Nicht-invasive Bildgebung von disseminierter Candidiasis in Zebrafischlarven

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Techniken zur Infektion von Zebrafischlarven mit Hilfe des Pilzerregers Candida albicans zu demonstrieren. Zunächst wird eine fluoreszierende Pilzkultur hergestellt und Fischembryonen beschichtet. Anschließend werden die Fische auf einer Arous-Injektionsschale aufgereiht.

Candida albicans wird durch das Ohr jedes Fisches in das Hinterhirn des Ventrikelfischers injiziert, dann in Low-Melt-Aeros eingebettet und durch Epi-Fluoreszenzmikroskopie sichtbar gemacht. Letztendlich kann diese Methode verwendet werden, um die Interaktion zwischen Wirtserregern in der komplexen Umgebung des Wirts und nicht im vereinfachten System der Petrischale nicht-invasiv abzubilden. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Injektion von Kotschlervenen besteht darin, dass Sie eine lokalisierte Infektion erzeugen, die zu einer tödlichen disseminierten Krankheit führt.

Darüber hinaus ermöglicht diese Technik eine effiziente Injektion der inhärent großen C-Bucan-Zellen in kleine Zebrafischlarven. Beginnen Sie damit, einen Candida Albican-Fond auf einen Hefeponi zu streichen. Dextrose-Agar-Platte: Inkubieren Sie die Platte über Nacht bei 37 Grad Celsius, damit die Bienenvölker wachsen können.

Sobald die Völker sichtbar sind, wählen Sie mit einem sterilen Holzdübel ein isoliertes Volk aus und lösen die Hefe in fünf Millilitern frischem Hefeextrakt Pepto Dextrosebrühe in 16 mal 150 Millimeter großen Kulturröhrchen auf. Stellen Sie die Kultur über Nacht bei 37 Grad Celsius auf eine Gewebekultur-Walzentrommel, die mit einem Reagenzglasrad und Inkubatoren ausgestattet ist. Am nächsten Tag geben Sie einen Milliliter der Kultur in ein 1,5-Milliliter-Eend-Off-Röhrchen und zentrifugieren es eine Minute lang bei 14.000 Mal, G, um die Zellen zu pelletieren, dann das Supinat zu verwerfen und das Pellet zu wirbeln, um es zu lösen.

Resuspendieren Sie die Zellen in einem Milliliter PBS-Vortex und zentrifugieren Sie sie erneut. Entsorgen Sie dann das Supinat und wiederholen Sie diese Wäsche. Gehen Sie dreimal vor, um alle Reste des Kulturmediums zu entfernen.

Sobald die Zellen gewaschen wurden, zählen Sie sie in einem Hämozytometer mit einer Verdünnung von eins bis 100 in PBS. Für eine 12-Stunden-Kultur sollten Sie drei- bis viermal 10 bis acht Zellen pro Milliliter erwarten. Reese's biegt die Hefe in einer Endkonzentration von 10 auf sieben Zellen pro Milliliter.

Verwenden Sie ein Sieb, um Zebrafischembryonen am Tag vor der Injektion aus einem Laichbecken zu sammeln, und lagern Sie sie in einer Eiwasserlösung, die 60 Milligramm pro Milliliter Instant-Meersalz in sterilem entionisiertem Wasser enthält. Platzieren Sie die Embryonen dann 24 Stunden lang bei 33 Grad SIUs mit einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus. Dies ermöglicht die Entwicklung des Embryos bis zum ersten Larvenstadium von 25, dem optimalen Stadium für die Infektion am Tag der Infektion.

Übertragen Sie die Embryonen mit einer Transferpipette in 60 Milliliter Eiwasser in eine extra tiefe Petrischale. Dann verwenden Sie ein Präpariermikroskop und eine Dumont-Pinzette, um die Embryonen zu enthaaren. Dies kann erreicht werden, indem man den Corian vorsichtig wie eine Tüte Kartoffelchips auseinanderzieht, bis der Fisch herausspringt.

Sobald alle Embryonen decoatet sind. Während also die Petrischale den Fisch in Richtung Mitte bewegt, den Fisch auf den Deckel der Schale legen, das Medium entfernen und durch frisches Eiwasser ersetzen. Fisch in frisches Eiwasser geben.

Bereiten Sie eine Lösung von 200 Mikrogramm pro Milliliter Trica-Methansulfonat vor, um den Fisch mit einer Transferpipette zu betäuben. Entnehmen Sie 20 bis 50 Embryonen und legen Sie sie für ein bis zwei Minuten in die Narkoselösung oder bis sie sich nicht mehr bewegen. Schalten Sie in der Zwischenzeit die Einspritzeinheit ein und stellen Sie sicher, dass der Druck den Impuls einschaltet und die Impulsdauer auf neun mit drei PSI für die Gegendruckeinheit eingestellt ist.

Öffnen Sie allmählich das Ventil am Stickstofftank, bis der Einspritzdruck 30 PSI erreicht. Laden Sie anschließend die gepoolte Mikropipette mit fünf Mikrolitern Vortex-Candida-Albican-Lösung und legen Sie sie in den Mikropipettenhalter. Stellen Sie eine extra tiefe Petrischale mit Wasser auf den Präpariermikroskoptisch und stellen Sie die Position der Mikropipetten so ein, dass sie im Blickfeld ist und ihre Spitze nur teilweise im Wasser ist.

Schneiden Sie dann mit einer Pinzette die Nadel der gepoolten Pipette etwa drei Millimeter von der Spitze entfernt ab. Wenn die Nadel erfolgreich geclippt wurde, sollte durch Drücken des Fußschalters der Injektionseinheit die Flüssigkeit abgegeben werden können. Messen Sie mit einem abgestuften Objektträger das abgegebene Volumen und stellen Sie dann den Druck so ein, dass das Volumen der abgegebenen Flüssigkeit einen Durchmesser von 0,21 Millimetern oder knapp unter der Größe der Pupille eines Zebrafischembryos hat.

Sobald das Mikroskop aufgestellt und die Fische betäubt sind, quellen Sie die Schale auf, um den Fisch in die Mitte zu ziehen und ihn in eine Transferpipette zu geben. Klopfen Sie vorsichtig auf die Seite der Pipette, so dass sich der Fisch an der Spitze absetzt. Legen Sie den Fisch dann mit so wenig Volumen wie möglich vorsichtig auf eine auf 28 Grad Celsius vorgewärmte Injektionsschale für Larven.

Mit einem glatten Glasstab den Fisch vorsichtig auslegen. Entfernen Sie dann mit einem Papiertuch so viel Flüssigkeit wie möglich aus der Schüssel. Stellen Sie die Aros-Schale mit dem Fisch unter das Mikroskop, bis sowohl die Nadel als auch der erste Fisch klar zu sehen sind.

Stellen Sie sicher, dass jeder Fisch noch am Leben ist, indem Sie das Vorhandensein eines sichtbaren Herzschlags beobachten. Wenn es tot ist, wirf es weg und gehe zum nächsten über. Bewege die Glasnadel in Richtung des heranzoomenden Fisches.

Führen Sie dabei die Nadel vorsichtig in die kreisförmige Struktur des Ohrs des Fisches ein, wobei sich zwei Ohrsteine direkt hinter dem Auge befinden. Sobald die Nadel in Position ist, injizieren Sie die Hefe mit dem Fußschalter. Wenn die Nadel richtig eingeführt ist, wird der Fisch nach der Injektion leicht ins Hinterhirn schwanken, die Nadel zurückziehen und den Vorgang mit dem nächsten Fisch wiederholen.

Der gesamte Vorgang sollte nicht länger als 15 oder 20 Minuten dauern, sonst trocknet der Fisch nach dieser Zeit aus und stirbt. Die Hefe setzt sich auch am Boden der Mikropipette ab und führt zu einer ungleichmäßigen Infektion, Dosierung und/oder Verstopfung der gepoolten Mikropipette. Sobald alle Fische injiziert wurden, waschen Sie sie mit Eiwasser von den Aros ab und in eine frische Petrischale mit 60 Millilitern Eiwasser.

Stellen Sie das Gericht dann auf 28 Grad Celsius. Schließen Sie das Stickstoffventil, stellen Sie den Einspritzschalter auf Dauer, um den Druck in der Tankleitung zu entlasten. Wenn der Druck auf Null fällt, stellen Sie den Schalter wieder auf Impuls und schalten Sie die Einspritzeinheit aus.

Beginnen Sie damit, den infizierten Fisch in Trica-Methansulfat zu betäuben, wie zuvor beschrieben. Sobald die Fische betäubt sind, verwenden Sie eine Pipette, um einen Fisch nach dem anderen in eine Petrischale mit 0,4 % niedrigem Schmelzagar zu übertragen. Dann mit einer Transferpipette so wenig Agros wie möglich übertragen.

Übertragen Sie jeden Fisch aus der Petrischale in eine Vertiefung einer Bildgebungsschale mit Glasboden bei etwa 0,2 Millilitern und 0,4 % Es entstand eine niedrige Schmelze, die mit 200 Mikrogramm pro Milliliter Anästhetikum auf dem Fisch ergänzt wurde, so dass die inneren Kreise gefüllt sind und sich eine dünne Schicht Aros auf dem Boden der Vertiefung ausbreitet. Der Fisch kann nun bis zu 24 Stunden lang mit einem inversen Mikroskop mit einem konfokalen Laserscanning-System abgebildet werden. Fünf Stunden nach der Infektion von Zebrafischen mit rot fluoreszierenden Candida albicans.

Die Hefe ist im Hinterhirn des Fisches bei FL I einem EGFP-Fisch sichtbar, wie diese, das Gefäßendothel und makrophagenähnliche Zellen im gesamten Körper des Fisches fluoreszieren. Sie sind hier in Grün dargestellt, fünf Stunden nach der Infektion. Die Hefe ist in makrophagenähnlichen Zellen nach 24 Stunden zu sehen.

Die Infektion hat sich entlang des dorsalen Schwanzgewebes ausgebreitet, wo die Hefe wiederum in den FTIC-Zellen nachgewiesen werden kann. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Candida albicans in den Hinterhirnventrikel des Zebrafisches des Stadiums Prim 25 mikroinjiziert, einschließlich einer zur Vorbereitung der Pilzkultur, zwei betäubender Zebrafischlarven. Drei Mikroinjektionen in den Hinterhirnventrikel.

Und viertens, infizierte Larven für die konfokale Bildgebung vorzubereiten.