Ein Modell der chronischen Nährstoff Infusion in der Ratte

Ein Protokoll für chronische Infusion von Glukose und Intralipid in Ratten beschrieben. Dieses Modell kann verwendet werden, um die Auswirkungen der Nährstoff Überschuß auf Organfunktion und physiologischen Parametern zu untersuchen.

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Halsvenen und Halsschlagadern von Ratten zu katheterisieren, um Glukose und Lipide als Modell für chronischen Nährstoffüberschuss zu infundieren. Dies geschieht durch eine erste Katheterisierung der Halsvene und der Halsschlagader unter Vollnarkose. Nach dem Eingriff darf sich die Ratte sechs Tage lang erholen.

Dann werden die Katheter über ein Seil und einen Wirbel, der an der Käfigoberseite montiert ist, mit den Infusionspumpen verbunden. Zum Schluss wird die Ratte mit Glukose- und Lipidlösungen infundiert. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die die Auswirkungen eines chronischen Nährstoffüberschusses auf die Glukosehomöostase zeigen.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber anderen Modellen, wie z. B. genetischen Modellen, besteht darin, dass man die frühen Veränderungen der Betazellfunktion als Reaktion auf einen Nährstoffüberschuss untersuchen kann. Der andere Vorteil ist, dass man den Gehalt an Glukose und Intralipiden oder Lipiden im Blutkreislauf gezielt modulieren kann. Nun, wir verwenden diese Technik, um Veränderungen in der Betazellfunktion zu untersuchen, aber natürlich kann sie auch verwendet werden, um andere physiologische Parameter wie die Insulinresistenz zu betrachten.

Zum Beispiel wird das Verfahren von Grace Ferguson, einer Tiergesundheitstechnikerin in meinem Labor, demonstriert. Sterilisieren Sie vor Beginn des Eingriffs alle chirurgischen Instrumente mindestens 16 bis 24 Stunden vor dem Eingriff im Autoklaven. Legen Sie den Kanülenschlauch zur Sterilisation in 2,6 % Gesäßaldehyd. Wiegen Sie jede Ratte mit vier Ratten pro Infusionsbedingung und berechnen Sie dann die Dosierungen für die Analgesie und Anticholinergika.

Nachdem Sie die Ratte mit zwei bis 3 % iso, Fluor und Sauerstoff betäubt haben, überprüfen Sie den Grad der Sedierung durch die Zehen. Kneifen und legen Sie die Ratte auf den Bauch. Rasieren Sie den Bereich hinter den Ohren bis zum Ansatz der Schultern, drehen Sie das Tier dann auf den Rücken und rasieren Sie den Bereich unter dem Hals bis zu den Vorderpfoten.

Desinfizieren Sie anschließend die Operationsstelle dreimal mit Chlorhexidinalkohol und Jod und verabreichen Sie dann Carprofen und Glycopyrrolat. Bringen Sie die Ratte in den Operationsbereich und dann mit aseptischer Technik. Kanülieren Sie mit einer PE 50-Kanüle, die an einer Ein-Milliliter-Spritze befestigt ist, die mit fünf Einheiten heparinisierter Kochsalzlösung gefüllt ist, die rechte Halsvene und die linke Halsschlagader. Um eine Gerinnung während der Erholungsphase zu vermeiden, spülen Sie die Kanülen mit 50 Einheiten heparinisierter Kochsalzlösung durch eine abgestumpfte 23-Gauge-Nadel und verwenden Sie dann einen weiteren 23-Gauge-Stift, um jede Kanüle nach der Operation zu schließen. Schneiden Sie etwa 2,5 Millimeter von der Unterseite der Schneidezähne ab und legen Sie die Ratte in einen Infusionsmantel, um zu verhindern, dass die Kanülen gefressen werden.

Um das ISO-Fluor zu evakuieren, verabreichen Sie Sauerstoff mit einem Liter pro Minute. Setzen Sie die Ratte in einen beheizten Käfig, bis sie vollständig wach ist. An den Tagen eins und zwei, nach der Operation.

Wiegen Sie die Ratten, verabreichen Sie Glykopyrrolat zweimal subkutan am ersten Tag und einmal am zweiten Tag und führen Sie bei Bedarf zusätzliche Behandlungen gemäß dem Textprotokoll am siebten Tag nach der Operation durch. Nachdem Sie jede Ratte gewogen haben, um die Flussraten für die Infusion zu berechnen, verbinden Sie die Kanüle der Halsvene durch eine Schlauchverlängerung im Inneren der Feder mit dem blauen Drehgelenk. Spülen Sie die Kanülen mit fünf Einheiten heparinisierter Kochsalzlösung und verbinden Sie sie mit dem Haltegurt.

Verbinden Sie dann die Ratte mit dem Haltegurt und dem Drehgelenk mit dem Infusionssystem. Spülen Sie nun die Kanülen noch einmal mit fünf Einheiten heparinisierter Kochsalzlösung, um eine Gerinnung zu verhindern. Lassen Sie die Ratten sich mindestens 24 Stunden lang an die Leine gewöhnen und schwenken, bevor Sie mit der Infusion beginnen, um die Infusion durchzuführen.

Beginnen Sie damit, 0,15 Milliliter Blut aus der Halsschlagader jeder Ratte zu entnehmen und die Glykämie zu messen. Spülen Sie die Jugularkanülen und verwenden Sie 50 Einheiten heparinisierte Kochsalzlösung, um eine Gerinnung beider Kanülen zu verhindern. Übertragen Sie die Blutprobe in ein 0,5-Milliliter-Entnahmeröhrchen mit 2 % EDTA, zentrifugieren Sie dann zwei Minuten lang bei 10.000 RBM und frieren Sie das Plasma bei minus 20 Grad Celsius ein.

Füllen Sie zwei 60-Milliliter-Spritzen für jede der hier aufgeführten Infusionsbedingungen. Verwenden Sie y-Verbinder und sterilisierte Coex T 22-Schläuche, um jedes Lösungspaar miteinander zu verbinden. Platzieren Sie dann die Spritzen auf einer Harbor 33-Spritzenpumpe, indem Sie die erste Spritze auf die vordere Position der Pumpe und die zweite Spritze auf die hintere Position setzen.

Wechseln Sie als Nächstes den Käfigboden und entfernen Sie alle Lebensmittel von der Grillplatte, bevor Sie sie durch 150 Gramm Standardgrill ersetzen. Verbinden Sie dann die Spritzen mit dem Drehgelenk am Käfiggitter und spülen Sie die Spritzen ordnungsgemäß. Um eingeschlossene Luft aus den Leitungen mit dem zuletzt ermittelten Körpergewicht zu entfernen, berechnen Sie die Infusionsflussraten mit einer Excel-Datei, die die Glukoseinfusionsrate oder GIR in Milliliter pro Stunde umrechnet, basierend auf den vorgegebenen Glukosewerten, die während des gesamten Experiments beibehalten werden sollen.

Stellen Sie die Pumpe so ein, dass die Durchflussraten für 60 Spritzen gemäß den Einstellungen des Herstellers verabreicht werden, und geben Sie die Rate für Spritze eins und Spritze zwei ein. Starten Sie dann die Pumpe. Vergewissern Sie sich nach dem Starten der Pumpe, dass weder aus dem Drehgelenk noch aus den Kanülen ein Leck vorhanden ist und dass der Infusionsschlauch nicht verdreht ist.

Vergewissern Sie sich außerdem, dass sich keine Luftblasen in den Schläuchen befinden. Entnehmen Sie nach dreistündiger Infusion eine kleine Blutprobe und verwenden Sie ein tragbares Glukosemessgerät, um die Glykämieentnahme zu messen. Kleine Volumina verhindern eine Veränderung des Blutvolumens und/oder des Hämatokrits.

Entnehmen Sie zusätzliche Blutproben nach diesem Zeitplan. Ändern Sie basierend auf den gemessenen Glykämiewerten die Rate der ersten Spritze, um den Blutzucker bei 220 bis 250 Milligramm pro Deziliter zu halten. Die Geschwindigkeit der zweiten Spritze bleibt konstant, um die freien Fettsäuren bei einem Millimol pro Liter zu halten.

Wechseln Sie nach 24 Stunden Infusion den Käfigboden und wiegen Sie die im Käfiggrill verbleibenden Lebensmittel. Legen Sie die UNE-Portion wieder in den Käfig, grillen Sie sie und füllen Sie die Spritzen nach Bedarf während der 72 Stunden nach. Beobachten Sie die Ratte auf Anzeichen von Entzündungen oder Beschwerden und pflegen Sie sie bei Bedarf entsprechend.

Am Ende der Infusion können Ratten hyperglykämischen oder u-glykämischen hyperinsulinämischen Clamp-Studien unterzogen und anschließend euthanasiert oder euthanasiert werden, um die Bauchspeicheldrüse für die Histologie oder die Isolierung der Ösen zu entnehmen. Diese Abbildung zeigt den Blut-, Glukose- und Fettsäurespiegel während der 72-stündigen Infusionsperiode. Wie hier gezeigt, wird der Glukosespiegel während der gesamten Infusion bei etwa 220 bis 250 Milligramm pro Deziliter gehalten.

Nagetiere haben eine starke Fähigkeit, die Glukoseinfusion zu kompensieren, indem sie die endogene Insulinsekretion erhöhen. Daher muss die GIR im Verlauf der Infusion erhöht werden, damit der Blutzuckerspiegel auf einem relativ stabilen Zustand gehalten wird. Trotzdem sinkt der Blutzuckerspiegel gegen Ende der Infusion tendenziell ab.

Darüber hinaus verringern die mit Glukose und Intralipiden angereicherten Tiere aufgrund der Gewichtsmessungen von Futter spontan ihre Nahrungsaufnahme, da sie mit Glukose und Intralipiden angereicherte Nährstoffe erhalten. Im Gegensatz zu den mit Kochsalzlösung angereicherten Kontrollratten, sobald sie gemeistert wurden, kann diese Technik in 30 bis 40 Minuten pro Ratte durchgeführt werden, wenn sie richtig durchgeführt wird. Nach diesem Verfahren führen wir in der Regel hyperglykämische oder U-glykämische Hyperinsulin-anämische Klemmen durch, um die Insulinsekretion bzw. die Insulinsensitivität zu messen.