In ovo Expression von microRNA in ventralen Mittelhirn-Küken

Eine ovale Elektroporation beginnt mit dem Öffnen des Aktes, um den Wangenembryo freizulegen. Beim Hamburger Hamilton wird in den Stadien neun bis 11 DNA in die Mittelhirnregion injiziert. Dann werden Elektroden links und rechts des Mittelhirns platziert und eine elektrische Spannung angelegt.

Dies führt dazu, dass eine murale Vorläuferzelle in der ventrikulären Zone die DNA für die ventrale Transfektion aufnimmt. Eine Elektrode. Die Anode wird unter der Membran positioniert, die das A unterhalb des Mittelhirnbereichs bedeckt.

Die Kathode wird lateral dorsal an der gegenüberliegenden Seite des Mittelhirns platziert, bevor eine elektrische Spannung angelegt wird. Bitte achten Sie darauf, dass die Elektroden nicht mit dem Neuralrohr in Berührung kommen. 24 Stunden später, im Hamburger Hamilton Stadium 16 oder 17, werden die Embryonen aus der Eizelle entnommen, fixiert und durch Antikörper, Färbung oder In-situ-Hybridisierung analysiert.

GFP-positive Zellen zeigen den Bereich an, in dem das Gen transfiziert wird. Die Elektroporation von microRNA-Vorläufermolekülen oder ein microRNA-Duplex bietet einen sofortigen, aber kurzen Effekt, um eine längere Expression von microRNAs zu gewährleisten. Wir betreiben einen Expressionsvektor, der Sequenzen enthält, die für microRNA kodieren, zusammen mit einem Vektor, der GFP exprimiert.

Um transezierte Zellen sichtbar zu machen, wird MicroRNA, die von einem Vektor exprimiert wird, frühestens vier Stunden nach der Elektroporation vorhanden sein. In unserem schriftlichen Protokoll finden Sie detaillierte Anweisungen zur Sterilisation von Werkzeugen und zur Vorbereitung der von uns verwendeten Lösungen und Konstrukte. Hallo zusammen.

Ich bin Doktorandin im Labor von Andrea Mann in der Abteilung für Experimentelle Embryologie am Institut für Anatomie der Universität Tübingen. Im folgenden Film möchte ich Ihnen zeigen, wie Sie in ovalen spezifischen Bereichen des Mittelhirns mit DNA oder RNA transfizieren können. Diese Methode kann auf verschiedene Hirnareale angewendet werden.

Wir verwenden die Methode, um Mikro-RNA in der Entlüftung zu überexprimieren Mittelhirn Mikropipette mit feiner Spitze sollte vor der Verwendung eines Mikropipettenziehers mit einer langen Gelladerspitze vorbereitet werden, füllen Sie die Mikropipette mit etwa sechs Mikrolitern, DNA-Lösung anstelle einer Verfüllung. Die DNA kann auch mit einem Injektor absorbiert werden, nachdem die Spitze der Mikropipette gebrochen wurde, um Hühnerembryonen im erforderlichen Embryonalstadium zu erhalten. Der XR inkubierte bei 37 Grad Celsius und 65 % Luftfeuchtigkeit, nachdem der Hamburger und der Hamilton Anweisung XR auf die Seite gelegt hatten.

Die Spitze, an der sich der Embryo absetzt, ist mit einer Stiftlinie markiert. Nach der erforderlichen Inkubationszeit wird der XR aus dem Inkubator entnommen, so dass die Stiftlinie immer noch nach oben zeigt. Der XR wird an der Breitseite der SSON-Luftkammer mit 70%Ethanol desinfiziert, bis zu dem ein Loch angebracht ist.

Wir verwenden eine handelsübliche Eierzange, aber eine große Nadel reicht auch für das Zerkleinern. Eine 10 Milliliter Spritze wird in einem eher senkrechten Winkel in das Loch eingeführt, um eine Beschädigung des Eggo zu vermeiden und ein bis zwei Milliliter Eiweiß werden entnommen. Dies hilft, den Embryo von der Eischale zu lösen, um zu verhindern, dass Eierschalen auf den Embryo tropfen.

Befestige einen kleinen Streifen Sattelband an der Oberseite des Eies und schneide dann ein kleines Fenster in die Eierschale, um den Embryo freizulegen. Um den Embryo zu visualisieren. Eine kleine Menge Inus wird darunter injiziert.

Dann das Ei etwas schütteln, um die Tinte zu verteilen. Ein anderes, das Stereomikroskop. Der Embryo ist leicht zu erkennen.

Fügen Sie die Schilddrüse hinzu und lösen Sie den Embryo mit einem scharfen Wolframdraht ein wenig von der Vilinmembran. Durchstechen Sie die Vilin-Membran und wickeln Sie eine Lücke ein. Lücke. Durchstechen Sie die Wand des Neuroepithels posterior oder anterior des Mittelhirns mit einer Mikropipette und injizieren Sie die DNA in das Lumen des Neuralrohrs.

Auf der Ebene des Mittelhirns Um elektrisch zu arbeiten, verwenden wir ein zellinternes Dual-Puls-Elektroradar mit einem Fußpedal, um breite Bereiche des Mittelhirns elektrisch zu betätigen. Wir verwenden Flachdrahtelektroden mit einem Durchmesser von Ø 0,5 Millimetern, die in einer selbstgebauten Halterung befestigt sind. Die Elektroden zeigen einen Abstand von etwa fünf Millimetern zueinander zum Elektrolytentlüftungsgehirn.

Als Anode verwenden wir Plattendraht mit einem Durchmesser von oh 0,2 Millimetern und für die Kathodenstelle oh Punkt 25 Millimeter. Die Elektroden verlaufen parallel zum Mittelhirn des Embryos, um eine umfassende Inspektion der Mittelhirnzellen zu erreichen. Dann das Fußpedal drei- bis fünfmal zur Leber drücken, Strom pulsiert zum Embryo.

Die Blasen, die die negativ beurteilte Elektrode formatieren, zeigen eine erfolgreiche Elektroporation, um eine Transfektion des ventralen Mittelhirns zu erreichen. Die Anode wird unter die Membran des Bereichs geschoben, Lucida unter das ventrale Mittelhirn, um ein Verbrennen des Neuralrohrs zu vermeiden. Die Kathode wird ebenfalls seitlich auf der gegenüberliegenden Seite des Mittelhirns positioniert und die Stromimpulse werden angelegt.

Die XR werden mit einem Klebeband versiegelt, um sie vor Austrocknung und Infektionen zu schützen, und werden weitere 20 bis 24 Stunden inkubiert. Nach der erforderlichen Inkubation werden die X aus dem Inkubator entnommen und das Klebeband mit einer Schere mit einer feinen Schere geöffnet, der Bereich um den Embryo herum großzügig abgeschnitten und der Embryo in eine Schale geschoben. Bei PBS werden die verbleibenden Membranen, Amni und zusätzliches embryonales Gewebe entfernt.

Ein Schnitt im vierten Gehirn sorgt für einen guten Zugang der Lösungen zum ventrikulären Bereich des Neuralrohrs. Übertragen Sie dann den Embryo auf 4%PFA und fixieren Sie ihn über Nacht bei vier Grad verringerter Celsius. Ich habe Ihnen gerade gezeigt, wie Sie microRNA mittels Elektroporation in das ventrische Mittelhirn transfizieren können.

Wir untersuchen den Einfluss von microRNA auf die Differenzierung und Proliferation bestimmter Bereiche des Mittelhirns. Diese Methode kann jedoch auch sehr hilfreich sein, um die Fehlexpression von Genen oder Gen-Knockdowns durch S-I-R-N-A in anderen spezifischen Regionen des Nervensystems des Hühnerembryos zu untersuchen. Ich hoffe, das war hilfreich Und viel Glück bei Ihren Experimenten.