Ex vivo Live-Imaging von Single Cell Divisionen in Maus Neuroepithel

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Live-Bildgebung von fluoreszierenden Markern mit embryonalen Neuroepithel-Schnittkulturen der Maus zu integrieren. Dies wird erreicht, indem zunächst die induzierbare Cree-Mauslinie mit der Cree-Reporterlinie gekreuzt wird, um sich sichtbar teilende Zellen genetisch zu markieren. Als nächstes werden die ganzen Mausembryonen präpariert und in vitro in Gegenwart von Lentiviren kultiviert.

Dann wird der Embryo in Scheiben geschnitten und der Neuralrohrschnitt für die Live-Bildgebung vorbereitet. Schließlich wird der Schnitt des Neuralrohrs mit einer konfokalen Zeitraffermikroskopie abgebildet. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die eine direkte Beobachtung einzelner Zellteilungen innerhalb des sich entwickelnden Neuroepithels in Echtzeit durch ex vivo Live-Bildgebung zeigen.

Die Stärke dieses Protokolls besteht also darin, dass wir einzelne Zellen in vivo überwachen können, was es uns ermöglicht, Fragen zu den Signalereignissen jeder Zelle sowie zum Verhalten jeder Zelle zu stellen. Zu Beginn kreuzen Sie die Tamoxifen-induzierbare Cree-Mauslinie, CAGG CRE ER, mit der DS Red Cree-Reporterlinie. Um das relative Timing der Sonic Hedgehog-Reaktion in den Tochterzellen zu überwachen, überqueren Sie die rote Linie von CAGG CRE ER ds mit OG zwei EEG.

FP zurück transgene Mäuse lösten Tamoxifen in 100%igem Ethanol auf und injizierten dann intraperitoneal bei schwangeren Weibchen mit E 6,5, um die CRE-Expression und die DS-Rotmarkierung in einer kleinen Untergruppe embryonaler Zellen zu induzieren. 48 Stunden später, nachdem die Embryonen präpariert wurden, verwenden Sie ein Fluoreszenzmikroskop, um DS-Rot-positive Embryonen zu identifizieren. Übertragen Sie sie in eine Kulturschale und beobachten Sie die Teilung einzelner Zellen während der ex vivo-Bildgebung

Präparieren Sie E 8.5 Embryonen in Prewarm Wash Medium, das eine Eins-zu-Eins-Lösung D-M-E-M-F 12 enthält, ergänzt mit 10 % Kälberserum und 1 % Penicillin-Streptomycin. Mit einem Fluoreszenzmikroskop mit einem auf 37 Grad Celsius erhitzten Tisch oder neben einer 37-Grad-Heizplatte können Embryonen sofort als GFP- und/oder DS-RED-positiv identifiziert werden. Übertragen Sie bis zu zwei Embryonen in einen 500-Mikroliter-Tropfen einer voräquilibrierten Kultur. Mittel.

Tragen Sie eine dünne Schicht äquilibriertes leichtes Mineralöl auf das Medium auf, um eine Verdunstung zu verhindern, und inkubieren Sie die Kulturschale mit den Embryonen bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Um die Zilien im Neuroepithel zu markieren, fügen Sie fünf bis 10 Mikroliter S sst, R 3G FP Lentivirus, etwa 2 Millionen Varianten zu einem 500 Mikroliter äquilibrierten Tropfen Kulturmedium hinzu, das einen Embryo enthält. Nach 18-stündiger Kultivierung wird der infizierte Embryo in mehrere Tropfen Waschmedium gegeben, um das Virus auszuwaschen und Neuralrohrscheiben vorzubereiten.

Übertragen Sie einen Embryo in eine mit 1%Agar beschichtete Schale und verwenden Sie ein 0,025 Millimeter Mikromesser, um das Neuralrohr zu präparieren. Geben Sie einen 150-Mikroliter-Tropfen äquilibriertes Kulturmedium ohne Phenolrot auf eine 35 Millimeter Polyol-Lysin-beschichtete Glasbodenschale und platzieren Sie das isolierte Neuralrohr auf der ventralen Seite. Geben Sie in den Tropfen Medium kleine Mengen einer Eins-zu-Eins-Mischung aus Vaseline und geschmolzenem Kerzenwachs um das montierte Neuralrohr und drücken Sie vorsichtig einen Glasdeckel in das Gelee, um die Probe zu immobilisieren.

Decken Sie die Schüssel mit einer dünnen Schicht äquilibriertem leichtem Mineralöl ab, um ein Bild zu machen. Verwenden Sie ein inverses Konfokalmikroskop, das mit einer Klimakammer ausgestattet ist, die auf 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid eingestellt ist. Verwenden Sie ein 60-fach-Ölimmersionsobjektiv, um GFP-markierte rote CIA- und DS-Zellen abzubilden, und ein 40-faches Ölimmersionsobjektiv

Um zwei rote positive Zellen von LIC zu überwachen, öffnen Sie die NIS-Elements-Software, um die Zeitraffer-Bildgebungsbedingungen einzurichten. Erfassen Sie alle 10 Minuten Zacks mit einer Dicke von bis zu 25 Mikrometern und einem Abstand von 1,5 Mikrometern. Wenn Sie ein 40-fach-Objektiv verwenden und bis zu acht Mikrometer mit einem Abstand von 0,4 Mikrometern für ein 60-fach-Objektiv stapeln, finden Sie weitere Anweisungen im Textprotokoll.

Nach dem Fixieren und Einbetten des Gewebes in die OCT wird mit einem Kryostaten die Schnitte vorbereitet und die Immunfluoreszenz gemäß dem Textprotokoll durchgeführt. In dieser Arbeit führten wir ex vivo Live-Bildgebung von Einzelzellteilungen innerhalb des E 8,5 Maus-Neuroepithels durch, um einzelne Zellen zu markieren. Wir induzierten die CRE-Rekombinase in einer Untergruppe von Zellen, die eine Cree-Reporterlinie enthielten, die bei Rekombination DS-Rot exprimierte, wie hier zu sehen, 48 Stunden später wurden Einzelzellteilungen durch Exvivo-Bildgebung beobachtet, indem ein sonic hedgehog transkriptioneller Reporter eingeschlossen wurde, der die transgene oli zwei EGFP-Linie modifizierte.

Wir waren in der Lage zu beobachten, wann Zellen auf die CLIA-Bildung reagierten, SST R 3G FP Lentiviren wurden erzeugt und zur Infektion von Embryonen in Kultur verwendet. Ergebnisse aus der konfokalen Zeitrafferbildgebung der DS Red Cree Reporterembryonen, die EG zwei EGFP exprimierten oder mit SSTR 3G FP Lentivirus infiziert waren, während einer in vitro Kultur sind hier gezeigt. Eine der Stärken dieses Ansatzes besteht darin, dass wir mutierte genetische Allele in den Hintergrund einbeziehen können, was uns die Frage ermöglicht, was bestimmte Gene mit dem Verhalten und den Signalereignissen einzelner Zellen tun.