Ischämie-Reperfusion-Modell des akuten Nierenschädigung und nach der Verletzung Fibrose bei Mäusen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, einen konsistenten überlebensfähigen und funktionell messbaren Grad der Ischämie zu induzieren. Die Reperfusion induzierte bei Mäusen eine akute Nierenschädigung durch einseitiges Nierenpedikelklemmen, gefolgt von einer kontralateralen Nephrektomie-Ischämie. Eine Reperfusionsverletzung wird erreicht, indem ein dorsaler Schnitt gemacht und der linke und rechte Nierenstiel freigelegt werden.

Dazu gehören auch die Nierenarterie und die Vene. Anschließend wird eine kontralaterale Nephrektomie durchgeführt, nachdem die Niere vom umgebenden Gewebe befreit wurde. Dann wird der linke Nierenstiel mit einer Gefäßklemme geklemmt und die Niere mit der Haut bedeckt.

Schließlich, nach einer vorgegebenen Zeit, wird die Klemme gelöst, die Niere kann reperfundiert werden und die Niere wird in den retroperitonealen Raum zurückgeschoben. Letztendlich kann die funktionelle Analyse der Nierenschädigung durch die Analyse des Serumkreatininspiegels unter Verwendung eines enzymatischen Kaskadenassays 24 Stunden nach Entfernung der kontralateralen Nierenischämie durchgeführt werden. Die Reperfusionsschädigung ist ein Modell, das häufig zur Untersuchung der Mechanismen und der Behandlung von akutem Nierenversagen verwendet wird.

Die Technik selbst ist relativ einfach, aber es gibt eine Reihe von Variablen, die dazu geführt haben, dass viele Labore die Technik als schwer reproduzierbar empfinden, mit hoher Sterblichkeit und auch relativ niedrigem Durchsatz bei Personen, die nur fünf bis 10 Operationen pro Tag durchführen können. Dr. Skrinick, der Ihnen die Technik später vorstellen wird, hat einige Jahre damit verbracht, die Technik in unserem Labor zu entwickeln und ein Protokoll zu entwickeln, das wir als viel reproduzierbarer befunden haben, mit einer geringen Mortalität und einem relativ hohen Durchsatz. An einem guten Tag ist NA in der Lage, 40 bis 50 Operationen pro Tag durchzuführen, um sich auf die Operation vorzubereiten.

Autoklavieren Sie alle chirurgischen Instrumente, wenn sie für mehrere Mäuse verwendet werden, und behandeln Sie sie zwischen den Eingriffen mit einem Heißperlensterilisator. Wenn Sie ein Wasserbadsystem verwenden, stellen Sie die Hitze eine Stunde vor der Operation auf 38 Grad Celsius ein, wiegen Sie die Maus und verabreichen Sie dann eine subkutane Injektion von 0,5 Millilitern steriler normaler Kochsalzlösung. Nachdem Sie eine Maus mit einer intraperitonealen Injektion von Alain und Ketamingemisch betäubt haben, rasieren Sie den Operationsbereich und tragen Sie eine Augensalbe auf, um die Hornhaut der Maus zu schützen.

Übertragen Sie die Maus in Bauchlage auf eine beheizte Oberfläche, die mit einer saugfähigen Bankauflage ausgekleidet ist, und kleben Sie die Beine mit Betadine-Lösung an die Operationsoberfläche. Schrubben Sie von der Mitte des Standorts zur Peripherie, gefolgt von Novacan insgesamt dreimal. Decken Sie das Operationsfeld mit dem sterilen OP-Tuch ab.

Als nächstes tasten Sie die Nierenstelle durch die Haut ab. Schneiden Sie dann die Rückenhaut entlang der Mittellinie der Maus mit Schere und Pinzette ein. Trennen Sie die Haut und die Unterhautschicht über die linke und rechte Rückenseite durch den Schnitt.

Machen Sie einen kleinen Schnitt durch den rechten Flankenmuskel und die Faszie oberhalb der rechten Niere und ordnen Sie ihn vorsichtig nach außen, indem Sie den oberen und unteren Pol der Niere frei von umliegendem Gewebe präparieren. Auch die Nebenniere wird mit der Blutversorgung schonend vom oberen Pol der rechten Niere entfernt, indem das Gewebe mit einer stumpfen Pinzette in einer schwungvollen Bewegung von medial nach lateral sanft abgetrennt wird. Das ist per Video etwas schwer zu demonstrieren, aber man kann es verstehen.

Wenn Sie sich die Anatomie der Nebenniere mit ihrer in Abbildung eins dargestellten Blutversorgung ansehen, binden Sie dann mit vier Oh-Seidennähten einen doppelten chirurgischen Knoten um das Hilum. Lassen Sie ein Ende der Naht etwa zwei Zentimeter lang und verwenden Sie es, um die Niere zu halten, um die Schnittstelle zu visualisieren, während Sie distal des Knotens schneiden. Verwenden Sie sterile Kochsalzlösung, um den Stumpf zu bewässern.

Schließen Sie dann mit resorbierbarem Naht die Muskelschicht und bewegen Sie sich zur linken Seite. Machen Sie einen kleinen Schnitt durch den linken Flankenmuskel und die Faszie oberhalb der linken Niere und veräussern Sie ihn mit einer stumpfen Pinzette. Halten Sie die Niere vorsichtig fest, während Sie den Nierenstiel mit einer zweiten Pinzette vom umgebenden Fettgewebe lösen.

Achten Sie darauf, nicht zu viel Druck auf die Niere auszuüben, was zu Nierenschäden führen kann. Wenn Sie scheinoperierte Kontrollen in Ihre Experimente einbeziehen, sollten scheinoperierte Mäuse genau die gleichen Verfahren durchlaufen wie die verletzten Mäuse, einschließlich der Befreiung des Nierenstiels vom umgebenden Fett, aber die Gefäßklemme wird nicht auf den Nierenstiel gelegt. Verwenden Sie als Nächstes bei der Stabilisierung der Nierenzange eine nicht-traumatische Gefäßklemme, um den linken Nierenstiel zu klemmen. Die Klemmzeiten variieren je nach Mausstamm und Schwere der Verletzung, die erforderlich ist, wenn die Klemme noch an Ort und Stelle ist.

Bedecken Sie die linke Niere mit der Haut und verwenden Sie dann mit Kochsalzlösung getränkte sterile Gaze, um den Hautschnitt abzudecken. Decken Sie dann die Maus mit einem sterilen Tuch ab, um das Operationsfeld nach der gewünschten Zeit zu schützen, und legen Sie die Niere frei. Vergewissern Sie sich, dass es einheitlich dunkel aussieht, und lösen Sie dann die Klemme.

Die Niere sollte nach der Reperfusion schnell und gleichmäßig ein rosa Aussehen annehmen. Schieben Sie die Niere vorsichtig in den retroperitonealen Raum zurück. Als nächstes verschließen Sie die Muskelschicht mit resorbierbarem Naht und verschließen Sie die Haut mit Clips, verabreichen Sie 0,05 Mikrogramm pro Gramm Buprenorphin-Analgesie und 0,5 Milliliter sterile normale Kochsalzlösung subkutan.

Übertragen Sie dann die Maus auf ein Heizkissen und lassen Sie sie aufwachen, bevor Sie sie bis zu fünf in den Tierraum bringen. Mäuse können nach der Operation in jeden Käfig gesetzt werden, die Maus genau überwachen und bei Bedarf alle acht bis 12 Stunden eine zusätzliche Analgesie verabreichen, um Schmerzen oder Beschwerden in unserer Hand zu lindern. Die einseitige IR-Schädigung mit gleichzeitiger kontralateraler Nephrektomie reduziert die Variabilität der Ergebnisse im Vergleich zu einer bilateralen IR-Schädigung erheblich.

Bei diesem Verfahren entwickeln 50 bis 60 % der Mäuse innerhalb von 24 Stunden nach der Verletzung die erwartete Niereninsuffizienz. In der Praxis bedeutet dies, dass es bei der Verwendung dieses Modells immer noch eine erhebliche Variabilität gibt, da die verbleibenden Mäuse entweder sehr geringe oder viel schwerere Verletzungen entwickeln. Für unsere Zwecke sind wir in der Lage, dieses Problem zu minimieren.

Da die von uns verwendeten Behandlungsgruppen in der Regel 24 Stunden oder länger nach der ersten Verletzung eingeleitet werden. Auf diese Weise können Mäuse nach dem 24-Stunden-Zeitpunkt des Kreatinins auf verschiedene Behandlungsgliedmaßen randomisiert werden. Mäuse mit Kreatininwerten außerhalb eines vorgegebenen Bereichs werden zu diesem Zeitpunkt von weiteren Untersuchungen ausgeschlossen.

Bei mittelschweren Verletzungen schließen wir in der Regel Mäuse mit Serumkreatininwerten außerhalb eines Bereichs von 0,8 bis 1,2 Milligramm pro Deziliter aus. Neben der unilateralen IR bei gleichzeitiger kontralateraler Nephrektomie führen wir auch die unilaterale IR allein durch. Mäuse können viel längere Perioden der Ischämie überleben und neigen dazu, nach einer Verletzung eine schwerere Fibrose zu entwickeln.

Da es in diesem Modell jedoch schwierig ist, die funktionelle Erholung bei einseitiger IR-Schädigung zu bewerten, gibt es keine Möglichkeit, die Schwere der Verletzung zu bewerten, ohne Nierengewebe zu entnehmen, und dies ist für längerfristige Studien möglicherweise nicht möglich. Aus diesem Grund haben wir ein Protokoll entwickelt, um eine schwere einseitige IR-Schädigung herbeizuführen und die Wiederherstellung der Nierenfunktion zu beurteilen, indem acht Tage nach der ursprünglichen Verletzung eine kontralaterale Nephrektomie durchgeführt wird. Mit diesem Ansatz überleben 90 bis 100 % der Mäuse die Verletzung, aber vor allem entwickelten die Mäuse eine sehr konsistente Nierenschädigung und können ab dem neunten Tag auf eine funktionelle Erholung nach einer akuten Nierenschädigung untersucht werden.

Die Konsistenz und Vorhersagbarkeit einer Nierenschädigung hängt stark von der Konsistenz und Präzision der Schritte ab, die während der Operation durchgeführt werden. Sobald Sie es beherrschen, kann diese Technik in 35 bis 40 Minuten ausgeführt werden und kann gleichzeitig auf fünf bis 10 Meilen gleichzeitig ausgeführt werden. Wir haben diese Methode verwendet, um auf bis zu 40 bis 50 Meilen pro Tag zu operieren, also viel Spaß und viel Glück.