Name: 4D Imaging von Multimodalität Citrobacter rodentium Infektionen bei Mäusen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 38 s
Description: Erfahren Sie die 4D-Bildgebung von Citrobacter rodentium-Infektionen bei Mäusen mittels diffuser Licht-Tomographie und Mikro-CT. Diese Methode ermöglicht die Echtzeitüberwachung bakterieller Kolonisierung in vivo.

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Die in-vivo-Bildgebung Anlage am Imperial College wurde von der MRC finanziert.

<ol><li>Chang, M. H., Cirillo, S. L., Cirillo, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+Luciferase+to+Image+Bacterial+Infections+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Using Luciferase to Image Bacterial Infections in Mice.</a> J. Vis. Exp. (48), e2547(2011).</li>
<li>Wiles, S., Pickard, K. M., Peng, K., MacDonald, T. T., Frankel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+bioluminescence+imaging+of+the+murine+pathogen+Citrobacter+rodentium%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">In vivo bioluminescence imaging of the murine pathogen Citrobacter rodentium.</a> Infect Immun. 74, 5391-5396 (2006).</li>
<li>Wiles, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ+specificity%2C+colonization+and+clearance+dynamics+in+vivo+following+oral+challenges+with+the+murine+pathogen+Citrobacter+rodentium%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Organ specificity, colonization and clearance dynamics in vivo following oral challenges with the murine pathogen Citrobacter rodentium.</a> Cell Microbiol. 6, 963-972 (2004).</li>
<li>Wiles, S., Dougan, G., Frankel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergence+of+a+%27hyperinfectious%27+bacterial+state+after+passage+of+Citrobacter+rodentium+through+the+host+gastrointestinal+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Emergence of a 'hyperinfectious' bacterial state after passage of Citrobacter rodentium through the host gastrointestinal tract.</a> Cell Microbiol. 7, 1163-1172 (2005).</li>
<li>Fanning, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bifidobacterial+surface-exopolysaccharide+facilitates+commensal-host+interaction+through+immune+modulation+and+pathogen+protection%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Bifidobacterial surface-exopolysaccharide facilitates commensal-host interaction through immune modulation and pathogen protection.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 2108-2113 (2012).</li>
<li>Doyle, T. C., Burns, S. M., Contag, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+bioluminescence+imaging+for+integrated+studies+of+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">In vivo bioluminescence imaging for integrated studies of infection.</a> Cell Microbiol. 6, 303-317 (2004).</li>
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<li>Contag, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photonic+detection+of+bacterial+pathogens+in+living+hosts%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Photonic detection of bacterial pathogens in living hosts.</a> Mol. Microbiol. 18, 593-603 (1995).</li>
<li>Hardy, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+replication+of+Listeria+monocytogenes+in+the+murine+gall+bladder%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Extracellular replication of Listeria monocytogenes in the murine gall bladder.</a> Science. 303, 851-853 (2004).</li>
<li>Szittner, R., Meighen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleotide+sequence%2C+expression%2C+and+properties+of+luciferase+coded+by+lux+genes+from+a+terrestrial+bacterium%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Nucleotide sequence, expression, and properties of luciferase coded by lux genes from a terrestrial bacterium.</a> J. Biol. Chem. 265, 16581-16587 (1990).</li>
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<li>Mundy, R., MacDonald, T. T., Dougan, G., Frankel, G., Wiles, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Citrobacter+rodentium+of+mice+and+man%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Citrobacter rodentium of mice and man.</a> Cell Microbiol. 7, 1697-1706 (2005).</li>
<li>Curtis, A., Calabro, K., Galarneau, J. R., Bigio, I. J., Krucker, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+variations+of+skin+pigmentation+in+C57BL%2F6+mice+affect+optical+bioluminescence+quantitation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Imaging+Biol%22%5BJournal%5D)">Temporal variations of skin pigmentation in C57BL/6 mice affect optical bioluminescence quantitation.</a> Mol. Imaging Biol. 13, 1114-1123 (2011).</li>
<li>Wiles, S., Crepin, V. F., Childs, G., Frankel, G., Kerton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+biophotonic+imaging+as+a+training+aid+for+administration+of+substances+in+laboratory+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim%22%5BJournal%5D)">Use of biophotonic imaging as a training aid for administration of substances in laboratory rodents.</a> Lab Anim. 41, 321-328 (2007).</li>
<li>Crepin, V. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+the+role+of+the+Tir%3ANck+and+Tir%3AIRTKS%2FIRSp53+signalling+pathways+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Dissecting the role of the Tir:Nck and Tir:IRTKS/IRSp53 signalling pathways in vivo.</a> Mol. Microbiol. 75, 308-323 (2010).</li>
<li>Willekens, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+radiation+dose+in+micro-CT+with+optimization+of+the+scan+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22ContrastMedia+Mol.+Imaging%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the radiation dose in micro-CT with optimization of the scan protocol.</a> ContrastMedia Mol. Imaging. 5, 201-207 (2010).</li>
<li>Boone, J. M., Velazquez, O., Cherry, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-animal+X-ray+dose+from+micro-CT%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Imaging%22%5BJournal%5D)">Small-animal X-ray dose from micro-CT.</a> Mol Imaging. 3, 149-158 (2004).</li>
<li>Sato, F., Sasaki, S., Kawashima, N., Chino, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Late+effects+of+whole+or+partial+body+x-irradiation+on+mice%3A+life+shortening%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Radiat.+Biol.+Relat.+Stud.+Phys.+Chem.+Med%22%5BJournal%5D)">Late effects of whole or partial body x-irradiation on mice: life shortening.</a> Int. J. Radiat. Biol. Relat. Stud. Phys. Chem. Med. 39, 607-615 (1981).</li>
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</ol>

Produktion und den freien Zugang zu diesem Artikel ist durch PerkinElmer gesponsert. Die Autoren Kevin P, Francis, Jeff Meganck und Chaincy Kuo sind Mitarbeiter von Caliper-A PerkinElmer Company. Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Tiere Scientific Procedures Act 1986 durchgeführt und wurden von der lokalen Ethikkommission genehmigt.

Die 4D-Film von bakteriellen Infektionen bietet ein nützliches Werkzeug zur Visualisierung und Interpretation großer Mengen von Multi-Bildgebung Daten schnell und einfach. Diese Technik erleichtert die detaillierte Analyse, wie eine Infektion breitet sich durch eine individuelle Maus und können verwendet werden, um zu untersuchen, wie Deletion von Host oder bakterielle Gene oder insbesondere Interventionsstrategien Wirkung Keimbelastung, Verteilung und Lokalisierung in einer longitudinalen Studie 7. Diese Videos auch nützliche Lehrmittel und ein Mittel zur Verbreitung von Informationen an die Öffentlichkeit. Es gibt mehrere wichtige Schritte in diesem Protokoll, das die Qualität der Daten aus DLIT-μCT Bildgebung und die Fähigkeit, ein 4D Video der Infektion kompilieren erhalten beeinträchtigen könnten. Der wichtigste Teil dieses Protokolls ist die erfolgreiche und homogene Infektion von Mäusen mit C. rodentium. Es ist wichtig, dass die Mäuse für die Studie verwendet zwischen 18-20 g sind, und dass die Bakrial Impfkulturen werden frisch zubereitet und ca. 5 x 10 9 KBE, wie zuvor beschrieben, 2,3. Vor Infektion der Mäuse ist es wichtig zu überprüfen, dass der Impfstoff mit dem Biolumineszenz Spectrum CT und einmal das Inokulum hergestellt worden ist, muss sie kontinuierlich homogenisiert werden, bevor jede Maus ist eine Sonde, um sicherzustellen, dass die Mäuse ähnlich infektiösen Dosen erhalten. Die DLIT-μCT Bildgebung von Mäusen wurde optimiert, so dass die automatische Belichtung Funktion im lebenden Bild 4.3.1 Software ermittelt automatisch die optimalen Bildparameter für das Signal weit über dem Lärm. Allerdings stützt sich die automatische Belichtung Funktion auf benutzerdefinierten Einstellungen und Parameter, die modifiziert werden, wie in dem Verfahren beschrieben werden müssen. Gelingt dies nicht, wird in schlechten Bilder mit einer geringen Anzahl von Photonen gesammelt, die nicht in einem offensichtlichen Fortschreiten der Infektion führen, wie das Spektrum der CT Werkseinstellungen für Belichtungsautomatik für die Bildgebung Tumore exprimieren programmiert führenGlühwürmchenluciferase. Renovationen durchgeführt mit 560-620 nm geben die beste Übereinstimmung zwischen simulierten und gemessenen Daten, und daher sind die zuverlässigere Daten zu enthalten in der Rekonstruktion. Eine Beschränkung auf die Verwendung von DLIT-μCT ist, dass ionisierende Strahlung aus der μCT Scan bewirkt subletale Strahlenschäden, die kumulativ über einer longitudinalen Studie 18 ist. Sub-tödliche Strahlung können zu einer Schwächung der Immunreaktion, DNA-Schäden verursachen, und die Apoptose in den inneren Organen 19. Letztlich kann kumulative subletale Strahlenschäden zum Tod führen, wenn die LD 50/30 für ionisierende Strahlung überschritten wird, die zwischen 5-7 Gy in Abhängigkeit von der Maus-Stamm und Alter der Mäuse verwendet 18,20,21. Obwohl einige der molekularen Schäden durch ionisierende Strahlung kann heilen, da das übergeordnete Prinzip ist Dosis vorsichtiger Einschätzung wird dies in der Regel nicht für die in der Studie Planung berücksichtigt. Stattdessen ist es das Ziel, so weit bel bleibenow diese Grenzen wie möglich, während noch das Erreichen der Lernziele. Dies ist besonders wichtig in dieser Studie wegen der normalen Immunantwort auf die Infektion, kann die Frequenz der Bildverarbeitung und der Tatsache, dass transgene, Immuno-besteht, oder stark infizierten Tieren anfälliger gegenüber ionisierender Strahlung. Bei der Planung der Versuch, eine 4D-Film der Infektion zu erzeugen, ist es wichtig, die Dauer des Experiments betrachten, scannt die Anzahl der in diesem Zeitraum μCT erforderlich, und die LD 50/30 für ionisierende Strahlung für die Maus-Stamm verwendet wird. Eine weitere mögliche Einschränkung DLIT-μCT ist die Stärke der Reporterexpression in den Bakterienstamm verwendet, da diese Bakterien Nachweisgrenzen und Aufnahmezeiten beeinflussen. Es wird dringend empfohlen, dass die Forscher verwenden Bakterienstämme, die voll virulent sind validiert, aber optimiert für maximale lux-Operon Ausdruck, wie zuvor für BLI nachgewiesen2,3. Eine Einschränkung auf die aktuelle Gestaltung der 4D-Bildgebung ist, dass jeder Film der einzelnen DLIT-μCT Scans, die unterschiedliche Skalierung haben Photonen besteht. Dies kann die Bilder schwer zu interpretieren, wenn die Änderungen an der Lokalisierung der Brennpunkte BL oder seine Intensität subtil sind, oder wenn es einen intensiven Fokus BL durch mehrere schwache Herde umgeben. Daher ist für Längs Visualisierungen, ist es wichtig, dass die Farbbalken konsistent zu Zeitpunkten. Das Konzept eines 4D-Film der Infektion kann zu einem entsprechend gekennzeichneten bakteriellen Krankheitserreger eingesetzt werden. Zukünftige Entwicklung dieser Technik wird darauf abzielen, Fluoreszenz-Imaging-Tomographie (FLIT) sowie DLIT verwenden, um die Untersuchung der Host Reaktionen auf Infektion mit einer Kombination von Biolumineszenz bakterielle Erreger und injizierbare fluoreszierenden Nahinfrarot-Sonden, um Host-Reaktionen auf Infektionen untersuchen zu erleichtern. Darüber hinaus, in diesem Protokoll wir nurbeschreiben die Verwendung von Biolumineszenz Bakterien 4D Filme der Infektion erstellen. In einigen Fällen kann es erforderlich sein, fluoreszenzmarkierten Bakterien, beispielsweise mit iRFP markiert, so dass die Biolumineszenz Reporter zur Untersuchung Wirtsgenetik während der Infektion verwendet werden können. Wichtig ist, dass die Verwendung von Multi-Bildgebung kombiniert DLIT / FLIT-μCT es uns ermöglichen, nicht-invasiv zu untersuchen mehrere Parameter während einer bakteriellen Infektion, die einen bedeutenden Beitrag zur Reduzierung, Verfeinerung und Ersatz der Verwendung von Tieren in der wissenschaftlichen Forschung wie in der NC3R Initiative (umrissen <a href="http://www.nc3rs.org.uk/" target="_blank">http://www.nc3rs.org.uk/</a> ).

Kleine Tiermodellen, insbesondere solche Verwendung Mäusen, werden routinemäßig verwendet, um bakterielle Pathogenese zu untersuchen oder zu Interventionsstrategien gegen Infektionen, wie z. B. Antibiotika, Probiotika, Präbiotika und Impfstoffe 1-7 zu testen. Die wichtigsten experimentellen Positionsanzeigen von Kleintier-Infektionen sind Erreger Last, räumlichen und zeitlichen Lokalisierung der Infektion und Änderungen an der Immunantwort des infizierten Organismus. In vivo optische Bildgebung ist ein wertvolles Werkzeug für die Erforschung infektiöser Krankheiten und kann zur Überwachung eingesetzt werden mehrere experimentelle Auslesen durch die Verwendung von Reportergenen (Luciferase, fluoreszierenden Proteinen, beta-Lactamase, etc), fluoreszierende Farbstoffe, Nanopartikel oder chemilumineszierende Sonden an ein Protein, biologische Verfahren oder Mikroorganismus 6 ausgerichtet. Biolumineszenz-Bildgebung (BLI) ein optisches bildgebendes Verfahren verwendet, um die Kolonisierung von kleinen Tieren wie Ratten und Mäusen zu überwachen, die durch pathogene Bakria 3,6,8,9. Die Mäuse werden mit rekombinanten Bakterien exprimieren eine Luciferase, wie die lux-Operon aus Photorhabdus CDABE luminescens. Diese Bakterien können dann durch die Lichterzeugung mit einer CCD in vivo bildgebenden Systems 3,6,9 Basis detektiert werden infiziert. Wichtig ist, dass nur metabolisch aktiven Mikroorganismen Biolumineszenz (BL), was bedeutet, einzig gangbare Bakterienzellen durch diese Methodik 10,11 detektiert werden. Mit 2D BLI, die Lage des BL Quelle von der Oberfläche des Tieres in dem das Signal ausgesendet 8 geschlossen wird. Die genaue anatomische Lokalisierung der BL Foci in vivo durch die ex vivo-Analyse von Organen 3,6,9 dagegen bestimmt werden kann zusammengesetzten 3D diffuse Licht Bildgebung Tomographie (DLIT) verwendet, um eine quantitative 3D-Rekonstruktion des BL zusammenstellt Quelle 12. DLIT wird durch das Sammeln von BL aufgenommenen Bilder unter Verwendung von definierten engen Bandpass-Filter und optischeanschließend Eingabe in eine diffuse optische Tomographie 3D-Rekonstruktion Algorithmus 1,7,12,13. Derzeit ist multi-Bildgebung die einzige Methodik für echte, nicht invasive anatomische Lokalisierung der Biolumineszenz-Foci in vivo, ohne die Notwendigkeit für ex vivo-Analyse erhalten. Kürzlich haben wir eine Kombination von DLIT mit μCT Bildgebung Zusammenarbeit registriert Citrobacter rodentium (C. rodentium) Kolonisation Dynamik nach prophylaktischen Behandlung mit einem probiotischen Bakterium 7 zu bewerten. C. rodentium ist ein Maus-spezifischen magensaftresistente Erreger verwendet, um Modell Infektion mit enteropathogenen und enterhemorrhagic Escherichia coli 14. C. rodentium Infektion verursacht ulcerosa, in der Regel mit leichten Gewichtsverlust, Durchfall, polarisierte Th1 Immunantwort und verschiedene pathologische Veränderungen, einschließlich Kolon Kryptenhyperplasie und Befestigen und zurückhaltend Läsion formati verbundenon 14. Zusätzlich zu diesem, C. rodentium Pathogenese wurde gründlich studiert mit BLI und seine Besiedlung Dynamik in C57BL/6J-Mäusen sind gut dokumentiert, so dass dieses Bakterium ein ideales Modell Mikroorganismus für die Verwendung mit Multi-Bildgebung 3,4,7. Dieses Protokoll ist das erste, eine Methodik zur integrierten DLIT-μCT Bildgebung von einer bakteriellen Infektion mit einem einzigen multimodalen Imaging-Plattform, die IVIS Spectrum CT, und die Erzeugung eines 4D-Film zeigt die wahre Dynamik dieser Infektion nicht-invasiv zu skizzieren.

<table><tbody><tr><td>Biolumineszierend C. rodentium</td><td>Frankel lab</td><td>ICC180</td><td>Wiles et al., 2004</td></tr><tr><td>Veet</td><td>Boots</td><td></td><td>Die optimale Enthaarungszeit beträgt 7 min. Die Enthaarung funktioniert besser, wenn die Creme gut eingerieben wird.</td></tr><tr><td>Isofluoran (100% v/v)</td><td>Abbott</td><td>B506</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Medizinischer Sauerstoff</td><td>BOC Medizinische</td><td></td><td>Größe F Zylinder. <stark>Hinweis: </stark> ein entsprechender Regler ist erforderlich.</td></tr><tr><td>Luria Bertani Brühe</td><td>Merck</td><td>1.10285.0500</td><td>25 g in 1L demineralisiertem Wasser.</td></tr><tr><td>Luria Bertani agar</td><td>Merck</td><td>1.10283.0500</td><td>37 g in 1L demineralisiertem Wasser.</td></tr><tr><td>Kanamycinsulfat</td><td>Sigma (Fluka)</td><td>60615</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>50 ml konische Falcon-Röhrchen aus Polypropylen</td><td>BD (Falcon)</td><td>352070</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Universals</td><td>Corning (Gosselin)</td><td>E5633-063</td>&<td>nbsp;</td></tr><tr><td>1 ml Spritze</td><td>BD (Plastipak)</td><td>300013</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Orale Dosiernadel (16G x 75 mm) gebogen</td><td>Vet Tech</td><td>DE005</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Mikrobanken (Kryovial)</td><td>Pro-Lab Diagnostics</td><td>PL.170/Y</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>IVIS Spectrum</td><td>CT Messschieber - ein PerkinElmer Unternehmen</td><td>133577 Rev A/ Spectrum CT</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>6kVA USV-Messschieber</td><td>- ein PerkinElmer Unternehmen</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>XGI-8 Anästhesiesystem</td><td>Messschieber - ein PerkinElmer Company</td><td>118918</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>XAF-8 Anästhesiefilter Aktivkohle</td><td>Messschieber - a PerkinElmer Company</td><td>118999/00</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Living Image v4.3.1 SP1</td><td>Messschieber - ein Unternehmen</td><td></td> von PerkinElmer<td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Tisch-Schüttel-Inkubator</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>Innova 44</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4"> </td></tr></tbody></table>

4d imaging von multimodalität<em&gt; citrobacter rodentium</em&gt; infektionen bei mäusen

4D Multimodality Imaging of Citrobacter rodentium Infections in Mice

Dieses Protokoll beschreibt die notwendigen Schritte, um in Längsrichtung Überwachung eines Biolumineszenz bakterielle Infektion mit Composite 3D diffuses Licht Bildgebung Tomographie mit integriertem μCT (DLIT-μCT) und die anschließende Verwendung dieser Daten einen vierdimensionalen (4D) Film der Infektion Zyklus zu erzeugen. Um die Infektion 4D-Filme zu entwickeln und die DLIT-μCT Bildgebung für bakterielle Infektion Studien unter Verwendung eines IVIS Spectrum CT validieren, haben wir eine Infektion mit C. Biolumineszenz rodentium, die selbst limitierende Kolitis bei Mäusen verursacht. In diesem Protokoll, skizzieren wir die Infektion von Mäusen mit Biolumineszenz C. rodentium und nicht-invasive Überwachung der Kolonisierung durch tägliche DLIT-μCT Bildgebung und bakterielle Aufzählung von Fäkalien für 8 Tage. Die Verwendung des IVIS Spectrum CT eine nahtlose Co-Registrierung von optischen und μCT Scans mit einer einzigen Bildgebungsplattform. Die geringe Dosis μCT Modalität ermöglicht die Bildgebung von Mäusenzu mehreren Zeitpunkten während der Infektion mit detaillierten anatomischen Lokalisation der Biolumineszenz bakterielle Herde in 3D, ohne dass Artefakte aus der kumulativen Strahlung. Wichtig ist, bieten die 4D Filme von infizierten Mäusen eine leistungsstarke analytische Werkzeug, um bakterielle Besiedlung Dynamik in vivo zu überwachen.

Infektion von C57BL/6J-Mäusen mit 5 x 10 9 cfu C. rodentium ist ein gut beschriebenen bakteriellen Infektion Modell und führt zu einem selbst limitierende Magen-Darm-Infektion, die Spitzen zwischen 6-8 Tage nach der Infektion und dauert zwischen 3 bis 4 Wochen 2,14. Die Infektion mit dem Darmlumen durch die murine Immunsystem beschränkt und als Folge, Bakterien kontinuierlich in den Kot zu vergießen. Colonization von Mäusen durch C. rodentium kann nicht-invasiv durch direkte bakterielle Aufzählung von Kot oder Biolumineszenz-Bildgebung 2,3 überwacht werden. Dieses Manuskript beschreibt ein optimiertes Protokoll für die Durchführung 3D-und 4D Bildgebung Multimodalität von C. rodentium innerhalb Mäuse bakterielle Belastung und Lokalisierung während der Infektion zu überwachen. Die Ergebnisse sind in Abbildung 1 dargestellt sind, zeigen die Steuerelemente, die für eine erfolgreiche 4D-Bildgebung erforderlich sind. Vor der Infektion von Mäusen, ist es wichtig zu bestimmenMine dass die bakterielle Inokulum verwendet Biolumineszenz (1A) ist, und dass im Anschluss an die orale Gabe einer Maus mit Biolumineszenz C. rodentium, dass das Signal in den Magen des Tieres und nicht in der Lunge (1B) 16 beobachtet werden kann. Neben der Überwachung bakterielle Besiedlung mit Biolumineszenz-Bildgebung, ist es gute Praxis, Keimzahlen im Kot quantifizieren; die als eine indirekte Messung der bakteriellen Besiedlung des Magen-Darm-Schleimhaut verwendet Abbildung 2 zeigt den typischen bakteriellen Belastung im Kot von 8 C57BL6 / J gemacht. Mäuse, die mit ~ 5 x 10 9 cfu ICC180 infiziert wurden und überwacht für 8 Tage PI Colonization steigt von Tag 2 bis Tag PI 6-7, wo die Infektion Peaks bei ~ 5 x 10 10 KBE / g, was im Einklang mit früheren Berichten 2,3,17. Um die Bedeutung der Evaluation betonenting die Ausbreitung der Infektion in einem einzigen Mausklick, 1b und 3 sowie Video 1 wurden aus dem gleichen Maus wurde nach C erzeugt rodentium Infektion, wie oben beschrieben. Täglich DLIT-μCT wurde verwendet, um die räumliche Verteilung der biolumineszenten Bakterien in dieser Maus zu bewerten, mit dem Skelett als anatomische Referenz. Abbildung 3 zeigt die DLIT-μCT Rekonstruktion eines C57BL/6J Maus mit ICC180 bei 3 Schlüssel Zeitpunkten PI infiziert Bei Tag 3 PI kleine bioluminescent Brennpunkte können im Dickdarm beobachtet werden, welche zeigen einen moderaten Anstieg des Biolumineszenz Intensität von Tag 5 PI mit wenig Veränderung in der räumlichen Verteilung. Am Tag 7 PI beobachteten wir einen signifikanten Anstieg der Biolumineszenz und die Biolumineszenz Brennpunkte Ausbreitung über den gesamten Dickdarm. Video 1 ist eine Zusammenstellung von 3D-DLIT μCT Rekonstruktionen von 1-8 Tagen PI mit ICC180 und illustriert C.rodentium innerhalb des proximalen Gastrointestinaltrakt zwischen den Tagen 1-2 PI, die dem Doppelpunkt am Tag verteilt 3 PI Von 4-6 Tage PI die Keimzahlen in den Dickdarm bis Höchststand am Tag 7 PI wo die bakterielle Herde deckt den gesamten Dickdarm zu erweitern. Am Tag 8 PI nur zwei verschiedene bakterielle Herde sind in der proximalen und distalen Kolon. Die Fähigkeit, die volle 3D-Rekonstruktion zu jedem Zeitpunkt in chronologischer Reihenfolge anzuzeigen stellt ein leistungsfähiges Werkzeug, um Host-Pathogen-Interaktionen zu analysieren und ist einfacher zu interpretieren als ein 3D noch aus dem gleichen Datenbestand. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/50450/50450fig1.jpg" /> Abbildung 1. 2D Biolumineszenz-Bildgebung von A) Bioluminescent C. rodentium ICC180 Inokulum und B) eine Maus nach orale Gabe mit 200 ul des Inokulums. Arrowhead (&gt;) zeigt bioluminescent C. rodentium </<html> em&gt; in den Magen. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/50450/50450fig2.jpg" /> Abbildung 2. C. rodentium Kolonisation Dynamik. Quantifizierung von C. rodentium koloniebildenden Einheiten von Kot für 8 Tage PI <img alt="Abbildung 3" fo:content-width="3in" fo:src="/files/ftp_upload/50450/50450fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50450/50450fig3.jpg" /> Abbildung 3. Diffuses Licht Imaging-Tomographie-Scan μCT biolumineszenter C. rodentium Infektion von einer Maus am Tag 3, 5 und 7 PI Arrowhead (&gt;) überwacht veranschaulicht Kolon Kolonisation. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50450/50450fig3large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen</a> . Video 1.p :/ / www.jove.com/files/ftp_upload/50450/LAB_MEDIA_50450_Frankel_Video1.wmv &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Klicken Sie hier, um Video anzusehen. 4D-Film von C. rodentium Infektion von einer Maus von 1-8 Tagen PI überwacht

Multi-Bildgebung ist ein wertvoller Ansatz zur Untersuchung bakterieller Besiedlung in kleinen Tiermodellen. Dieses Protokoll beschreibt Infektion von Mäusen mit Biolumineszenz<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; Und die Längs-Überwachung der bakteriellen Besiedelung mit Composite 3D diffuses Licht Bildgebung Tomographie mit μCT Bildgebung einen 4D Film erstellen<em&gt; C. rodentium</em&gt; Infektion.

4D Imaging von Multimodalität<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; Infektionen bei Mäusen

This protocol outlines the steps required to  longitudinally monitor a bioluminescent bacterial infection using composite 3D diffuse light imaging ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, den Null-DUM-Infektionszyklus mithilfe der kombinierten diffusen Lichtbildgebungstomographie mit integrierter Mikro-CT-Technik zu überwachen, um einen vierdimensionalen Film der Infektion zu erstellen. Dies wird erreicht, indem zunächst ein biolumineszenter bakterieller Inokulum hergestellt wird. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, Mäuse mittels oraler Gavage mit Null Dunum zu infizieren.Die infizierten Mäuse werden anschließend täglich mit der D-Licht-Mikro-CT-Methode abgebildet, und die abschließenden Schritte bestehen darin, die 3D-DLI-Mikro-CT-Daten zu rekonstruieren und zu einem vierdimensionalen Film des Infektionszyklus zusammenzustellen. Letztendlich können die Ergebnisse die Veränderungen in der Verteilung und Lokalisation der Bakterienlast durch die vierdimensionale Multimodalitätsbildgebung infizierter Mäuse veranschaulichen. Dr. James Collins.Ein Postdoktorand in meinem Labor wird heute Nachmittag den Versuch durchführen. Am Tag vor der Infektion einen Kryoröhrchen der Deum-Nullstamm IC 180 aufthauen lassen. Sobald es aufgetaut ist, eine Kryoperle Bakterien in 15 Milliliter LB-Medium mit Kanamycin geben und die Kultur über Nacht bei 37 Grad Celsius mit Schütteln bei 220 U/min wachsen lassen. Zusätzlich 15 Milliliter nicht-inokuliertes LB-Medium kultivieren, um am nächsten Morgen eine Kontrolle auf Mediumkontamination durchzuführen.Falls die mit UN inokulierte Kontrolle nicht trüb ist, überführen Sie die inokulierte Kultur in ein 50-Milliliter-Röhrchen und zentrifugieren Sie diese bei 4.000 U/min 10 Minuten lang bei vier Grad Celsius. Bringen Sie das Pellet in einem Volumen von PBS wieder in Suspension und wiederholen Sie die Zentrifugation. Resuspendieren Sie die Zellen anschließend gründlich in 1,5 Milliliter PBS, um das bakterielle Inokulum herzustellen. Um zu überprüfen, ob die ICC-180-Kultur biolumineszent ist, und um die Anzahl der Bakterien abzuschätzen, bilden Sie die Kultur im IVIS Spectrum CT mittels Biolumineszenz-Bildgebung mit offenem Filter ab und verwenden Sie die automatische Einstellung im Living Image 4.3 0.1-Assistenten.Dies wird in einem zuvor veröffentlichten Video ausführlich beschrieben. Um die Infektion von Mäusen mit biolumineszenten Stäbchenbakterien zu demonstrieren, werden wir eine Maus infizieren und eine weitere Maus für eine Scheininfektion mit PBS verwenden. Vor Durchführung der Infektion betäuben Sie die Maus mit 3 % Isofluran unter Verwendung eines XGI-acht-Anästhesiesystems, um eine schonende Fixierung zu gewährleisten, während die Anästhesie vollständig einsetzt.Mischen Sie das bakterielle Inokulum und ziehen Sie eine bekannte Anzahl von Bakterien in 0,2 Milliliter in eine Spritze für die orale Gavage auf. Entnehmen Sie nun die erste Maus zur Infektion durch festes Greifen am Nackenfell. Beachten Sie, dass die Mäuse vor der Bildgebung mithilfe von Depiliercreme wie im Textartikel beschrieben enthaart wurden; führen Sie die Nadel über die Zunge hinweg in Richtung Gaumendach und weiter die Speiseröhre hinab ein und injizieren Sie das bakterielle Inokulum in den Magen.Wenn ein Widerstand spürbar ist, sollte die Nadel nicht gewaltsam vorgeschoben werden, da dies dazu führen würde, dass das Inokulum stattdessen in die Lunge gelangt; setzen Sie die Nadel stattdessen vorsichtig erneut ein. Danach sollte die Maus, falls sie Atem- oder Gehprobleme zeigt, für die Scheininfektion euthanasiert werden. Führen Sie eine Magensonde mit 0,2 Milliliter PBS durch, um zu bestätigen, dass die orale Gavage korrekt durchgeführt wurde.Bilden Sie die Mäuse im IVUS-Spektrum-CT mithilfe der Offenfilter-Biolumineszenz-Bildgebung ab und verwenden Sie die Automatik-Einstellung in der Living-Image-Software. Der 4,3 ± 0,1-Bildgebungsassistent wurde zuvor beschrieben. Delight-Mikro-CT umfasst eine integrierte Delight-Optikbildgebung mit einer Mikro-CT-Aufnahme mit niedriger Strahlendosis. Da sich die Dosis über jede Bildgebungssitzung bei den Tieren ansammelt, streben wir an, die Dosis so niedrig wie vernünftigerweise möglich zu halten.Aufgrund dieser Bedenken sollten die Mäuse beim ersten Anzeichen von schädlichen Symptomen oder am Ende des Mikro-CT-Bildgebungzeitraums getötet werden. Optimieren Sie für diese Studie die Parameter der automatischen Belichtungsfunktion in Living Image 4.3 0.1 zur Bildgebung der bakteriellen Luciferase in vivo. Wählen Sie zunächst „Edit“, dann „Preferences“, dann „Acquisition“ und anschließend das „Auto Exposure“-Fenster.Als Nächstes wählen Sie die Bereichswerte gefolgt von der Experimentdauer in Sekunden aus und stellen das Maximum auf 300 Sekunden ein. Schließlich wählen Sie die minimale Zielanzahl gefolgt von Lumineszenz aus und setzen diesen Wert auf 10.000 Zählungen. Sobald das System initialisiert wurde, die Anästhesie eingerichtet ist und die Röntgen-Sicherheitsverriegelungen überprüft wurden.Fahren Sie mit der Anästhesie einer Maus fort. Verwenden Sie ein XGI Acht-Anästhesiesystem mit einer Sauerstoffflussrate von zwei Litern pro Minute und 3 % Isofluran. Wenn die Maus bereit für die Bildgebung ist, öffnen Sie den Bildassistenten in der Software.Dieses Werkzeug optimiert automatisch mehrere Parameter, um für jeden ausgewählten Emissionsfilter das bestmögliche Signal-Rausch-Verhältnis zu erzielen. Wenn der Bildgebungsassistent dazu auffordert, fügen Sie die Emissionsfilter mit 560, 580, 600 und 620 Nanometer hinzu. Stellen Sie anschließend sicher, dass der 1-Maus-Mikro-CT-Scan ausgewählt ist, und klicken Sie auf „Erfassen“, um die Bildaufnahme zu starten.Nachdem die anästhetisierte Maus in ihren Käfig zurückgebracht wurde, entfernen Sie die eine Maus-Bildgebungsplattform vom Spectrum-CT und desinfizieren Sie die Tierplattform mit 1 % Tri Gene. Hinweis: Falls die Tierplattform stark verschmutzt ist, kann der Schaumstoffeinsatz ausgetauscht werden. Fahren Sie fort, die Mäuse täglich bis zu acht Tage nach der Infektion zu untersuchen, um longitudinale Bildgebungsdaten zu generieren.Längere Versuchszeiträume erhöhen die Wahrscheinlichkeit von Artefakten aufgrund kumulativer Strahlenexposition. Um hochwertige, reproduzierbare dreidimensionale Licht-Mikro-CT-Rekonstruktionen zu erstellen, sind mehrere Schritte erforderlich. Öffnen Sie zunächst die Living-Image-Software, Version 4.3 0.1, und wählen Sie im Browserfenster die Option „Browse“.Öffnen Sie den Ordner mit den Delight-Mikro-CT-Dateien, indem Sie auf „Laden“ klicken. Öffnen Sie die DLI-Mikro-CT-Datei im Living-Image-Browser. Ein Beispiel finden Sie bei Deum am siebten Tag nach der Infektion.Wählen Sie in der Werkzeugpalette zunächst die Oberflächentopographie und anschließend die Nacktmaus aus. Passen Sie die Schwelle an und klicken Sie dann auf „Oberfläche generieren“. Wenn die Oberflächenrekonstruktion erfolgreich ist, wird eine Umrisslinie der Oberfläche im 3D-Ansichtsfenster angezeigt.Um die gerenderte Mikro-CT-Aufnahme im 3D-Ansichtsfenster zu betrachten, blenden Sie entweder die Oberflächenkontur aus oder verringern Sie die Deckkraft der Oberfläche. Beide Optionen werden über die Auswahl von 3D-optischen Werkzeugen aufgerufen. Daraufhin deaktivieren Sie entweder die Anzeige des Oberflächenobjekts oder stellen die Deckkraft mithilfe des Schiebereglers ein, um eine detaillierte anatomische Lokalisation der dreidimensionalen Lichtrekonstruktion der DD darzustellen.Beziehen Sie sich auf das Tier-Skelett und verändern Sie die 3D-Volumendaten. Um das Skelett mit optimaler Kontrastdarstellung anzusehen, klicken Sie auf 3D-Multimodalitätswerkzeuge und verschieben Sie den Histogrammschieberegler nach rechts, bis nur noch die Knochen deutlich sichtbar sind. Klicken Sie anschließend, falls noch nicht ausgewählt, auf logarithmisches Histogramm, umkehren des Farbverlaufs, Beleuchtungsqualität und Rauschunterdrückung.Falls gewünscht, beschneiden Sie das Bild, um unerwünschte Strukturen aus der 3D-Rekonstruktion zu entfernen. Wählen Sie aus der Werkzeugpalette die 3D-Rekonstruktion mit D-Licht. Stellen Sie sicher, dass nur die Filter mit 565, 860 und 620 Nanometer ausgewählt sind. Klicken Sie dann auf „Start“.Dadurch wird das Daten-Vorschaufenster mit den spektral gefilterten Biolumineszenzsignalen der in 2D abgebildeten Maus geöffnet. Diese Signale werden automatisch durch die Software geschwellwertet, können jedoch bei Bedarf manuell über die Register am unteren Rand des Menüs angepasst werden. Der Schwellwert bestimmt die minimale Signalintensität, die als Daten in die Rekonstruktion einbezogen wird.Als Nächstes wählen Sie aus der Werkzeugpalette die D-Licht-Mikro-CT-3D-Rekonstruktion aus und überprüfen die optischen Eigenschaften. Durch Klicken auf den Reiter „Eigenschaften“ sollten die Gewebeeigenschaften auf Mausgewebe und das Quellenspektrum auf Bakterien eingestellt werden. Klicken Sie nun auf „Rekonstruieren“, um die D-Licht-Rekonstruktion durchzuführen.Die tatsächliche Position des mit einem roten Kreis markierten D-Licht-Signals befindet sich im Beckengürtel. Die Interpretation ist einfacher, wenn sich das Bild während des Films dreht. Um den DLI-Mikro-CT-3D-Film zu erzeugen, gehen Sie zum Werkzeuge-Menü und wählen Sie 3D-Animation, vordefinierte Animationen, Drehung gegen den Uhrzeigersinn um die Achse und anschließend Gesamtdauer aus.Stellen Sie diesen Wert auf 10 Sekunden oder 25 Bilder pro Sekunde ein. Sobald die Einstellungen für die 3D-Animation korrekt sind, drücken Sie auf Aufnahme und speichern Sie die DLI-Mikro-CT-3D-Rekonstruktionen als VI-Dateien. Es ist entscheidend, diese Rekonstruktionen mit identischen Einstellungen durchzuführen, damit sie vergleichbar sind.Es ist außerdem wichtig, die Videos mit derselben Bildrate und gleicher Gesamtdauer aufzunehmen. Andernfalls ist die zeitliche Abfolge der 40 Videos nicht einheitlich. Öffnen Sie am Computer Windows Live Movie Maker und erstellen Sie eine neue Datei.Fügen Sie die DLI-Mikro-CT-Rekonstruktionen in chronologischer Reihenfolge ab dem ersten Tag nach der Infektion ein. Fügen Sie mithilfe der Registerkarte „Tools“ zu Beginn jedes Videos Beschriftungen hinzu, indem Sie das Video auswählen, dann „Home“ und anschließend „Add Caption“ auswählen. Der Text in der Beschriftung kann über die Symbolleiste formatiert werden, und die Position der Beschriftung ist ebenfalls anpassbar.Fügen Sie nun eine Titelseite hinzu, indem Sie auf „Start“ und anschließend auf „Titel“ klicken. Geben Sie Ihren Titel in das Feld ein und verwenden Sie die Symbolleiste, um den Text zu formatieren. Speichern Sie das Projekt danach als MMP-Datei.Dies ist unerlässlich, wenn Sie den Film bearbeiten möchten. Speichern Sie den Film schließlich über das Menü des Filmherstellers als WMV-Datei, wählen Sie „Film speichern“ aus, und beachten Sie, dass die vier Computer-Optionen für eine gute Technik entscheidend sind. Vor der Infektion von Mäusen wurde sichergestellt, dass das verwendete bakterielle Inokulum biolumineszent war.Nach der oralen Gavage mit biolumineszentem See-Rodent wurde überprüft, ob das Signal im Magen des Tieres, das durch einen weißen Pfeil markiert ist, nachweisbar war und in den Lungen fehlte. Dieselbe Maus wird in nachfolgenden Beispielen einer individuellen Infektion gezeigt. Zero-Denture ist ein extrazellulärer Erreger, der sich während der dargestellten Infektion auf das Darmlumen beschränkt.Daher wird es mit dem Stuhl ausgeschieden, der analysiert wurde, um zu zeigen, dass die Kolonisation von Tag zwei bis Tag sechs oder sieben ansteigt, wenn die Infektion täglich ihren Höhepunkt erreicht. Mit der Mikro-CT in D-Darstellung wurde die räumliche Verteilung der biolumineszenten Bakterien in dieser Maus unter Verwendung des Skeletts als anatomische Referenz bewertet. Am dritten Tag nach der Infektion wurden kleine biolumineszente Herde im Kolon beobachtet, die durch einen blauen Pfeil veranschaulicht sind.Diese Herde zeigten bis zum fünften Tag nach der Infektion einen moderaten Anstieg der Biolumineszenzintensität, während sich die räumliche Verteilung am siebten Tag nach der Infektion kaum veränderte. Am siebten Tag war ein signifikanter Anstieg der Biolumineszenz zu beobachten, und die biolumineszenten Herde breiteten sich über den gesamten Kolon aus. Drei DD-Licht-Mikro-CT-Rekonstruktionen von Tag eins bis Tag acht nach der Infektion veranschaulichen die Ausbreitung der Sero-Deum-Infektion. Die bakterielle Infektion beginnt als deutlich abgegrenzte Herde im proximalen Gastrointestinaltrakt.Am dritten Tag breitet sich die Infektion auf den Dickdarm aus. In den folgenden Tagen verbreiten sich die Infektionsherde weiter und nehmen an Größe und Anzahl zu. Die Infektion erreicht am siebten Tag ihren Höhepunkt.Am achten Tag hatten sich die Kolonien dann auf zwei unterschiedliche bakterielle Herde im proximalen und distalen Kolon reduziert. Diese Technologie ermöglicht es Forschern, die Mechanismen bakterieller Kolonisation und Infektion in Echtzeit zu untersuchen sowie die Wirksamkeit von Interventionsstrategien zu evaluieren.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

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4D Imaging von Multimodalität

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