Agarosegel-Elektrophorese für die Trennung von DNA-Fragmenten

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, DNA-Fragmente unterschiedlicher Größe zu trennen. Dies wird erreicht, indem zunächst ein Gel mit der entsprechenden Konzentration von Aros und einem Fluoreszenzfarbstoff hergestellt wird. Der zweite Schritt besteht darin, das Gel in eine geeignete Form zu gießen und es als nächstes fest werden zu lassen.

Die Proben werden in das Gel geladen und mit Strom versorgt. Der letzte Schritt besteht darin, die getrennten DNA-Fragmente unter ultraviolettem Licht sichtbar zu machen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die AGROS-Gelelektrophorese in allen Situationen eingesetzt wird, in denen die routinemäßige Trennung von DNA-Fragmenten erforderlich ist.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden der damaligen Zeit, wie der Saccharose-Dichtegradientenzentrierung, besteht darin, dass sie die Visualisierung von DNA-Banden ermöglicht und es uns auch ermöglicht, das genaue Zeichen der genauen Größe des DNA-Fragments zu bestimmen, wenn es gleichzeitig mit dem A-DNA-Marker getrennt wird. Diese Methode ist in der biowissenschaftlichen Forschung unerlässlich, z. B. bei der Klonierung von Genen und der Reinigung und Sequenzierung von DNA-Molekülen. Obwohl diese Methode im Allgemeinen verwendet wird, um DNA-Fragmente zwischen hundert Basenpaaren und 25-Kilo-Basen zu trennen, kann sie auch modifiziert werden, um DNA-Fragmente mit einer Größe von bis zu 10 Megabasen zu trennen.

Agros-Gele werden mit einer Lösung in Gewichtsprozent hergestellt. Die Konzentration von Aros und einem Gel hängt von der Größe der zu trennenden DNA-Fragmente ab. Um das Verfahren zur Herstellung eines Gels zu beginnen, wiegen Sie die entsprechende Masse an Aros in einen Erlenmeyerkolben ab, geben Sie das entsprechende Volumen des Laufpuffers in den Kolben.

Das Volumen des Puffers sollte nicht mehr als ein Drittel der Kapazität des Kolbenwirbels zum Mischen des Arous-Puffergemisches betragen, indem es in einer Mikrowelle bei maximaler Leistung erhitzt wird. Im 32. Intervall den Kolben herausnehmen und den Inhalt schwenken, um ihn zu vermischen. Nun wiederholen, bis sich der Agros vollständig aufgelöst hat.

Als nächstes fügen Sie Atheriumbromid in einer Konzentration von 0,5 Mikrogramm pro Milliliter hinzu. Es ist wichtig zu beachten, dass Atheriumbromid krebserregend ist, daher sollten beim Umgang mit Gelen, die Aheriumbromid enthalten, immer Handschuhe getragen werden, damit das Agros durch Inkubation in einem 65 Grad Celsius warmen Wasserbad abkühlen kann. Andernfalls verzieht sich die Gelschale, während der Aros abkühlt.

Bereiten Sie die Gelform vor, indem Sie die Gelschale in die Gießvorrichtung einsetzen. Alternativ kann man die offenen Kanten einer Gelschale mit Klebeband abkleben, um eine Form zu erstellen. Lege einen geeigneten Kamm in die Gelform, um die Vertiefungen zu erzeugen.

Gießen Sie die Form und den Aros in die Gelform. Lassen Sie die Aros bei Raumtemperatur aushärten. Sobald der Aros fest ist, entfernen Sie den Kamm.

Wenn das Gel nicht sofort verwendet wird, wickeln Sie es in Plastikfolie ein und lagern Sie es bis zur Verwendung bei vier Grad Celsius. Wenn das Gel sofort verwendet werden soll, geben Sie das Gel in die Gelbox. Um dieses Verfahren zu starten, fügen Sie den zu trennenden DNA-Proben Gelladefarbstoff hinzu.

Der Ladefarbstoff wird typischerweise mit einem sechsfachen Konzentrationsprogramm hergestellt, die Stromversorgung auf die gewünschte Spannung fügt nun genügend Laufpuffer in die Gelbox ein, um die Oberfläche des Gels zu bedecken. Es ist wichtig, den gleichen Laufpuffer zu verwenden, der zur Vorbereitung des Gels verwendet wurde, die Kabel der Gelbox an das Netzteil anzuschließen und das Netzteil einzuschalten. Vergewissern Sie sich, dass sowohl die Gelbox als auch das Netzteil funktionieren.

Das Auftreten von Blasen an den Elektroden deutet darauf hin, dass Strom fließt. Da unsere Hände dazu neigen, ein wenig natürlich zu zittern, kann es schwierig sein, eine kleine Pfeifenspitze in eine kleine Vertiefung zu bekommen. Eine Möglichkeit, das Zittern unserer Hand zu verhindern, besteht darin, sie auf den anderen Arm oder die Gelbox zu legen.

Nehmen Sie den Deckel der Gelbox langsam und vorsichtig ab Laden Sie die DNA-Proben in das Gel. Der Ladefarbstoff in der Probe lässt die Probe in das Gel einsinken und hilft dabei, zu verfolgen, wie weit die Probe gereist ist. Ein DNA-Größenmarker sollte immer zusammen mit den Versuchsproben geladen werden.

Setzen Sie den Deckel wieder auf. Vergewissern Sie sich, dass die Elektroden in die richtigen Steckplätze des Netzteils eingesteckt sind. Schalten Sie das Gerät ein und lassen Sie das Gel laufen, bis der Farbstoff in einen angemessenen Abstand gewandert ist.

Wenn die Elektrophorese abgeschlossen ist, schalten Sie die Stromversorgung aus und entfernen Sie den Deckel der Gelbox. Nehmen Sie das Gel aus der Gelbox und lassen Sie überschüssigen Puffer auf der Oberfläche des Gels abtropfen. Legen Sie die Gelschale auf Küchenpapier, um den verbleibenden laufenden Puffer aufzusaugen.

Um die DNA-Fragmente sichtbar zu machen, nehmen Sie das Gel aus der Gelschale und setzen Sie das Gel ultraviolettem Licht aus. Dies geschieht in der Regel über ein Gel-Dokumentationssystem. DNA-Banden sollten als orange fluoreszierende Banden angezeigt werden.

Machen Sie am Ende des Experiments ein Foto des Gels, entsorgen Sie das Gel ordnungsgemäß und entsorgen Sie den Puffer gemäß den Vorschriften der Institution. Diese Zahl stellt ein typisches Ergebnis nach der Arous-Gelelektrophorese von PCR-Produkten dar. Nach der Trennung sind die resultierenden DNA-Fragmente als klar definierte Banden.

Der DNA-Standard oder die Leiter sollte so weit getrennt werden, dass die Größe der Probenbanden sinnvoll bestimmt werden kann. In diesem Beispiel werden DNA-Fragmente von 765 Basenpaaren, 880 Basenpaaren und 1022 Basenpaaren auf einem 1,5%-AROS-Gel mit einer zweilogarithmischen DNA-Leiter getrennt. Wenn Sie den Eingriff versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, die Platzierung der Elektroden zu überprüfen, bevor Sie Strom anlegen.

Damit soll sichergestellt werden, dass sich die DNA-Moleküle in die richtige Richtung bewegen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie eine Agrozelle vorbereiten, DNA und Fragmente der Lagergrößen trennen und repräsentative Bilder Ihrer Ergebnisse erhalten. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit einem Dreibromid extrem gefährlich sein kann und Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Handschuhen, Schutzbrillen und Laborkitteln immer getroffen werden sollten, wenn Sie dieses Verfahren durchführen.