Name: Free Radicals in Chemical Biology: ab chemisches Verhalten, um Biomarker Entwicklung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 22 s
Description: Erfahren Sie die radikalbasierte Biomimetische Chemie zur Biomarker-Entwicklung durch Synthese und Analyse modifizierter Biomoleküle unter UV-Licht. Diese Methode verbindet chemisches Wissen mit biologischen Prozessen.

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Finanzielle Unterstützung aus dem Ministero dell&#39;Istruzione, dell&#39;Università della Ricerca (PRIN-2009K3RH7N_002) und Marie Curie Intra-European Fellowship (CYCLOGUO-298555) sowie das Sponsoring von COST Action CM0603 auf &quot;Free Radicals in Chemical Biology and COST Action CM1201 on &quot;Biomimetic Radical Chemistry&quot; werden dankbar anerkannt.

Ein. Synthese von Mono-trans-Isomere von Cholesterylestern <ol><li> Aufzulösen Cholesterylestern (Linoleat oder Arachidonat Cholesterylester) in 2-Propanol (15 mM). Zum besseren Solubilisierung wurden die Proben für 15 Minuten unter Argon mit Ultraschall behandelt. </li><li> Die Lösung wird in einem Quarz-photochemischen Reaktor, add 2-Mercaptoethanol in 2-Propanol (bis 7 mM Konzentration zu erreichen, von einer 2 M Stammlösung des Thiol). Spülen der Reaktionsmischung mit Argon für 20 min, um die Anwesenheit von Sauerstoff in der Lösung zu beseitigen. </li><li> Bestrahlen der Reaktionsmischung mit UV-Licht unter Verwendung einer niedrigen 5.5W Quecksilberhochdrucklampe bei 22 ± 2 ° C für 4 min. Monitor durch analytische Ag-TLC (Silber-Dünnschichtchromatographie) zum Nachweis der Bildung der mono-trans Cholesterylestern (siehe Abbildung 1 für die chemische Formeln). Die TLC-Färbung erfolgt durch Gießen der Platte in der Cer-Ammonium molibdate (CAM)-Lösung durchgeführt, und die Flecken beim Erhitzendie Platte. Die Reaktion wird in einem frühen Stadium, um das Ausgangsmaterial, das wiederverwendet zu anderen Runden der Isomerisierung, Erhalten einer Erhöhung der Gesamtausbeute durchführen kann erholen. </li><li> Sammeln das Reaktionsgemisch in einem Rundkolben, Waschen der Apparatur mit einigen ml 2-Propanol. Entfernen des Lösungsmittels und Reinigung der Mono-trans Isomeren von Cholesterylestern durch Ag-TLC wie in der Literatur beschrieben. 5 Verwendung Hexan-Diethylether (9:1 v / v) als Eluens für Mono-trans Isomeren Cholesteryl-Linoleat, wohingegen die Verwendung Hexan -Diethylether-essigsäure (9:1:0,1 v / v) für Mono-trans Cholesteryl Arachidonat Isomere. </li></ol> 2. Isolation von Cholesterylestern Fraktion aus menschlichem Serum <ol><li> Verdünnte 1 ml Humanserum (erhalten durch Zentrifugation des Blutes) mit 1 ml Kochsalzlösung und die Lösung in einem Scheidetrichter unter einem Argonstrom um Artefakte (zB Oxidation Addukte) zu vermeiden. 10 ml Chloroform-Methanol (2: 1 v / v) dreimal. Schütteln den Scheidetrichter nur langsam um die Bildung der Emulsion durch die Gegenwart von Albumin zu begrenzen. </li><li> Wäscht die organischen Schichten einmal mit Kochsalzlösung (10 ml), dann in einem Erlenmeyerkolben sammeln unter einem Argonstrom, über wasserfreiem Natriumsulfat. Entfernen von flüchtigen Rotationsverdampfer zu einem gelben Öl (gesamten Plasma Lipidfraktion) zu ergeben. </li><li> Aufnahme der rohen mit 1 ml Chloroform-Methanol (2:1 v / v), Last auf eine präparative TLC unter einem Strom von Argon und eine Mischung aus Hexan-Diethylether (9:1 v / v) als Eluens . Abkratzen Kieselsäure enthaltenden Abschnitt der Cholesterylester Fraktion und gießen Sie in einem Fläschchen. Dann extrahiert Siliciumdioxid (3 × 5 ml) mit Chloroform-Methanol (2:1 v / v), sammeln die organischen Schichten und Entfernen des Lösungsmittels nach dem Eindampfen das reine Fraktion von Cholesterylestern (normalerweise ~ 1,5 mg) zu ergeben. </li><li> Halten Cholesterylestern in einer dunklen Glasflasche mit Aluminiumfolie unter Argon und speichern abgedeckt bei -20 ° C. Cholesteryl esters sind empfindlich gegenüber Licht und Sauerstoff. </li></ol> 3. Charakterisierung von Mono-trans Cholesterylestern durch Raman-Spektroskopie <ol><li> Auszug Cholesterylestern aus menschlichem Serum (≥ 0,7 mg), wie in Abschnitt 2 beschrieben, in einer kleinen Menge von Tetrachlorkohlenstoff (≤ 10 ul) und in einem Fläschchen aufzulösen. CCl 4 als Lösungsmittel gewählt, weil seine Raman-Signal nicht mit dem Bereich von Interesse von Cholesterylester Analyse überlappen. </li><li> Die Lösung wird in den Probenhalter durch einen Einweg Glaspipette, dann vorsichtig das Lösemittel durch einen langsamen Strom von Argon. Sobald eine gleichmäßige öligen Film auf der Innenwand des Probenhalters ausgebildet ist, versetzen die letztere in das Instrument für die Messung. </li><li> Fouriertransformiert Ramanspektrum von Cholesterylestern direkt auf der Lipidextrakte ohne Derivatisierungsreaktion erzielt. Die Laserleistung auf der Probe &lt;100 mW zu Probe zu vermeiden. Die Gesamtzahl von Abtastungenfür jedes Spektrum ist ≥ 800 um das Hintergrundrauschen zu minimieren. </li><li> Die 1,700-1,630 cm -1 des Raman-Spektrums analysiert wird, da sie die Abgabe auf die C = C-Doppelbindungen im Molekül (C = C-Streckschwingung) spiegelt. Eine Kurvenanpassung Analyse basiert auf diesem Gebiet durchgeführt, wodurch die Unterscheidung der überlagerten Beiträge von cis-und trans-Doppelbindungen in der Fettalkylkette und Doppelbindung im Ring B von Cholesterin (siehe Abbildung 2). </li><li> Um richtig die Banden passen, sollten einige Parameter fest oder eingeschränkt in vernünftigen Grenzen. Die Komponente Peakprofile werden als eine lineare Kombination von Lorentz-und Gauß-Funktionen beschrieben, während die halbe Höhe Bandbreiten besten durch den Computer Optimierungsroutine ermittelt werden. Die Anzahl und die Position der Komponente Peaks werden durch Verwendung des vierten Ableitungsspektren, die auch erkennen einige schwache Komponente Bands erlauben erhalten. Da das SignalRausch-Verhältnis das auf Differenzierung des Signals verschlechtert können die Verwendung des vierten Derivat auszuschließen, geglättet vierte Derivate mit einer Dreizehn-Punkt Savitsky-Golay-Funktion, von Vorteil; somit ein Kompromiss zwischen der rechten Auflösung und des Signal-Rausch-Verhältnis erhalten wird . Beste Kurvenanpassung auf der niedrigsten möglichen c 2 erhaltenen Werte. </li><li> Die Anwesenheit von trans-Isomere wird durch die Komponente bei 1671 ± 1 cm -1 zusätzlich zu zumindest die beiden Komponenten, leicht zu niedrigeren Frequenzen hin verschoben wird, aufgrund der Fettsäurekette und Cholesterin C = C-Doppelbindungen offenbart. Repräsentative Ramanspektrum von Plasma Cholesterylester ist in 9 gezeigt. Im Einschub der Vergleich einer bestimmten Region mit Cholesteryl-Linoleat und Mono-trans Cholesteryl Linolsäureisomeren gezeigt. </li></ol> 4. Derivatisierung zu Fatty Acid Methylester (FAME) und Analyse mittels Gaschromatographie <ol><li> AuflösenCholesterylestern (~ 1,5 mg) mit 0,5 ml einer 1 M Lösung von Natriumhydroxid in Methanol-Benzol (2:3 v / v) und in einen dunklen Fläschchen durch Aluminiumfolie unter Argon abgedeckt. </li><li> Lassen Sie die Mischung unter Rühren bei Raumtemperatur und Monitor durch DC unter Verwendung einer Mischung von Hexan-Diethylether (9:1 v / v) als Eluens. Reaktionsdauer beträgt üblicherweise 30 Minuten Reaktion aber eine sorgfältige Überwachung erforderlich. In der Tat, wenn die entsprechenden Methylester gebildet werden, muß die Reaktion abgeschreckt, um die Bildung von Abbau-und Nebenprodukten zu vermeiden. TLC zeigten die quantitative Bildung von Methylestern. </li><li> Die Reaktion wird durch Zugabe von 1 ml Kochsalzlösung und extrahiert Methylester mit n-Hexan (3 × 2 ml). Sammeln der organischen Schichten in eine Phiole und Entfernen des Lösungsmittels durch Rotationsverdampfung um den Methylester Fraktion, die dann für die GC-Analyse wird ohne weitere Reinigung verwendet leisten. </li><li> Man löst die Methylester in der Mindestmenge n-Hexan (üblicherweise 1 mg in 50 ul) und injizieren im GC mit einer 60 m × 0,25 mm × 0,25 um (50%-Cyanopropyl)-Methylpolysiloxan Kolonnenkopf ausgestattet. Verwenden einen Flammenionisationsdetektor (FID) mit folgendem Programm Ofen: Temperatur Beginn bei 165 ° C für 3 min, durch Erhöhung von 1 gefolgt halten ° C / min bis zu 195 ° C, für 40 min, gefolgt von einer zweiten halten Erhöhung von 10 ° C / min bis zu 240 ° C und für 10 min halten. Ein konstanter Druck-Modus (29 psi) ausgewählt wird. Helium oder Wasserstoff als Trägergas verwendet werden. Methylester werden durch Vergleich mit den Retentionszeiten von authentischen Proben identifiziert. Abbildung 10 zeigt eine repräsentative GC-Analyse der FAME aus dem Plasma Cholesterylestern erhalten. </li></ol> 5. Synthese von (5&#39;R) - und (5&#39;S) -5 &#39;,8-cyclo-2&#39;-desoxyadenosin <ol><li> Man löst 33 mg 8-Brom-2&#39;-desoxyadenosin (8-Br-DADO) in Acetonitril (100 ml), um 1 mM Konzentration erreichen. Regeln Gasstrom (Ar oder N2) im Photoreaktor und füllen den apparatus mit der Lösung von 8-Br-DADO. </li><li> Vorbereiten eines Septums mit der entsprechenden Größe für die Eingangs-und Photoreaktor passieren eine Nadel, die mit dem Inertgas Linie durch die Mitte davon. Schließen Sie das System mit dem Septum. Spülen des Inertgases für 30 min. </li><li> Strahlen durch UV-Licht mit einer 125W Quecksilber-Mitteldruck-Lampen bei 22 ± 2 ° C für 15 min, sammeln die Lösung in einem 250 ml-Rundkolben. Waschen Sie den Photoreaktor mit 10 ml Acetonitril und sammeln Waschungen in der gleichen Flasche. </li><li> Quench das rohe Reaktionsgemisch mit 1 M NH 4 OH-Lösung und dampft das Lösungsmittel im Rotationsverdampfer. </li><li> Führen Hochleistungsflüssigchromatographie-Analyse (HPLC-UV) mit Trennsäule (siehe Instrumentierung Abschnitt) unter bekannten Bedingungen und vergleichen das Profil mit Referenz-Verbindungen. </li><li> Führen Hochleistungsflüssigchromatographie-Analyse (HPLC-UV) mit einer analytischen Säule (siehe Instrumentierung Abschnitt) mithilfe der folgenden solLüftungsschlitze und Steigungen: 2 mM Ammoniumformiat als Lösungsmittel A und Acetonitril als Lösungsmittel B. Setzen Sie die Flussrate auf 1 ml / min und der Gradient von 0% Lösungsmittel B bis 0,3% Lösungsmittel B in 2,2 min erreicht werden. Dann wurden 0,8% Lösungsmittel B in in 4,0 min, dann 1% Lösungsmittel B in 4,8 min. Unverändert auf 1% Lösungsmittel B für 9 min und dann bis 8% Lösungsmittel B in 6 min. Nach gehe zu 10% Lösungsmittel B in 4 min und 30% Lösungsmittel B in 5 min und bleiben bei 30% Lösungsmittel b für andere 5 min. Sammeln der chromatographischen Peaks, die den beiden diastereomeren Produkte in zwei verschiedene Ampullen. </li><li> Die Extinktion der beiden gesammelten Fraktionen im UV-Spektrophotometer und berechnen die exakte Konzentration auf der Lamber-Beer-Gesetz (A = εlC, wobei A die Extinktion der Extinktionskoeffizient ε und l die Länge der Zelle) basiert. Verwenden Sie die Extinktionskoeffizienten ε von 2&#39;-Desoxyadenosin (Dado) (15.400 M -1 cm -1 bei 260 nm). </li></ol> 6. Synthese von (5&#39;R) - eind (5&#39;S) -5 &#39;,8-cyclo-2&#39;-Desoxyguanosin <ol><li> Man löst 35 mg 8-Brom-2&#39;-desoxyguanosin (8-Br-dGuo) und 30 mg Natriumiodid (NaI) in destilliertem Wasser (100 ml) um 1mm und 2mm Konzentration zu erreichen sind. Regulate Inertgas (Ar oder N 2) fließen mit dem Photoreaktor und füllen Sie den Photoreaktor mit der Reaktionslösung. </li><li> Entgasen das Reaktionsgemisch wie in Verfahren 5 beschrieben (Schritt b). </li><li> Durch UV-Licht bestrahlt Verwendung einer 125W-Mitteldruck-Quecksilberlampe bei 22 ± 2 ° C für 30 min, sammeln die Lösung in einem 250 ml Rundkolben. Waschen Sie den Photoreaktor mit 10 ml Wasser und sammeln Waschungen in der gleichen Flasche. </li><li> Quench das rohe Reaktionsgemisch mit 1 M NH 4 OH-Lösung und dampft das Lösungsmittel im Vakuum. </li><li> Führen Analyse wie in Prozedur 5 beschrieben (Schritte e bis g). Verwenden Sie die Extinktionskoeffizienten ε von 2&#39;-deoxyguanosine (dGuo) (11.700 M -1 cm -1 bei 260 nm). </li></ol> 7. Synthese von Isotopen markiertes Purine (5&#39;R) - und (5&#39;S) -5 &#39;,8-cyclonucleosides <ol><li> Planen 2 ml 1 mM wässrige Lösung (destilliertes Wasser) von den 15 N Isotopen markierten Purinnukleoside ([15N 5] DADO oder [15N 5] dGuo) in einem Glasfläschchen (4 ml) mit einem Septumverschluss. </li><li> Schließen Sie das Fläschchen mit dem Septum und an der Gasleitung (N 2 O für die Sättigung der Lösung) durch eine Nadel in der Scheidewand, die den Boden des Fläschchens erreicht. Eine weitere kurze Nadel im Septum arbeitet als Gasaustritt. </li><li> Spülen Sie die Lösung mit N 2 O für 30 min. Der Gasstrom wird so reguliert, sehr gering sein. </li><li> Die Ausfahrt Nadel ersten herausgenommen und nach 1 &#39;der Lange folgt, um einen kleinen Druck im Inneren des Fläschchens haben. </li><li> Setz die Lösung in der Vorrichtung von gamma Radiolyse für 8 h (Berechnung auf der Grundlage einer Dosisrate ca. 4,5 Gy / min). </li><li> Nach der Reaktion zu stillen das Rohprodukt mit 1 M NH 4 </sub&gt; OH Lösung. </li><li> Führen Hochleistungsflüssigchromatographie-Analyse (HPLC-UV) unter bekannten Bedingungen, 6 und vergleichen Sie das Chromatogramm mit den Standard-Referenzen. </li></ol> 8. Gamma Radiolyse von DNA wässrigen Lösungen <ol><li> Bereiten Sie 1 ml von 0,5 mg / ml Lösung (destilliertes Wasser) von Kalbsthymus-DNA und in einem Glasfläschchen (2 ml) mit einem Septum. </li><li> Entgasen die Reaktion nach Verfahren 7 beschrieben (Schritte bd). </li><li> Setz die Lösung in der Vorrichtung von gamma Radiolyse und 30 min (Berechnung auf der Basis der Dosis / Rate ca.. 4,5 Gy / min). </li></ol> 9. Enzymatische Verdauung von DNA <ol><li> In ein Eppendorf-Röhrchen, enthaltend 80 ug DNA, fügen 8 U von Nuklease P1, 0,01 U von Phosphodiesterase II, 20 nmol EHNA in 20 ul 300 mM Natriumacetat (pH 5,6) und 10 mM Zinkchlorid. Inkubieren der Mischung bei 37 ° C für 48 Stunden. </li><li> Als nächstes fügen Sie eine Mischung aus 8 U alkalischer Phosphatase, 0,02 U phosphodiesterasE I, in 40 ul 0,5 M Tris-HCl-Puffer (pH 8,9) zu Mischung Verdauung. Die Probe wird bei 37 ° C für 2 Stunden inkubiert. </li><li> Das Gemisch wird durch Zugabe von 10% iger Ameisensäure neutralisiert. </li><li> Übertragung der Probe auf eine Amicon Ultra-0.5 Zentrifugalfilter Vorrichtung (cutoff 3 kDa), 200 ul tridestilliertem H 2 O. Legen Sie die Ultra-Filter in den Zentrifugenrotor bei 14.000 xg für 15 min. Dann trennen Sie die Ultra Filter Gerät aus der Mikrozentrifugenröhrchen. Lyophilisieren das Enzym-freie Lösung im Mikrozentrifugenröhrchen. </li></ol> 10. DNA-Probe Entsalzung vor der Analyse <ol><li> Führen Hochleistungsflüssigchromatographie-Analyse (HPLC-UV) mit Trennsäule (siehe Instrumentierung Abschnitt) nach bekannten Bedingungen. 6 </li><li> Lösen des lyophilisierten verdaute DNA in 20 ul H 2 O und injizieren in HPLC-UV. </li><li> Sammeln der Probe in einem Fläschchen nach dem Salzelution (erste Minuten) und gerade vor der Elution time des ersten Nucleosids (5&#39;R-cdGuo), bis zum Ende des chromatographischen Programm. </li><li> Die Probe wird lyophilisiert und resolubilisiert in 20 ul Wasser. </li></ol> 11. LC-MS/MS Quantitative Analysis <ol><li> Bereiten Sie die HPLC-MS/MS (Triple-Quadrupol), bevor die Analyse durch das Laden der analytischen Methode und das Verfahren für den MS-Detektor (ESI). 6 </li><li> Fügen Sie 1 ul der Isotopen-markierten Verbindungen Mischung in der Probe im Verfahren 7 vorbereitet. </li><li> Inject 20 ul der spiked verdaut DNA-Lösung in destilliertem Wasser. </li><li> Die erhaltenen chromatographischen Daten werden auf der Grundlage der bisherigen Kalibrierung mit Referenz-Verbindungen erarbeitet. Eine repräsentative HPLC laufen mit Adenosin und Guanosin-2&#39;-Desoxyribonukleoside und ihre oxidative und Cyclo-Derivaten ist in Abbildung 11 dargestellt. </li></ol>

<ol><li>Ferreri, C., Chatgilialoglu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+lipidomics+and+the+geometry+of+unsaturated+fatty+acids%3A+from+biomimetic+models+to+biological+consequences%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Membrane lipidomics and the geometry of unsaturated fatty acids: from biomimetic models to biological consequences.</a> Methods Molecular Biology. 579, 391-412 (2009).</li>
<li>Chatgilialoglu, C., Ferreri, C., Terzidis, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purine+5%27%2C8-cyclonucleoside+lesions%3A+chemistry+and+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Society+Reviews%22%5BJournal%5D)">Purine 5',8-cyclonucleoside lesions: chemistry and biology.</a> Chemical Society Reviews. 40 (3), 1368-1382 (2011).</li>
<li>Chatgilialoglu, C., Ferreri, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiation-induced+reductive+modifications+of+sulfur-containing+amino+acids+within+peptides+and+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Radiation-induced reductive modifications of sulfur-containing amino acids within peptides and proteins.</a> Journal of Proteomics. 74 (11), 2264-2273 (2011).</li>
<li>Chatgilialoglu, C., Ferreri, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trans+lipids%3A+the+free+radical+path%5BTitle%5D)+AND+%22Accounts+Chemical+Research%22%5BJournal%5D)">Trans lipids: the free radical path.</a> Accounts Chemical Research. 38 (6), 441-448 (2005).</li>
<li>Melchiorre, M., Torreggiani, A., Chatgilialoglu, C., Ferreri, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+markers+of+geometrical+radical+stress%3A+synthesis+of+mono-trans+cholesteryl+esters+isomers+and+detection+in+human+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Lipid markers of geometrical radical stress: synthesis of mono-trans cholesteryl esters isomers and detection in human plasma.</a> Journal of the American Chemical Society. 133 (38), 15184-15190 (2011).</li>
<li>Wang, J., Yuan, B., Guerrero, C., Bahde, R., Gupta, S., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+Oxidative+DNA+Lesions+in+Tissues+of+Long-Evans+Cinnamon+Rats+by+Capillary+High-Performance+Liquid+Chromatography-Tandem+Mass+Spectrometry+Coupled+with+Stable+Isotope-Dilution+Method%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Quantification of Oxidative DNA Lesions in Tissues of Long-Evans Cinnamon Rats by Capillary High-Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry Coupled with Stable Isotope-Dilution Method.</a> Analytical Chemistry. 83 (6), 2201-2209 (2011).</li>
<li>Boussicault, F., Kaloudis, P., Caminal, C., Mulazzani, Q. G., Chatgilialoglu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fate+of+C5%27+radicals+of+purine+nucleosides+under+oxidative+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">The fate of C5' radicals of purine nucleosides under oxidative conditions.</a> Journal of the American Chemical Society. 130 (26), 8377-8385 (2008).</li>
<li>Ferreri, C., Kratzsch, S., Brede, O., Marciniak, B., Chatgilialoglu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trans+lipids+formation+induced+by+thiols+in+human+monocytic+leukemia+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radicals+Biology+%26+Medicine%22%5BJournal%5D)">Trans lipids formation induced by thiols in human monocytic leukemia cells.</a> Free Radicals Biology & Medicine. 38 (9), 1180-1187 (2005).</li>
<li>Zambonin, L., Ferreri, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Occurrence+of+trans+fatty+acids+in+rats+fed+a+trans-free+diet%3A+a+free+radical-mediated+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radicals+Biology+%26+Medicine%22%5BJournal%5D)">Occurrence of trans fatty acids in rats fed a trans-free diet: a free radical-mediated formation.</a> Free Radicals Biology & Medicine. 40 (9), 1549-1556 (2006).</li>
<li>Puca, A. A., Andrew, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatty+acids+profile+of+erythrocyte+membranes+as+possible+biomarker+of+longevity%5BTitle%5D)+AND+%22Rejuvenation+Research%22%5BJournal%5D)">Fatty acids profile of erythrocyte membranes as possible biomarker of longevity.</a> Rejuvenation Research. 11 (1), 63-72 (2008).</li>
<li>Belmadoui, N., Boussicault, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiation-induced+formation+of+purine+5%27%2C8-cyclonucleosides+in+isolated+and+cellular+DNA%3A+high+stereospecificity+and+modulating+effect+of+oxygen%5BTitle%5D)+AND+%22Organic+%26+Biomolecular+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Radiation-induced formation of purine 5',8-cyclonucleosides in isolated and cellular DNA: high stereospecificity and modulating effect of oxygen.</a> Organic & Biomolecular Chemistry. 8 (14), 3211-3219 (2010).</li>
<li>Chatgilialoglu, C., Bazzanini, R., Jimenez, L. B., Miranda, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%285%27S%29-+and+%285%27R%29-5%27%2C8-cyclo-2%27-deoxyguanosine%3A+mechanistic+insights+on+the+2%27-deoxyguanosin-5%27-yl+radical+cyclization%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Research+in+Toxicology%22%5BJournal%5D)">(5'S)- and (5'R)-5',8-cyclo-2'-deoxyguanosine: mechanistic insights on the 2'-deoxyguanosin-5'-yl radical cyclization.</a> Chemical Research in Toxicology. 20 (12), 1820-1824 (2007).</li>
<li>Wang, J., Clauson, C. L., Robbins, P. D., Niedernhofer, L. J., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+oxidative+DNA+lesions+8%2C5%27-cyclopurines+accumulate+with+aging+in+a+tissue-specific+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">The oxidative DNA lesions 8,5'-cyclopurines accumulate with aging in a tissue-specific manner.</a> Aging Cell. 11 (4), 714-716 (2012).</li>
<li>Ferreri, C., Chatgilialoglu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+fatty+acid-based+functional+lipidomics+in+the+development+of+molecular+diagnostic+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Molecular+Diagnostics%22%5BJournal%5D)">The role of fatty acid-based functional lipidomics in the development of molecular diagnostic tools.</a> Expert Review of Molecular Diagnostics. 12 (7), 767-780 (2012).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Die Umwandlung der natürlich vorkommenden cis ungesättigten Fettsäuren auf geometrische trans-Isomere ist eine Transformation mit der Produktion von radikalen Spannung in der biologischen Umgebung verbunden. Zellmembran Lipide, die Fettsäuren enthalten, sind ein relevanter biologische Zielstruktur für radikale Stress und wir zuerst die endogenen cis-trans-Isomerisierung Phospholipide in Zellkulturen, Tieren und Menschen Beurteilung analytische Protokolle in jedem Fall. 8-10 Wir haben gezeigt, dass diese Transformation kann durch eine Vielzahl von S-haltige Verbindungen, darunter Thiole, Thioether und Disulfide, die unter verschiedenen Rest Stressbedingungen können Thiylradikalen erzeugen, dh das Isomerisieren Mittel (Figur 3) eintreten. Das Beispiel in diesem Artikel gezeigt, konzentriert sich auf die Klasse von Cholesterylestern, die einen bekannten Bruchteil Plasmalipide, streng in Lipoprotein-Metabolismus beteiligt repräsentieren. Die Esterbindung zwischen Fettsäuren und choCholesterin wird durch die Übertragung von Fettsäuren von der Position 2 des Glycerineinheit von Phosphatidylcholin zu Cholesterin, ein Schritt durch das Enzym Lecithin Cholesterin Acyl Transferase (LCAT) katalysiert biosynthetisiert. Daher werden Plasma Cholesterylestern strikt Membranlipid Umsatz verbunden und enthalten relativ hohe Anteile an mehrfach ungesättigten Fettsäuren (PUFA) typischerweise in Phosphatidylcholinen, dh Linolsäure und Arachidonsäure. Lipoprotein Bildung wird in kardiovaskulären und metabolischen Erkrankungen beteiligt sind. Die Reaktivität von natürlichen Cholesterylestern mit freien Radikalen kann an den Doppelbindungen Linoleat und Arachidonat-Reste, die in den entsprechenden trans geometrische Isomere umgewandelt werden (siehe Abbildung 1 für die Strukturen) auftreten. Charakterisierung des trans Cholesterylester Gehalt in biologischen Proben ist interessant für Biomarkerentwicklung. Eine indirekte Methode besteht aus der Umwandlung von cholesteryl Ester aus Plasma zu den entsprechenden Fettsäure-Methylester (FAME) und Abtrennung durch gaschromatographische Protokollen isoliert. In diesem Fall wird die Kalibrierung der Standardwerken der cis-und trans-Fettsäuremethylester durchgeführt, um die Quantifizierung der trans-Gehalt in den Proben zu erlauben. Basierend auf den analytischen Studien über die Cholesterylester-Bibliothek durchgeführt wird, haben wir vorgeschlagen, um auch dann eine Methode auf Basis von Raman-Spektroskopie, die durchgeführt werden können direkt auf der Cholesterylester Fraktion aus Plasma isoliert durchgeführt, ohne weitere Derivatisierung zur entsprechenden FAME (siehe Abbildungen 2 und 9). Es ist erwähnenswert, dass bis heute keine erfolgreiche Methoden zu trennen cis-und trans-Isomere der Fettsäure mit Lipiden durch HPLC, wie stattdessen durch Cholesterylester Hydroperoxide beschrieben werden beschrieben. Bisher ist die indirekte Methode der Gaschromatographie immer noch die beste verfügbare Methode so weit. Nach diesem Verfahren der erste quantitative evaluiertation des Mono-trans-Gehalt von Cholesterylestern aus Plasma von gesunden Probanden isoliert abgeleitet bereitgestellt. Mit Flammenionisationsdetektor (FID) die Grenze der Nachweisbarkeit ist zufriedenstellend (ppb) und nanomolaren Mengen der Verbindungen nachgewiesen wurden. 5. Mit verschiedenen Detection-Systeme kann diese Grenze sogar gesenkt werden. Die Wirkung von ionisierender Strahlung auf Cholesterylestern ist Materie weiterer Studien, ob ein lineares Ansprechverhalten relativ zu der applizierten Dosis erhalten wird. Als ein zweites Beispiel, wählten wir modifizierten Nukleoside, die durch freie Radikale verursachten Schäden der DNA erzeugt werden kann. Hydroxylradikale (HO •) sind dafür bekannt, die meisten schädlichen reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) auf ihre Fähigkeit zur chemischen Modifikationen an DNA verursachen. Einzelne oder mehrere Läsionen können auf DNA vorkommen, dass in eukaryotischen Zellen ist in Kern und Mitochondrien. Identifizierung und Messung der wichtigsten Klassen von oxidative erzeugten Schäden an DNA erfordern die approprIATE molekularen Bibliotheken, um die Einrichtung der analytischen Protokolle. Wir konzentrieren uns auf den kleinsten Interesse Tandem Läsionen, die Purin 5 sind &#39;,8-cyclo-2&#39;-Desoxyribonukleosiden, mit einem zusätzlichen kovalenten Bindung zwischen der Basis und der Zuckerreste durch den Angriff freier Radikale erzeugt. Die Verbindungen sind 5 &#39;,8-cyclo-2&#39;-desoxyadenosin und 5&#39;-,8-cyclo-2 &#39;-desoxyguanosin in den bestehenden 5&#39;R und 5&#39;S diastereomeren Formen (Abbildung 5). Ihr Potenzial zur freien Radikalen Stress-Marker geworden ist Sache der Grundlagenforschung. 2 der Tat, wenn DNA HO ausgesetzt ist • radikalen Wasserstoff-Abspaltung aus C5-Position des Zuckers ist eine der möglichen Ereignisse, die zur Entstehung dieser Tandem-Läsionen. Purin 5 &#39;,8-cyclonucleosides kann als Summe von Diastereomeren durch HPLC-MS/MS in enzymatisch verdaut γ-bestrahlten Proben DNA Variieren 1 bis 12 Läsionen / 10 6 Nukleoside / Gy messenden gehen Form in Abwesenheit von Sauerstoff zu physiologischen Niveau von Sauerstoff ichn Gewebe, das Diastereomerenverhältnis 5&#39;R / 5 Seins ~ 4 und ~ 3 für 5 &#39;,8-cdAdo und 5&#39; ,8-cdGuo bzw. (Abbildung 11). 11 Es ist erwähnenswert, dass die Beziehung zwischen Strahlendosis und 5 &#39;,8-cdAdo und 5&#39; ,8-cdAdo Läsionen in der zellulären DNA nachgewiesen ist bei weitem nicht verstanden. Die einzigen Experiment auf 2kGy Bestrahlung basiert berichtet in der experimentellen kann nicht als schlüssig angesehen werden. 11 Weitere Versuche dieser Art und analytische Quantifizierung der vier Läsionen sind für die Festlegung solcher Zusammenhang. Der Nachweis dieser Läsionen und die populäreren oxidativen Transformationen (z. B. 8-oxo-2&#39;-desoxyguanosin, 8-oxodGuo) sind Gegenstand intensiver Untersuchungen, ausweisend die Bedeutung beider Läsionen während oxidativen Stoffwechsels. 6,13 Die Verwendung von HPLC -MS/MS (Triple-Quadrupol) eine Nachweisgrenze nahe 30fmol für alle vier Läsionen. Letzte Verbesserungen behauptet Nachweisgrenzen attomol Ebenen durch das Instrument produ erreichenCERs. Basierend auf der jüngsten Literatur, haben 6 analytischen Verfahren zur ordnungsgemäßen Reinigung der Probe und Bereicherung sind, um die Nachweisgrenzen des MS / MS / MS (ion trap) oder des MS / MS (Triple-Quadrupol) verwendet zu erfüllen in unserem Fall. Bioinspirierte Syntheseverfahren der Verbindungen 1-4 wurden entwickelt ausgehend von 8-Derivate unter bromopurine oder Photolyse. 7,12 Diese Verfahren beinhalten einen Rest Kaskadenreaktion, die DNA-Schäden Mechanismus der Bildung von 5 nachahmt &#39;,8-cdAdo und 5&#39; ,8-cdGuo Läsionen. Aus biologischen Perspektiven, wurde festgestellt, dass diese Läsionen mit zunehmendem Alter bei einer Gewebe-spezifischen Art und Weise (Leber&gt; Niere&gt; Gehirn) ansammeln, was beweist, dass DNA-Reparaturmechanismen unzureichend, um das genetische Material aus dieser Läsionen zu bewahren sind. 13 Tatsächlich Nukleotidexzisionsreparatur (NER) ist der einzige Weg zur Zeit für die Reparatur dieser Läsionen identifiziert. 2 Die Zwei-Klassen-es von Verbindungen in den Abbildungen 1 und 5 dargestellt sind nicht im Handel verfügbar im Moment, aber von den Synthesestrategien in der Literatur beschrieben wäre es nicht schwierig sein, diese Verbindungen für den kommerziellen Einsatz vorbereiten. Der multidisziplinäre Ansatz von chemisch-biologische Studien zur Verfügung gestellt hat nicht nur einen enormen Wert in der Identifikation von neuen Mechanismen vorkommende in der biologischen Umgebung, sondern gibt auch einen wesentlichen Beitrag zur Entdeckung neuer Biomarker und Diagnostik, letztendlich bringt Neuheit im Gesundheits-und Präventionsstrategien. 14 Der chemische Beitrag wird für eine erfolgreiche Entwicklung der molekularen Medizin benötigt, Schaffung integrierter Plattformen und Platten für Metabolic Profiling, die voraussichtlich für eine optimale Rationalisierung der Intervention Design, entweder therapeutische und Ernährung, wodurch Unsicherheiten und Fehler, wenn sie sein können vorhersehbare ermöglichen werden.

Die Reaktivität von freien Radikalen zeigte seine enorme Bedeutung für viele biologische Vorgänge, einschließlich der alternden Gesellschaft und Entzündungen. Heutzutage ist es mehr und mehr deutlich, dass die Klärung der einzelnen chemischen Schritt in diese Reaktivität beteiligten benötigt wird, um die zugrunde liegenden Mechanismen und sehen wirksame Strategien zur Bekämpfung freier Radikale und Reparatur des Schadens zu verstehen. Der Beitrag aus der chemischen Studien ist von grundlegender Bedeutung, aber die direkte Untersuchung in der biologischen Umgebung kann schwierig sein, da die Überlagerung verschiedener Prozesse kompliziert und stört die Prüfung der Ergebnisse und die damit verbundenen Schlussfolgerungen. Deshalb hat sich die Strategie der Modellierung Radikalreaktionen unter biologisch verwandten Erkrankungen zu einem grundlegenden Schritt in der Erforschung der chemischen Mechanismen in der Biologie. In den letzten zehn Jahren unserer Gruppe entwickelten Modelle der radikalischen Prozesse unter biomimetischen Bedingungen. Insbesondere haben wir envisaged biologisch relevanten Transformationen von ungesättigten Fettsäuren, Nukleoside und schwefelhaltigen Aminosäuren und sie in der Spur zu bewerten und als Biomarker für den Gesundheitszustand validiert werden. 1-4 Unsere allgemeine Ansatz besteht aus drei Modulen: <ul><li> Organischen Synthese, die den Zugang zu entsprechend modifizierten Biomolekülen zur Verfügung stellt. Das synthetische Plan kann auch so ausgebildet sein, um die freie Radikale ablaufenden Prozesse in der biologischen Umgebung zu simulieren, damit die Anwendung von Bedingungen in der Lage, den biologischen Prozess von Interesse, die das Prinzip der biomimetischen Radikalchemie simulieren. In biomimetischen Modellen das Reaktionsmedium Wasser oder ein heterogenes Medium aufgrund der Koexistenz von hydrophilen und hydrophoben Kompartimenten. Der Vorteil mit biomimetischen Modellen arbeiten, ist eine vereinfachte Umgebung mit bekannten Reaktionspartner, wo Reaktivität und Produkte in mehr Details untersucht werden können, haben, möglicherweise entdeckenneue chemische Wege. Von diesem Schritt mechanistische und kinetische Informationen können gesammelt werden; </li><li> Reinigung, Analyse und Charakterisierung der Produkte, eine strukturelle und chemische Daten der modifizierten Biomolekülen um molekularen Bibliotheken anzuordnen und zu erleichtern recognition.in die komplexeren biologischen Umgebung. Protokolle werden auch im Hinblick auf die Lösung komplexe Mischungen von Verbindungen, wie die aus biologischen Proben abgeleitet etabliert; </li><li> Biomarker-Entwicklung mit biologischen Proben, entweder durch in vitro Experimente mit Zellkulturen und in vivo Studien von Tieren und Menschen. Die Protokolle in biomimetischen Modelle entwickelt werden dann der komplexe Analysen von Proben angewendet, um die freien Radikale Transformationen unter verschiedenen Bedingungen vorstellbar. Molecular Libraries durch Synthese entwickelten eine enorme Hilfe, um Life-Science-Entdeckungen. Die gesammelten Informationen auf dem freien radikalen Transformationen give die Möglichkeit, herauszufinden, Reparatur-und Präventionsstrategien. Datenbanken der Ergebnisse kann eine sorgfältige Beurteilung durch multivariate Analyse der Biomarker Bedeutung so gut wie möglich assoziierten Faktoren verwendet werden. </li></ul> Wir entschieden uns für zwei Klassen von relevanten Biomarkern, diesen Ansatz zu akkreditieren: Cholesterylestern und Purin 5 &#39;,8-cyclo-2&#39;-Desoxyribonukleoside.

<table><tbody><tr><td colspan="4">MATERIALS</td></tr><tr><td>Cholesteryllinoleat &#8805; 98%</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>C0289-100 mg</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterylarachidonat&#8805; 95% </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8753-25mg</td><td></td></tr><tr><td> 2-mercapt&#8211; thanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250-100 ml</td><td></td></tr><tr><td> 2-Propanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34965-1L</td><td></td></tr><tr><td> Methanol 215 SpS </td><td>Romil</td><td>H409-2,5 L</td><td></td></tr><tr><td> Ethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>02860-2.5L</td><td></td></tr><tr><td> Chloroform SpS</td><td>Romil</td><td>H135 2,5 L</td><td></td></tr><tr><td> n-Hexan 95% SpS</td><td>Romil</td><td>H389 2,5 L</td><td></td></tr><tr><td> Acetonitril 230 SpS</td><td>Romil</td><td>H047 2,5 L</td><td></td></tr><tr><td> Dichlormethan SpS</td><td>Romil</td><td>H2022,5 L</td><td></td></tr><tr><td> Tetrachlorkohlenstoff</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>107344-1L</td><td></td></tr><tr><td> Natriumiodid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>383112-100G</td><td></td></tr><tr><td> Natriumhydrogencarbonat</td><td>Carlo Erba</td><td>478536-500 g</td><td></td></tr><tr><td> Diethylether</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>309966-1L</td><td></td></tr><tr><td> NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653-5KG</td><td></td></tr><tr><td> NaOH fest</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221465-25G</td><td></td></tr><tr><td> NH4OH sol. 28%-30%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221228-1L-A</td><td></td></tr><tr><td> Essigsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320099-500ML</td><td></td></tr><tr><td> Ammonium Cer(IV)sulfatdihydrid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221759-100G</td><td></td></tr><tr><td> Ammonium-Molybdat-Tetrahydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7302-100G</td><td></td></tr><tr><td> Schwefelsäure 95%-98%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320501-1L</td><td></td></tr><tr><td> Silbernitrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>209139-25G</td><td></td></tr><tr><td> Natriumsulfat wasserfrei</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>238597-500G</td><td></td></tr><tr><td> Nuklease P-I aus Penicillium citrinum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N8630-1VL</td><td></td></tr><tr><td> Phosphodiesterase II Typ I-sa </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9041-10UN</td><td></td></tr><tr><td> Erythro-9-(2-hydroxy-3-nonyl)adenin, hc</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E114-25MG</td><td></td></tr><tr><td> Phosphatase alkalisch Typ VII-t aus*bov</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6774-1KU</td><td></td></tr><tr><td> Phosphodiesterase I Typ VI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3134-100MG</td><td></td></tr><tr><td> Desoxyribonuklease II Typ IV aus*Porcin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4138-20KU</td><td></td></tr><tr><td> Trizma(r)-Base, Biotechnologie Leistung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6066-100G</td><td></td></tr><tr><td> EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1644-100G</td><td></td></tr><tr><td> Bernsteinsäure Bioxtra</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3674-250G</td><td></td></tr><tr><td> Calciumchlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5670-100G</td><td></td></tr><tr><td> Ameisensäure, 98 % </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>06440-100ML</td><td></td></tr><tr><td> Amicon Ultra-0,5 Zentrifugalfiltereinheit mit Ultracel-3-Membran</td><td>Millipore</td><td>UFC500324</td><td></td></tr><tr><td> 8-Bromo-2'-Desoxyguanosin</td><td>Berry Associates</td><td>PR3290-1 g</td><td></td></tr><tr><td> 8-Bromo-2'-Desoxyadenosin</td><td>Berry Associates</td><td>PR3300-1 g</td><td></td></tr><tr><td> Natriumiodid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>383112-100G</td><td></td></tr><tr><td> Natriumhydrogencarbonat</td><td>Carlo Erba</td><td>478536-500 g</td><td></td></tr><tr><td> 2'-Desoxyguanosin:H2O (U-15N5, 96-98%)</td><td>Cambridge Isotope Laboratories, Inc</td><td>CILNLM-3899-CA-0.1</td><td></td></tr><tr><td> 2'-Desoxyadenosin (U-15N5, 98%) 95%+ CHEMISCHE REINHEIT</td><td>Cambridge Isotope Laboratories, Inc</td><td>CILNLM-3895-0.1</td><td></td></tr><tr><td> Distickstoffmonoxid (N2O) </td><td>Air Liquide</td><td></td><td></td></tr><tr><td> Desoxyribonukleinsäure aus Kalbsthymus</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D4522-5MG</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">EQUIPMENT</td></tr><tr><td>60Co-Gammacell</td><td>AECL- Canada</td><td>220</td><td></td></tr><tr><td>Immersionswell-Reaktionsmedium Druck 125 Watt </td><td>Photochemische Reaktoren ltd</td><td>Modell 3010</td><td></td></tr><tr><td>Verdampferkolben 250 ml</td><td>Heidolph</td><td>P/N NS 29/32 514-72000-00</td><td></td></tr><tr><td>Luna 5 &mu; m C18(2) 100 &#197;, LC Säule 250 x 4,6 mm </td><td>Phenomenex</td><td>00A-4252-E0</td><td></td></tr><tr><td>Alltima C8 Säule 250 x 10 mm 5 &mu; m</td><td>Grace</td><td>88081</td><td>Semipräparatives</td></tr><tr><td>SecurityGuard-Kit</td><td>Phenomenex</td><td>KJ0-4282</td><td>Analytisches Halterungsset und Zubehör</td></tr><tr><td>Halterung für 10,0 mm ID-Kartuschen</td><td>Phenomenex</td><td>AJ0-7220</td><td>Semipräparative Halterung </td></tr><tr><td>10,0 mm ID-Patronen </td><td>Phenomenex</td><td>AJ0-7221</td><td></td></tr><tr><td>Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) </td><td>Agilent</td><td>1100</td><td></td></tr><tr><td>LC/MS/MS </td><td>Applied Biosystems</td><td>4000QTRAP System</td><td></td></tr><tr><td>Tandem-Massen-ESI-Spektrometer </td><td>(Bruker Daltonics)</td><td>Esquire 3000 plus</td><td></td></tr><tr><td>Fläschchen 2-4 ml </td><td>SUPELCO</td><td>Cod 27516</td><td></td></tr><tr><td>Fläschchen 4 ml </td><td>SUPELCO</td><td>Cod 27517</td><td></td></tr></tbody></table>

free radicals in chemical biology: ab chemisches verhalten, um biomarker entwicklung

Free Radicals in Chemical Biology: from Chemical Behavior to Biomarker Development

Die Einbeziehung von freien Radikalen in den Biowissenschaften hat ständig mit der Zeit erhöht, und hat zu mehreren physiologischen und pathologischen Prozessen in Verbindung gebracht. Dieses Thema umfasst verschiedene wissenschaftliche Bereiche, angefangen bei physikalischen, biologischen und Bioorganische Chemie, Biologie und Medizin, mit Anwendungen auf die Verbesserung der Lebensqualität, Gesundheit und Altern. Multidisziplinäre Fähigkeiten sind für die umfassende Untersuchung der vielen Facetten des radikalen Prozesse in der biologischen Umwelt und chemische Wissen spielt eine entscheidende Rolle bei der Enthüllung grundlegenden Prozesse und Mechanismen erforderlich. Wir entwickelten eine chemische Biologie Ansatz in der Lage, freie Radikale chemische Reaktivität mit biologischen Prozessen zu verbinden, die Informationen über die Reaktionswege und Produkte. Der Kern dieses Ansatzes ist das Design der biomimetischen Modellen Biomolekül Verhalten (Lipide, Nukleinsäuren und Proteine) in wässrigen Systemen zu studieren, erhalten Einblicke in die Reaktionswege sowie eins Aufbau molekularen Bibliotheken der radikalischen Reaktionsprodukte. Dieser Kontext kann erfolgreich zur Entdeckung von Biomarkern verwendet werden, und Beispiele sind mit zwei Klassen von Verbindungen bereitgestellt: mono-trans Isomeren von Cholesterylestern, welche synthetisiert und verwendet werden als Referenz für die Detektion im menschlichen Plasma und Purin 5 &#39;,8-cyclo-2 &#39;-Desoxyribonukleosiden, hergestellt und als Referenz in dem Protokoll für den Nachweis solcher Läsionen in DNA-Proben, nachdem ionisierende Strahlungen oder erhalten von verschiedenen Erkrankungen.

Isomerisierungsverfahren wurde insbesondere für Cholesterylestern Plombierung die Mono-trans Isomeren von Linolsäure und Arachidonsäure in 1 als den ersten Produkten dieses Angriffs gezeigt, die unter Bedingungen der radikalischen Spannung in der biologischen Umgebung auftreten beschrieben. 5 In Abbildung 3 ist die chemische Mechanismus in der cis-trans Doppelbindungsisomerisierung beteiligt gezeigt. Die radikale Quelle wird in einer generischen Weg zur S-zentrierte Radikale leisten angegeben. In den beschriebenen Protokolle der radikale Quelle ist UV-Licht, können homolitically brechen die SH-Bindung in der Thiol-Molekül RSH ist. Abbildung 4 fasst die drei Schritte Protokoll für die Synthese des modifizierten Lipidklasse und ihr Nachweis im menschlichen Plasma: Die Synthese stellt eine biomimetische freie Radikale Prozess und bietet auch eine Ein-Topf komfortable Eingabe der geometrischenrische Isomere, ohne Verunreinigung durch Stellungsisomere gefolgt von Reinigung und Isolierung Protokolle. Mehrere analytischen Methoden können für eine hochempfindliche Nachweis des trans Isomerengehalt und Charakterisierung des Mono-trans Cholesterylester Bibliothek angewendet werden. Insbesondere kann der Raman-Spektroskopie direkt auf dem Cholesterylester Bruchteil durchgeführt werden, ohne Derivatisierung (siehe Abbildung 2 und Abbildung 9). Das zweite Beispiel betrifft Purin 5 &#39;,8-cyclo-2&#39;-Desoxyribonukleosiden, die DNA-Läsionen durch den Angriff freier Radikale auf die Position C5 &#39;des Zuckerteils und anschließende Bildung einer kovalenten Bindung zwischen dem Zucker und der Basis geschaffen sind Reste. Vier Strukturen hergestellt werden können, das heißt, 5 &#39;,8-cyclo-2&#39;-desoxyadenosin und 5&#39;-,8-cyclo-2 &#39;-Desoxyguanosin, sowohl in den bestehenden 5&#39;R und 5&#39;S diastereomeren Formen (Abbildung 5). In Abbildung 6 ter Reaktionsmechanismus gezeigt wird, beinhaltet, dass die Photolyse von 8-bromopurine Derivate 5 zu den entsprechenden C8 Radikal 6, das intramolekular abstrahiert ein Wasserstoffatom von der C5-Position selektiv BIETEN die 2&#39;-deoxyadenosin-5&#39;-yl-Rest 7. Radical 7 cyclisiert mit einer Geschwindigkeitskonstante im Bereich 10 5 -10 6 s -1, 2, gefolgt von Oxidation des Heteroaromat 8 geben die Endprodukte 9. Die Reaktion von Hydroxyl-Radikalen, durch Radiolyse von Wasser erzeugt, mit 2&#39;-Desoxyadenosin, 2&#39;-Desoxyguanosin (10) wurde gefunden, dass ca. auftreten. 10% Wasserstoff-Abspaltung aus C5-Position. 7 Unser Ansatz zur chemischen Biologie der Bibliotheken von Purin 5 &#39;,8-cyclo-2&#39;-Desoxyribonukleosiden (einschließlich markierte Verbindungen) ist in Abbildung 7 dargestellt, mit der Identifizierung dieser Läsionen in Oligonukleotide sowie in DNA-Proben aus va erhalteneschiedenen Quellen, wie sie beispielsweise unter ionisierender Strahlung Bedingungen behandelt, wie imitieren radikaler Stressbedingungen. In Abbildung 8 ein typisches Photoreaktor Gerät sichtbar ist. Das Gerät erlaubt die Bestrahlung von Verbindungen in dem entsprechenden Lösungsmittel gelöst. Es besteht aus: i) der Reaktionskammer mit dem Einlass für das Inertgas (unten) und zwei Einlässe für den Gasaustritt sowie für die Reagenzien zusätzlich ausgestattet, ii) eine innere Kammer, die die geeignete Quecksilberlampe an ein Kühlsystem angeschlossen und die elektrische Leistung, die in die Reaktionskammer durch einen Glasfuge eingesetzt ist. <img alt="Abbildung 1" fo:content-width="6.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50379/50379fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50379/50379fig1.jpg" /> Abbildung 1. Mono-trans-Isomere von Cholesteryl Linoleat und Arachidonat. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = &quot;always&quot;&gt; <img alt="Abbildung 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50379/50379fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50379/50379fig2.jpg" /> Abbildung 2. Cholesterylestern in humanem Serum und direkte Analyse für Mono-trans Isomeren durch Raman-Spektroskopie. <img alt="Abbildung 3" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50379/50379fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50379/50379fig3.jpg" /> Abbildung 3. Die Additions-Eliminierungs-Prozess, der führt zum cis-trans-Isomerisierung von Doppelbindungen durch Thiylradikale. <img src="/files/ftp_upload/50379/50379fig4.jpg" alt="Abbildung 4" /> Abbildung 4. Drei Schritte-Protokoll für die Entwicklung von Mono-trans Cholesterylestern als Biomarker von freien Radikalen Stress. <img alt="Abbildung 5" fo:content-width="6.5in" fo: src = &quot;/ files/ftp_upload/50379/50379fig5highres.jpg&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/50379/50379fig5.jpg&quot; /&gt; Abbildung 5. Die vier Purin 5 &#39;,8-cyclo-2&#39;-Desoxyribonucleosid Diastereoisomere. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50379/50379fig5large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen</a> . <img alt="Abbildung 6" fo:content-width="6.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50379/50379fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50379/50379fig6.jpg" /> Abbildung 6. Erzeugung C5 &#39;Reste, entweder durch Photolyse von 5 oder durch Umsetzung von 10 mit HO • Radikale, und dem Mechanismus der Purin 5&#39; ,8-cyclo-2 &#39;Desoxyribonucleosid Formation. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50379/50379fig6large.jpg" target="_blank">Klicke hier größere Figur anzuzeigen</a> . <img src="/files/ftp_upload/50379/50379fig7.jpg" alt="Abbildung 7" /> Abbildung 7. Protokoll foder Identifizierung von einigen radikalen-basierten DNA-Läsionen; mtDNA: mitochondriale DNA, nDNA: nuclear DNA. <img src="/files/ftp_upload/50379/50379fig8.jpg" alt="Abbildung 8" /> Abbildung 8. Photochemischen Reaktor. <img src="/files/ftp_upload/50379/50379fig9.jpg" alt="Abbildung 9" /> Abbildung 9. Repräsentative Ramanspektrum von Plasma Cholesterylester. Im Einschub dem Vergleich einer bestimmten Region mit Cholesteryl-Linoleat und Cholesteryl Mono-trans Linolsäureisomeren. <img src="/files/ftp_upload/50379/50379fig10.jpg" alt="Abbildung 10" /> Abbildung 10. Vertreter GC-Analyse der FAME aus dem Plasma Cholesterylestern erhalten. <img alt="Abbildung 11" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50379/50379fig11highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50379/50379fig11.jpg" /> &lt;strong&gt; Abbildung 11. Repräsentative HPLC laufen mit 2&#39;-Desoxyadenosin und 2&#39;deoxyguanosine zusammen mit ihren oxidative und Purin 5 &#39;,8-cyclo-2&#39;-Desoxyribo Nucleoside. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50379/50379fig11large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen</a> .

Radical-basierte biomimetische Chemie hat zur Gebäude-up-Bibliotheken, die für Biomarker-Entwicklung angewendet.

Free Radicals in Chemical Biology: ab chemisches Verhalten, um Biomarker Entwicklung

The involvement of free radicals in life sciences has constantly increased with time and has been connected to several physiological and pathological ...

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments besteht darin, Modelle für die Radikalu msetzung von Biomolekülen bereitzustellen. Die chemischen, mechanistischen und analytischen Erkenntnisse können anschließend auf die Biologie, Medizin und die Entdeckung von Biomarkern übertragen werden. Dies wird erreicht, indem zunächst unter durch UV-Licht initiierten Radikalbedingungen geeignet modifizierte Biomoleküle synthetisiert werden.Der synthetische Plan kann auch so gestaltet werden, dass er Freiradikalprozesse simuliert, die in einem biologischen Milieu auftreten, was dem Prinzip der biomedizinischen Radikalchemie entspricht. In einem zweiten Schritt werden die Produkte gereinigt, analysiert und charakterisiert, wodurch strukturelle und chemische Informationen über die modifizierten Biomoleküle gewonnen werden, um molekulare Bibliotheken aufzubauen und die Erkennung in der Komplexität eines biologischen Milieus zu erleichtern. Die verwendeten Protokolle ermöglichen die Trennung komplexer Stoffgemische, wie sie beispielsweise aus biologischen Proben stammen.Schließlich werden In-vitro-Zellkulturen und In-vivo-Studien an Tieren und Menschen verwendet, um Biomarker zu entwickeln. Diese Ergebnisse verdeutlichen die Bedeutung chemisch-biologischer Untersuchungen von Radikalreaktionen für das Verständnis komplexer Umwandlungen, die der Signalübertragung und Schädigungen in lebenden Organismen zugrunde liegen können. Unsere Arbeitsgruppe verfolgt einen interdisziplinären Ansatz, bei dem chemisches Wissen und chemische Methoden auf biologische Prozesse übertragen werden, um Anwendungen im Gesundheitsbereich zu ermöglichen.Wir untersuchen zunächst den chemischen Mechanismus unter Verwendung geeignet gestalteter biomedizinischer Szenarien, für die wir eine Bibliothek von Modifikationen biologisch relevanter Moleküle infolge von Freiradreaktionen entwickeln. Anschließend wechseln wir zu komplexeren Untersuchungen in biologischen Proben unter der Berücksichtigung der Anwesenheit modifizierter Verbindungen als Folge von Angriffen durch freie Radikale. Oftmals fehlen bei oxidativem Stress durch freie Radikale in lebenden Organismen zuverlässige und praktikable chemische Mechanismen, um deren Wirkungen zu erklären.Dieser Ansatz ermöglicht den Austausch chemischer Erkenntnisse mit anderen Disziplinen der Lebenswissenschaften und schafft so eine gemeinsame Grundlage für das umfassende Verständnis biologischer Prozesse. Dies stellt eine äußerst wichtige Ausbildung für die neue Generation von Wissenschaftlern dar, die über einen multi- und interdisziplinären Ansatz verfügen müssen, um die Forschungsherausforderungen der molekularen Wissenschaften im 21. Jahrhundert bewältigen zu können. Die Durchführung der Verfahren wird von den fünf Forschern in unserem Labor demonstriert.Anna, ständige Forscherin in unserem Institut, Michel Postdoc mit einer Förderung des italienischen Bildungsministeriums, Mika sowie Mauri-Stipendiaten und Postdocs in unserer Gruppe, sowie erneut Anna Azi, ebenfalls ständige Mitarbeiterin in unserer Gruppe. Beginnen Sie damit, eine 15 Millimolare CHO-sterile Linoleat-Ester-Propanol-Lösung 15 Minuten lang zu beschallen. Danach überführen Sie die Lösung in einen Quarz-Photochemischen Reaktor und geben 7,6 Mikroliter einer zwei Molaren Lösung von Tumor-Capto-Ethanol in Propanol hinzu.Setzen Sie die Lampe in den Reaktor ein und regulieren Sie den Argon-Fluss. Spülen Sie das Reaktionsgemisch 20 Minuten lang mit Argon durch. Um das Vorhandensein von Sauerstoff in der Lösung zu eliminieren, bestrahlen Sie das Reaktionsgemisch anschließend mit UV-Licht unter Verwendung einer Niederdruck-Quecksilberlampe mit 5,5 Watt bei 22 ± 2 Grad Celsius für vier Minuten, nachdem das UV-Licht ausgeschaltet wurde.Überwachen Sie mittels analytischer Silber-TLC die Bildung der mono-trans-Cholesterylester. Tauchen Sie die TLC-Platte in eine Cericammoniumammoniummolybdat-Lösung und erhitzen Sie sie, bis sich Flecken auf der Platte abzeichnen. Sammeln Sie anschließend das Reaktionsgemisch in einem Rundkolben. Spülen Sie den Reaktor mit wenigen Millilitern 2-Propanol und überführen Sie die Lösung in denselben Kolben. Entfernen Sie das Lösungsmittel mittels Rotationsverdampfung. Reinigen Sie die mono-trans-Isomere des Co-sterin-Linoleat-Esters durch Silber-TLC, wie in der Literatur beschrieben.Verwenden Sie ein Volumenverhältnis von neun zu eins aus Hexan und Diethylether als Eluens nach der Reinigung. Verdünnen Sie ein Milliliter menschliches Serum mit einem Milliliter Sole und geben Sie die Lösung unter einem Argonstrom in einen Trenntrichter. Um Oxidationsaddukte zu vermeiden, geben Sie 10 Milliliter Chloroform-Methanol in den Trenntrichter.Schütteln Sie den Trenntrichter sehr langsam, um die Emulsionsbildung zu begrenzen. Aufgrund des Vorhandenseins von Albumin die beiden Phasen trennen lassen und anschließend die untere organische Phase aus dem Trichter abtrennen. Wiederholen Sie die Extraktion dreimal.Überführen Sie die vereinigten organischen Phasen in den Trichter und waschen Sie sie einmal mit 10 Milliliter Sole. Sammeln Sie die organischen Phasen unter einem Argonstrom in einem Erlenmeyerkolben und geben Sie wasserfreies Natriumsulfat hinzu. Filtern Sie die Lösung durch einen Glasfilter, der mit Watte ausgekleidet ist.Überführen Sie das Filtrat in einen Rundkolben und entfernen Sie die flüchtigen Bestandteile durch Rotationsevaporation. Lösen Sie das rohe Öl in einem Milliliter eines Volumenverhältnisses von zwei zu eins aus Chloroform und Methanol und geben Sie die Lösung unter einem Argonstrom auf eine präparative Dünnschichtchromatographie-Platte. Verwenden Sie ein Gemisch aus Hexan und Ethylether als Laufmittel, kratzen Sie den Silicagelanteil, der die Cholesterinester-Fraktion enthält, ab und überführen Sie ihn in ein Vial.Anschließend dreimal die Silica mit je fünf Milliliter Chloroform/Methanol im Verhältnis 2:1 extrahieren. Die Silica unter Vakuum über einen Büchner-Trichter abfiltern und die organische Phase in einen Rundkolben überführen. Dann das Lösungsmittel abdampfen, um die reinen cho-steroiden Ester zu erhalten.Lösen Sie die Ester im Kolben mit Hexan auf. Überführen Sie die Lösung in ein Vial und verdampfen Sie das Lösungsmittel unter einem Argonstrom. Lagern Sie die chiralen Ester in einem dunklen Vial, das mit Aluminiumfolie abgedeckt ist, unter Argon bei minus 20 Grad Celsius.Der nächste Schritt besteht darin, 33 Milligramm Acht-Bromo-2-Diox-Adenosin in 100 Milliliter Acetonid-Trial zu lösen. Regulieren Sie den Argon-Gasfluss am Boden des Photoreaktors und geben Sie die Lösung hinein. Führen Sie dann eine Nadel durch die Mitte eines Septums und platzieren Sie sie an einem der Reaktorausgänge.Dann verschließen Sie den anderen Photoreaktor-Einlass mit einem weiteren Septum und spülen 30 Minuten lang mit Inertgas. Anschließend stellen Sie den Wasserkreislauf ein und schalten Sie die UV-Lampe ein, nachdem 15 Minuten lang mit UV-Licht bestrahlt wurde, unter Verwendung einer 125-Watt-Quecksilberdampflampe mittleren Drucks bei 22 ± 2 °C.Sammeln Sie die Lösung in einem 250-Milliliter-Rundkolben. Spülen Sie den Photoreaktor mit 10 Millilitern Acetonitril und überführen Sie die Spülflüssigkeit in denselben Kolben. Danach löschen Sie das rohe Reaktionsgemisch mit einmolarer Ammoniumhydroxidlösung ab und verdampfen das Lösungsmittel.Unter Verwendung eines Rotationsverdampfers führen Sie die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie-Analyse mit einer C 18-Analysensäule durch und vergleichen das Profil mit Referenzsubstanzen. Verwenden Sie zwei Millimolar Ammoniumformiat als Lösungsmittel A und ACEDONITE trial als Lösungsmittel B. Sammeln Sie die chromatographischen Peak-Fraktionen, die den beiden DIA-stereomeren Produkten entsprechen, in zwei verschiedenen Dateien. Siehe Textprotokoll für die chromatographischen Bedingungen.Messen Sie die Absorption der beiden gesammelten Fraktionen im UV-Spektrophotometer und berechnen Sie die genaue Konzentration anhand des Lambert-Beerschen Gesetzes. Verwenden Sie den Extinktionskoeffizienten von zwei Prime-De-Adenosin, lösen Sie 35 Milligramm von acht, Promo-Desoxyguanin in 100 Millilitern destilliertem Wasser. Regulieren Sie den Argonstrom und füllen Sie die Probe.Reagieren Sie mit der Reaktionslösung, nachdem das Reaktionsgemisch wie zuvor gezeigt entgast wurde. Bestrahlen Sie mit UV-Licht unter Verwendung einer 125-Watt-Mitteldruck-Quecksilberlampe bei 22 ± 2 °C für 30 Minuten und sammeln Sie die Lösung in einem 250-Milliliter-Rundkolben. Waschen Sie das Produkt mit 10 Milliliter Wasser und überführen Sie die Waschflüssigkeit in denselben Kolben, löschen Sie das rohe Reaktionsgemisch mit einer einmolaren Ammoniumhydroxidlösung ab und verdampfen Sie das Lösungsmittel im Vakuum.Führen Sie die Analyse wie zuvor beschrieben durch. Bereiten Sie ein Milliliter einer 0,5 Milligramm pro Milliliter Lösung von Kalbenthymus-DNA in destilliertem Wasser vor und überführen Sie sie in ein zwei-Milliliter-Glasfläschchen mit Septumverschluss. Verbinden Sie eine ein Zoll lange Nadel mit einer Lachgas-Gasleitung und führen Sie sie durch die Mitte des Septums, bis sie den Boden des Fläschchens erreicht.Danach eine kurze Nadel in die Septum einführen, um den Gasaustritt zu ermöglichen. Die Lösung nach der Entgasung 30 Minuten lang mit Distickstoffmonoxid spülen. Zuerst die kurze Austrittsnadel herausziehen, gefolgt von der einen Zoll langen Nadel, sodass der Druck im Gefäß verbleibt.Überführen Sie die Lösung in das Gerät des Strahlentherapeuten und bestrahlen Sie sie 30 Minuten lang auf ein umgedrehtes DPH-Röhrchen, das 80 Mikrogramm DNA enthält. Geben Sie eine vorgefertigte enzymatische Verdauungsmischung hinzu, die vorsichtig durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren gemischt wird. Inkubieren Sie die Mischung bei 37 Grad Celsius für 48 Stunden.Fügen Sie anschließend eine vorgefertigte Mischung aus alkalischer Phosphatase und Phosphodiesterase in HCL-Puffer der interessierenden Art zu der Verdauungsmischung hinzu, und mischen Sie die Lösung vorsichtig durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren. Inkubieren Sie die Mischung zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius. Neutralisieren Sie die Mischung, indem Sie fünf Mikroliter 10 %iger Ameisensäure zu einem Zentrifugalfilter hinzufügen, der in einem Mikrozentrifugenröhrchen befestigt ist.Fügen Sie die Probe und 200 Mikroliter dreifach destilliertes Wasser hinzu, und zentrifugieren Sie den Inhalt bei 14.000 ×g für 15 Minuten. Trennen Sie anschließend die Filtervorrichtung von der Mikrozentrifugenprobe. Geben Sie Parfum auf die Mikrozentrifugenprobe, und frieren Sie sie in flüssigem Stickstoff ein.Anschließend die enzymesfreie Lösung im Mikrozentrifugenröhrchen lyophilisieren. Der chemische Mechanismus, der an der Cyst-Trans-Doppelbindungsisomerisierung beteiligt ist, wird hier gezeigt. Die Radikalquelle ist generisch dargestellt, um S-zentrierte Radikale zu ermöglichen.Im beschriebenen Protokoll dient UV-Licht als Initiator und holi spaltet die SH-Bindung in Tumor-Capto-Ethanol. Das dreistufige Protokoll zur Entwicklung der modifizierten Lipidklasse umfasst die synthetische Strategie, die Reinigung und Charakterisierung dieser Verbindungen sowie deren Nachweis in menschlichem Plasma. Die Synthese stellt einen biomimetischen Radikalprozess dar und ermöglicht zudem einen einheitlichen, zeitsparenden Zugang zu geometrischen Isomeren, ohne Verunreinigung durch Positions­isomere.Mehrere analytische Methoden können zur hochsensitiven Detektion des trans-Isomer-Gehalts und zur Charakterisierung der mono-trans-veresterten Esterbibliothek verwendet werden. Insbesondere kann die Raman-Spektroskopie direkt an der chiralen Esterfraktion ohne Derivatisierung durchgeführt werden. Ein repräsentatives Raman-Spektrum von Cholesterestern ist hier dargestellt.Die Einlage zeigt einen spezifischen Bereich des Spektrums, der Cho-Cholesterinlinoleat und Cho-Cholesterin-mono-trans-Linolensäure-Isomere Purin Fünf-Prime-Acht-Cyclo vergleicht. Zwei-Prime-Dioxyribonukleotide sind DNA-Läsionen, die durch den Angriff von freien Radikalen an der C-Fünf-Position der Zuckereinheit und anschließende Bildung einer kovalenten Bindung zwischen der Zucker- und der Baseneinheit entstehen. Bei dieser Reaktion können vier DIA-Stereoisomere gebildet werden.Fünf-Prime-acht-Cyclo, Zwei-Prime-Diox-Adenosin und Fünf-Prime-acht-Cyclo, Zwei-Prime-Desoxyguanin, jeweils in den Fünf-Prime-R- und Fünf-Prime-S-Formen vorhanden. Der Reaktionsmechanismus der Photolyse von Acht-Bromo-Purinderivaten ist hier dargestellt. Die Photolyse des Acht-Bromo-Purinderivats fünf ergibt das entsprechende C-Acht-Radikal sechs, das anschließend intramolekular ein Wasserstoffatom aus der C-Fünf-Prime-Position abstrahiert, um selektiv das Radikal sieben zu bilden.Radikal sieben durchläuft eine Cyclisierung, gefolgt von einer Oxidation des heteroaromatischen Radikals acht, wodurch die Verbindung neun entsteht, als Reaktion der Verbindung 10 mit Hydroxylradikalen, die durch die Radiolyse von Wasser erzeugt werden. Es erfolgte etwa zu 10 % eine Wasserstoffabstraktion von der C-5-Position. Der chemisch-biologische Ansatz für die Bibliotheken von Purin-5′,8-cyclo-2′-desoxyribonukleosiden wird hier anhand der Verwendung der zuvor beschriebenen molekularen Bibliothek veranschaulicht, um diese Läsionen in Oligonukleotiden sowie in DNA-Proben aus verschiedenen Quellen zu identifizieren.Ein repräsentatives Beispiel für die LC-analytische Erkennung von DNA-Nukleosiden und ihren oxidativen sowie cyclischen Derivaten wird hier gezeigt. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, dass die Effizienz analytischer Geräte wie L-C-M-S-A-G-C durch Kalibrierung mit Referenzverbindungen angemessen überprüft werden muss. Außerdem ist eine zufriedenstellende Trennung der Verbindung wichtig, wenn eine biologische Probe analysiert wird.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür entwickelt haben, wie man chemische Kenntnisse und experimentelle Fähigkeiten mit biologischen Systemen verbindet und die Identifizierung von molekularen Bibliotheken oder radikalbasierten Modifikationen auf die Entdeckung von Biomarkern und die Beurteilung zellulären Stresses überträgt.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Chemistry

Chemie

Spin-Trapping-ESR-Spektroskopie wurde verwendet, um die Wirkung von pflanzlichen Antioxidantien Lycopin, Pycnogenol und Traubenkernextrakt auf Spülgas-Phase freien Radikale im Zigarettenrauch zu studieren.

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Low-Bereich (L-Band, 1,2 GHz) Elektron paramagnetischen Resonanz mit löslichen Nitroxyl und Trityl Sonden wird zur Beurteilung der physiologisch wichtigen Parameter in den Tumor Mikroumgebung in Mausmodellen von Brustkrebs gezeigt.

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Dieses Manuskript beschreibt die Verwendung von genetisch codierte Fluorogenic Reporter in einer live Cell Imaging-Anwendung für die Prüfung der Harnblase-induzierten oxidativen Stress. Diese experimentelle Ansatz bietet unvergleichliche räumlich-zeitliche Auflösung, Sensitivität und Spezifität vieler die Unzulänglichkeiten der konventionellen Methoden zur Erkennung von toxikologischen oxidativen Stress zu vermeiden.

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Elektron-paramagnetische Resonanz (EPR)-Spektroskopie ist eine eindeutige Methode, freie Radikale zu messen. Die Verwendung von selektive Spin Sonden kann für die Erkennung von freien Radikalen in verschiedenen zellulären Kompartimenten. Wir präsentieren Ihnen eine praktische und effiziente Methode zur biologische Proben zu sammeln, die zu erleichtern, Behandlung, Speicherung und Übertragung von Proben für EPR-Messungen.

Verwendung der Elektron-paramagnetische Resonanz in biologischen Proben bei Umgebungstemperatur und 77 K

Wir beschreiben hier Methoden zur sensiblen und genauen Quantifizierung der Läsionen 8-oxo-7,8-Dihydro-2 '-deoxyguanosine (8-oxodGuo),1, N6-etheno-2 '-deoxyadenosine (1,N6-dAdo) und 1,N2- Etheno-2 '-deoxyguanosine (1,N2-dGuo) in der DNA. Die Methoden wurden zur Beurteilung der Auswirkungen von Umgebungsfeinstaub (PM 2,5) inGeweben (Lunge, Leber und Niere) von exponierten A/J-Mäusen eingesetzt.

Quantifizierung von drei DNA-Mäsionen durch Massenspektrometrie und Bewertung ihrer Niveaus in den Themen von Mäusen, die der zämatten Feinstaub ausgesetzt sind

Das Ziel des Thiobarbitursäure-Reaktivsubstanz-Assays ist es, oxidativen Stress in biologischen Proben zu bewerten, indem die Produktion von Lipidperoxidationsprodukten, hauptsächlich Malondialdehyd, unter Verwendung der Spektrophotometrie der sichtbaren Wellenlänge bei 532 nm gemessen wird. Die hier beschriebene Methode kann auf menschliches Serum, Zelllysate und Lipoproteine niedriger Dichte angewendet werden.

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Die schnelle photochemische Oxidation von Proteinen ist eine aufkommende Technik zur strukturellen Charakterisierung von Proteinen. Verschiedene Lösungsmittelzusätze und Liganden haben unterschiedliche Hydroxyl-Radikal-Aufräumeigenschaften. Um die Proteinstruktur unter verschiedenen Bedingungen zu vergleichen, ist eine Echtzeitkompensation von Hydroxylradikalen, die in der Reaktion erzeugt werden, erforderlich, um die Reaktionsbedingungen zu normalisieren.

Ermöglicht Echtzeitkompensation bei schnellen photochemischen Oxidationen von Proteinen zur Bestimmung von Proteintopographie-Änderungen

Zebrafish targeting reactive electrophiles and oxidants (Z-REX) ist eine auf chemischer Biologie basierende Methode zur Untersuchung reaktiver niedermolekularer Signalwege. Diese Technik kann auf lebende Fische in verschiedenen Entwicklungsstadien angewendet werden. Hier koppeln wir Standard-Assays im Zebrafisch mit Z-REX für die Analyse des Signalwegs.

Überwachung von On-Target-Signalantworten in Zebrafischlarven - Z-REX entschlüsselt präzise Mechanismen elektrophiler Wirkstoffe und Metaboliten

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