Die Verwendung Tiermodell für Sepsis zu neuartigen Therapien zu beurteilen Herbal

Sepsis bezieht sich auf eine systemische inflammatorische Reaktion, die sich aus einer mikrobiellen Infektion, und simuliert werden können durch eine Blinddarm-OP-Technik bezeichnet Ligatur und Punktion (CLP). Hier beschreiben wir eine Methode zur CLP-induzierte Tiermodell zu verwenden, um Heilkräuter für therapeutische Wirkstoffe zu screenen.

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, ein Mausmodell der Sepsis durch ein chirurgisches Verfahren namens SQL Ligation and Puncture (CLP) zu erstellen. Dies wird erreicht, indem zunächst ein 1,5 bis zwei Zentimeter großer Schnitt in der Mittellinie am Bauch einer Maus vorgenommen wird. Als nächstes wird das Seum freigelegt und ligiert, dann wird das Seum punktiert, um eine bakterielle Translokation zu induzieren.

Zum Schluss wird der Schnitt geschlossen. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die einen Anstieg der systemischen und peritonealen Zytokinspiegel sowie Symptome wie Lethargie und Letalität zeigen. Was ich Ihnen zeigen werde, ist die Herstellung eines Maus-Sepsis-Modells, das als Sation und Punktion bezeichnet wird und das von dem ursprünglichen Modell modifiziert ist, das von Dr. Chandry und seinen Mitarbeitern entwickelt wurde.

Der mittlere Hauptvorteil dieses Modells besteht darin, dass es das relevanteste Modell der Sepsis ist. Darüber hinaus ist es einfach, gut charakterisiert und wirtschaftlich machbar und wird daher in der Sepsis- und Entzündungsforschung häufig eingesetzt. Als Beispiel werden wir die Verwendung dieses Modells demonstrieren, um das therapeutische Potenzial von Kräuterextrakt bei Sepsis zu bewerten.

Um den Kräuterextrakt herzustellen, weichen Sie 10 Gramm Kräuter in 200 Millilitern Wasser bei 85 Grad Celsius für ein bis vier Stunden ein, um unlösliche Partikel zu entfernen, zentrifugieren Sie die Wasserfraktion bei 3.300 g für 20 Minuten bei vier Grad Celsius. Als nächstes filtrieren Sie den Überstand durch einen 0,2-Mikron-Filter. Dann wird das Filtrat weiter konzentriert, indem es einen Zentrifugalfilter mit einem Molekulargewichtsgrenzwert von 10.000 Kilodalton verwendet und 60 Minuten lang bei vier Grad Celsius bei 5.000 g schleudert.

Mit Hilfe von Makrophagenkulturen wurden nieder- und hochmolekulare Fraktionen auf die Hemmung der Aktivitäten von späten proinflammatorischen Mediatoren, wie z. B. der Gruppe Box eins mit hoher Mobilität oder HGB eins, untersucht. Um zuerst mit der Makrophagenisolierung zu beginnen, verabreichte interperitoneal zwei Milliliter einer 4%TH Glykolbrühe an normale Mäuse nach dreitägiger Ernte der primären Peritonealmakrophagenkultur, die Makrophagen in DMEM ergänzten mit 10%FBS, zwei Millimolar Glutamin und 1% Penicillin. Streptomycin waschen Sie die adhärenten Makrophagen vorsichtig mit Optimum und inkubieren Sie sie zwei Stunden lang im selben Medium.

Stimulieren Sie sie dann 16 Stunden nach der Stimulation mit dem bakteriellen Endotoxin Lipopolysaccharid oder LPS. Sammeln Sie das zellkonditionierte Medium und verwenden Sie es, um Western Blotting durchzuführen. Um die Ebenen von HM GB one zu messen.

Quantifizieren Sie die Bandenintensität unter Verwendung einer Standardkurve, die mit gereinigtem H mgb one erstellt wurde, um eine Sepsis nach der Anästhesie einer Maus mit einer intramuskulären Injektion von 75 Milligramm pro Kilogramm Ketamin und 20 Milligramm pro Kilogramm Xylazin festzustellen. Und mit einer Zehenkneifung den Sedierungsgrad zu überprüfen. Platzieren Sie die Maus in Rückenlage, reinigen Sie den Bauch und machen Sie dann einen 15-Millimeter-Mittellinienschnitt, um den Blinddarm etwa fünf Millimeter von der Folgespitze entfernt mit einer Vier-Oh-Seidennaht freizulegen.

Ligustieren Sie den Blinddarm und stechen Sie dann mit einer 22-Gauge-Nadel einmal in den ligierten Folgestumpf, um die Extrusion des Stuhls zu ermöglichen, bringen Sie den Blinddarm sofort in seine normale intraabdominale Position zurück und schließen Sie den Bauch. Nachdem die Tiere das Bewusstsein und die Beweglichkeit wiedererlangt haben. Bringen Sie den Käfig nach 24 Stunden wieder in den Tierraum zurück.

Nach der intraperitonealen CLP-Verabreichung von 200 Mikrolitern Kräuterextrakt oder Kontrolle täglich für drei Tage. Überwachen Sie das Überleben des Tieres so lange wie nötig innerhalb weniger Stunden nach der Ligatur und Punktion oder der CLP-Operation. Die Tiere zeigen klinische Anzeichen einer Sepsis, zu denen Piloerektion, Lethargie, Zusammenkauern und eine Abnahme der Nahrungs- und Wasseraufnahme gehören.

Tiere, die eine schwere Bauchfellentzündung mit konsekutiver systemischer Infektion entwickeln, sterben in der Regel innerhalb von 48 bis 96 Stunden. Aber auch Alter, Geschlecht und genetischer Hintergrund passen zu Tieren, die im Rahmen einer experimentellen Sepsis unterscheidbar auf die Operation ansprechen können, zum Beispiel 48 Stunden nach der CLP. Während einige Tiere sich dem hier definierten Zustand des Hügels angenähert haben könnten, können andere in einem nicht todgeweihten Zustand verharren.

Umfassende Untersuchungen von zirkulierenden Zytokinen zeigten dramatische Unterschiede in den Spiegeln mehrerer Zytokine, darunter IL sechs, kc, MIP zwei und ST nfr, eins zwischen Mäusen im moribunden und nicht moribunden Zustand. Insbesondere wurden diese Entzündungsmediatoren als Surrogatmarker für Sepsis eingestuft, da ihre zirkulierenden Spiegel zuverlässige Prädiktoren für den tödlichen Ausgang bei experimenteller oder klinischer Sepsis sind. Darüber hinaus induzierte die CLP eine lokale Freisetzung verschiedener pro- und antiinflammatorischer Zytokine und Chemokine, so können beispielsweise 48 Stunden nach der CLP noch signifikante Mengen des Zytokins IL six und der Chemokine KC und MI P two nicht nur systemisch, sondern auch lokal in der Peritonealspülflüssigkeit gemessen werden.

In dieser Arbeit wurden die Fähigkeiten verschiedener pflanzlicher Extrakte bzw. Kontrollstoffe auf ihre Fähigkeit hin untersucht, die Endotoxin-induzierte HGB-One-Freisetzung zu hemmen. Diejenigen, die in der Lage waren, die Freisetzung von HGB one zu hemmen, wurden in vivo mit einem Mausmodell der Sepsis weiter getestet. Aufgrund der späten und anhaltenden Kinetik der HGB-1-Akkumulation bei experimenteller Sepsis wurde die erste Dosis von HGB-1-Hemmern 24 Stunden nach Beginn der Sepsis verabreicht, ein Zeitpunkt, zu dem Mäuse deutliche Anzeichen einer Sepsis entwickelten, einschließlich Lethargie, Durchfall und Piloerektion, wie hier gezeigt, verzögerte und wiederholte Verabreichung einer wichtigen grünen T-Komponente epi Gallo, Catechin drei GALLAT oder EGCG ab 24 Stunden nach Beginn der Sepsis rettete Mäuse signifikant vor einer tödlichen Sepsis, selbst wenn es oral verabreicht wurde. EGCG rettete Mäuse immer noch vor einer tödlichen Sepsis, was die Überlebensraten der Tiere von 16% auf 44% signifikant erhöhteNach der Beherrschung dieser Ligatur und des Punktionsmodells kann es in weniger als fünf Minuten abgeschlossen werden, wenn es richtig durchgeführt wird.