4D Imaging von Multimodalität Citrobacter rodentium Infektionen bei Mäusen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, den Null-DU-Infektionszyklus mit Hilfe einer Komposit-Diffuslicht-Bildgebungstomographie mit integrierter Mikro-CT zu überwachen, um einen Vier-D-Film der Infektion zu erstellen. Dies wird erreicht, indem zunächst ein biolumineszierendes bakterielles Inokulum hergestellt wird. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, Mäuse durch orale Sonde mit null Dunum zu infizieren.

Die infizierten Mäuse werden dann täglich mit Hilfe von D-Licht-Mikro-CT abgebildet, und die letzten Schritte bestehen darin, die 3D-DLI-Mikro-CT-Daten zu rekonstruieren und sie zu einem Vier-D-Film des Infektionszyklus zusammenzustellen. Letztendlich können die Ergebnisse die Veränderung der Bakterienlastverteilung und -lokalisation durch die multimodale Vier-D-Bildgebung infizierter Mäuse zeigen. Dr. James Collins.

Ein Postdoc in meinem Labor wird heute das Verfahren demonstrieren: Am späten Nachmittag des Tages vor der Infektion wurde ein Kryo-Fläschchen mit dem Null-Deum-Stamm IC 180 zum Auftauen ausgelegt, sobald es aufgetaut ist, bei einer Kryokugel von Bakterien auf 15 Milliliter Pfund. Mit Dose Mycin stellt man dann die Kultur so ein, dass sie über Nacht bei 37 Grad Celsius wächst und bei 220 U/min geschüttelt wird. Kultivieren Sie außerdem 15 Milliliter ungeimpftes LB, um am nächsten Morgen eine mittlere Kontamination zu verhindern.

Wenn die UN-Impfkontrolle nicht trüb ist, geben Sie die inokulierte Kultur in ein 50-Milliliter-Röhrchen und zentrifugieren Sie sie 10 Minuten lang bei 4.000 U/min. Bei vier Grad Celsius bringen Sie das Pellet in einem Volumen PBS wieder nach oben und wiederholen Sie die Zentrifugation. Dann resuspendieren Sie die Zellen gründlich in 1,5 Millilitern PBS, um das bakterielle Inokulum zu bilden. Um zu überprüfen, ob die ICC 180-Kultur biolumineszierend ist, und um die Anzahl der Bakterien zu schätzen, bilden Sie die Kultur im IVUS-Spektrum-CT mit der Biolumineszenz-Bildgebung mit offenem Filter ab und verwenden Sie die automatische Einstellung im Assistenten 4.3 0.1 für lebende Bilder.

Dies wird in einem zuvor veröffentlichten Video ausführlich beschrieben. Um die Infektion von Mäusen mit biolumineszierenden Nagetieren zu demonstrieren, werden wir eine Maus infizieren und eine Maus für eine Scheininfektion mit PBS verwenden. Betäuben Sie die Maus vor der Durchführung der Infektion mit 3% Fluor unter Verwendung eines XGI-Anästhesiesystems mit acht Jahren, um eine humane Fixierung zu gewährleisten, während die Anästhesie gründlich greift.

Mischen Sie das bakterielle Inokulum und ziehen Sie eine bekannte Anzahl von Bakterien in 0,2 Millilitern in eine Spritze für die Mundsonde. Hol dir nun die erste Maus, die infiziert wird, indem du sie fest an ihrem Genick festhältst. Bitte beachten Sie, dass die Mäuse vor der Bildgebung mit Detory-Creme, wie im Textartikel beschrieben, depletiert wurden, schieben Sie die Nadel über die Zunge in Richtung Gaumen und die Speiseröhre hinunter und injizieren Sie das bakterielle Inokulum in den Magen.

Wenn es einen Widerstand gibt, drücken Sie die Nadel nicht mit Gewalt, da dies das Inokulum in die Lunge einbringt, sondern führen Sie die Nadel vorsichtig wieder ein. Wenn die Maus anschließend Schwierigkeiten beim Atmen oder Gehen hat, sollte sie für die Scheininfektion eingeschläfert werden. Sondierung einer Maus mit 0,2 Millilitern PBS, um zu bestätigen, dass die orale Sonde korrekt durchgeführt wurde.

Bilden Sie die Mäuse in der IVUS-Spektrum-CT mit der Biolumineszenz-Bildgebung mit offenem Filter ab und verwenden Sie die Auto-Einstellung im lebenden Bild. 4.3 0.1 Bildgebungsassistent Wie bereits beschrieben, beinhaltet Delight Micro CT eine optische Bildgebung von Delight, die in einen Mikro-CT-Scan mit niedriger Strahlendosis integriert ist. Da sich die Dosis bei den Tieren jeder Bildgebungssitzung akkumuliert, sind wir bestrebt, die Dosis so niedrig wie möglich zu halten.

Aufgrund dieser Bedenken sollten die Mäuse beim ersten Anzeichen nachteiliger Symptome oder am Ende der Mikro-CT-Bildgebungsphase angerufen werden. Optimieren Sie für diese Studie die Parameter der automatischen Belichtungsfunktion im lebenden Bild 4.3 0.1 für die Abbildung von bakterieller Luziferase in vivo. Wählen Sie zuerst Bearbeiten, dann Einstellungen, dann Aufnahme und dann das Fenster für die automatische Belichtung.

Wählen Sie als Nächstes Bereichswerte gefolgt von der Experimentzeit in Sekunden aus, und legen Sie das Maximum auf 300 Sekunden fest. Wählen Sie abschließend die minimale Zielanzahl gefolgt von Lumineszenz aus und legen Sie diesen Wert auf 10.000 Zählungen fest. Nach der Initialisierung des Systems wurde die Anästhesie eingerichtet und die Röntgen-Sicherheitszuhaltungen überprüft.

Fahren Sie mit der Betäubung einer Maus fort. Verwenden Sie ein XGI eight-Anästhesiesystem mit einer Sauerstoffflussrate von zwei Litern pro Minute und 3 % Fluor. Wenn die Maus für das Imaging bereit ist, öffnen Sie den Imaging-Assistenten in der Software.

Dieses Tool optimiert automatisch mehrere Parameter, um das bestmögliche Signal-Rausch-Verhältnis für jeden ausgewählten Emissionsfilter bereitzustellen. Wenn Sie vom Bildgebungsassistenten dazu aufgefordert werden, schließen Sie die fünf fünfundsechzig, sechsundachtzig und sechs zwanzig Nanometer große Emissionsfilter ein. Stellen Sie dann sicher, dass der Micro-CT-Scan mit einer Maus ausgewählt ist, und klicken Sie auf Erfassen, um die Bildgebung zu starten.

Nachdem Sie die anästhesierte Maus in ihren Käfig zurückgebracht haben, entfernen Sie die eine Maus-Bildgebungsplattform aus dem Spektrum-CT und desinfizieren Sie die Tierplattform mit dem 1%-Tri-Gen. Anmerkung. Bei starker Verschmutzung der Tierplattform kann das Schaumstoffpolster ausgetauscht werden. Fahren Sie bis zu acht Tage nach der Infektion täglich mit der Bildgebung der Mäuse fort, um die longitudinalen Bildgebungsdaten zu generieren.

Längere Versuchszeiten erhöhen die Wahrscheinlichkeit von Artefakten aufgrund der kumulativen Strahlenbelastung. Um qualitativ hochwertige reproduzierbare drei DD light Mikro-CT-Rekonstruktionen herzustellen, sind eine Reihe von Schritten erforderlich. Öffnen Sie zunächst die Live-Image-Software 4.3 0.1 und wählen Sie im Durchsuchen-Fenster die Option Durchsuchen aus.

Öffnen Sie den Ordner mit den delight micro CT-Dateien, indem Sie auf Laden klicken. Öffnen Sie die DLI-Micro-CT-Datei im Lebendbild-Browser. Siehe zum Beispiel Deum Tag sieben nach der Infektion.

Wählen Sie in der Werkzeugpalette die Option Oberflächentopografie und dann die nackte Maus aus. Passen Sie den Schwellenwert an, und klicken Sie dann auf Oberfläche generieren. Wenn die Oberflächenrekonstruktion erfolgreich ist, wird ein Oberflächenumriss im 3D-Ansichtsfenster angezeigt.

Um den gerenderten Mikro-CT-Scan im 3D-Ansichtsfenster anzuzeigen, blenden Sie entweder den Oberflächenumriss aus oder verringern Sie die Deckkraft der Oberfläche. Beide Optionen werden aufgerufen, indem Sie zuerst optische 3D-Werkzeuge auswählen. Deaktivieren Sie dann entweder das Anzeigeoberflächenobjekt oder passen Sie den Deckkraftregler an, um eine detaillierte anatomische Lokalisierung der drei DD-Lichtrekonstruktionen zu ermöglichen.

Ändern Sie in Bezug auf das Tierskelett die volumetrischen 3D-Daten. Um das Skelett mit optimalem Kontrast anzuzeigen, klicken Sie auf 3D-Multimodalitätswerkzeuge und stellen Sie den Schieberegler für das Histogramm nach rechts ein, bis nur noch die Bones deutlich sichtbar sind. Klicken Sie dann, falls noch nicht ausgewählt, auf logarithmisches Histogramm, Umkehren der Farbgebung, Verlauf, Beleuchtungsqualität und Entrauschen.

Falls gewünscht, schneiden Sie das Bild zu, um unerwünschte Strukturen aus der 3D-Rekonstruktion zu entfernen. Wählen Sie in der Werkzeugpalette die Option D-Licht-3D-Rekonstruktion. Stellen Sie sicher, dass nur die fünf fünfundsechzig, sechsundsechzig, sechsundzwanzig Nanometerfilter ausgewählt sind. Klicken Sie dann auf Start.

Es öffnet sich das Datenvorschaufenster mit den spektral gefilterten Biolumineszenzsignalen der Maus, die in 2D abgebildet wurden. Diese Signale werden von der Software automatisch mit einem Schwellenwert versehen, können aber bei Bedarf manuell über die Registerkarten am unteren Rand des Menüs angepasst werden. Der Schwellenwert bestimmt die minimale Datenintensität, die als Daten in die Rekonstruktion einbezogen wird.

Wählen Sie als Nächstes aus der Werkzeugpalette die D light micro CT 3D-Rekonstruktion aus und überprüfen Sie die optischen Eigenschaften. Mit einem Klick auf die Registerkarte Eigenschaften sollten die Gewebeeigenschaften auf Mausgewebe und das Quellspektrum auf Bakterien eingestellt werden. Klicken Sie nun auf Rekonstruieren, um die D-Licht-Rekonstruktion durchzuführen.

Die tatsächliche Position des rot eingekreisten D-Lichtsignals befindet sich innerhalb des Beckengürtels. Dies ist leichter zu interpretieren, wenn sich das Bild während des Films dreht. Um den DLI-Micro-CT-3D-Film zu generieren, gehen Sie zum Werkzeugmenü und wählen Sie 3D-Animationsvorgabenanimationen, Achse gegen den Uhrzeigersinn und dann Gesamtdauer.

Legen Sie diesen Wert auf 10 Sekunden oder 25 Bilder pro Sekunde fest. Sobald die Einstellungen für die 3D-Animation korrekt sind, drücken Sie auf Aufnahme und speichern Sie die DLI micro CT 3D-Rekonstruktionen als VI-Dateien. Es ist wichtig, diese Rekonstruktionen mit identischen Einstellungen vorzunehmen, damit sie vergleichbar sind.

Es ist auch wichtig, die Videos mit der gleichen Anzahl von Bildern pro Sekunde und Gesamtdauer zu erstellen. Andernfalls ist das Timing des 40-Videos nicht homogen. Öffnen Sie auf dem Computer Windows Live Movie Maker, und erstellen Sie eine neue Datei.

Fügen Sie die DLI-Mikro-CT-Rekonstruktionen in chronologischer Reihenfolge ab dem ersten Tag nach der Infektion ein. Fügen Sie auf der Registerkarte "Tools" am Anfang jedes Videos Untertitel hinzu, indem Sie das Video auswählen, "Start" und dann "Untertitel hinzufügen" auswählen. Der Text in der Beschriftung kann über die Symbolleiste formatiert werden, und die Position der Beschriftung ist ebenfalls anpassbar.

Fügen Sie nun eine Titelseite hinzu, indem Sie auf Startseite und dann auf Titel klicken. Geben Sie Ihren Titel in das Feld ein, indem Sie die Symbolleiste verwenden, um den Text zu formatieren. Speichern Sie als Nächstes das Projekt als MMP-Datei.

Dies ist unerlässlich, wenn Sie den Film ändern möchten. Speichern Sie schließlich den Film als WMV-Datei aus dem Movie Maker-Menü, wählen Sie Film speichern und wählen Sie die vier Steuerelemente für die Computeroption, die für eine gute Technik unerlässlich sind. Vor der Infektion von Mäusen wurde das verwendete bakterielle Inokulum als biolumineszierend bestimmt.

Nach der oralen Sonde mit Biolumineszenz siehe Nagetier wurde überprüft, ob das Signal im Magen des Tieres, dargestellt durch eine weiße Pfeilspitze, beobachtet werden konnte und in der Lunge fehlte. Dieselbe Maus wird in nachfolgenden Beispielen einer einzelnen Infektion gezeigt. Zero Denture ist ein extrazellulärer Krankheitserreger, der während der nachgewiesenen Infektion auf das Darmlumen beschränkt ist.

Es wird also mit dem Kot ausgeschieden, der analysiert wurde, um zu zeigen, dass die Besiedlung vom zweiten Tag bis zum sechsten oder siebten Tag zunimmt, wenn die Infektion täglich ihren Höhepunkt erreicht. Die D-Licht-Mikro-CT wurde verwendet, um die räumliche Verteilung von biolumineszierenden Bakterien in dieser Maus anhand des Skeletts als anatomische Referenz zu bewerten. Am dritten Tag, nach der Infektion, wurden kleine biolumineszierende Herde im Dickdarm beobachtet, die durch einen blauen Pfeil dargestellt sind.

Diese Herde zeigten einen moderaten Anstieg der Biolumineszenzintensität am fünften Tag nach der Infektion, mit geringer Veränderung in der räumlichen Verteilung am siebten Tag nach der Infektion, es gab einen signifikanten Anstieg der Biolumineszenz und die Biolumineszenzherde verteilten sich über den gesamten Dickdarm. Drei DD-Light-Mikro-CT-Rekonstruktionen vom ersten bis achten Tag nach der Infektion veranschaulichen die Ausbreitung der Sero Deum-Infektion. Die bakterielle Infektion beginnt als unterschiedliche Herde innerhalb des proximalen Gastrointestinaltrakts.

Am dritten Tag breitet sich die Infektion auf den Dickdarm aus. In den nächsten Tagen breiteten sich die Infektionsherde weiter aus und nahmen an Größe und Zahl zu. Die Infektion erreicht am siebten Tag ihren Höhepunkt.

Am achten Tag wurden die Kolonien dann auf zwei unterschiedliche Bakterienherde im proximalen und distalen Dickdarm reduziert. Diese Technologie wird es den Forschern ermöglichen, den Mechanismus der bakteriellen Besiedlung und Infektion in Echtzeit zu untersuchen und die Wirksamkeit von Interventionsstrategien zu untersuchen.