mRNA-Expression bei Kontrolltieren festgestellt, die nach ihrer Entwicklung scheinoperiert oder durch Ischämie reperfundiert wurden.

Diese Technik ebnete Forschern auf dem Gebiet der kardiovaskulären Immunologie den Weg, um die angeborene Immunantwort bei Herz-Kreislauf-Erkrankungen bei Mäusen zu erforschen.