Metabolische Markierung von Leucin Rich-Repeat-Kinasen 1 und 2 mit radioaktivem Phosphat

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, die interessierenden Proteine mit radioaktiven Phosphaten zu markieren, um die Proteine und die zellulären Phosphorylierungsniveaus zu quantifizieren. Dies wird erreicht, indem Zellen in Gegenwart von Phosphor 32 kultiviert werden, um die Phosphatmodifikationen von Proteinen, die in den Zellen exprimiert werden, radioaktiv zu markieren. In einem zweiten Schritt werden markierte Zellen lysiert und Lysate mit einem Affinitätskügelchen inkubiert, um die zu analysierenden Proteine immunaufzureinigen.

Als nächstes werden Proben von markierten und gereinigten Proteinen auf Natriumsulfat und Polyacrylamid-Gelelektrophorese aufgebracht und auf Polyolainfluoridmembranen geblottet. Um den Einbau von radioaktivem Phosphat und den Proteingehalt nachzuweisen, werden Ergebnisse erzielt, die zeigen, dass die leucinreichen Repeatkinasen eins und zwei, abgekürzt L rrk one und L rrk two, in Zellen auf vergleichbare Werte phosphoryliert sind, basierend auf Autoradiographie und Immundetektion. Ein Hauptvorteil der metabolischen Markierungstechnik im Vergleich zu anderen Techniken wie Phospho, Immunblotting, besteht darin, dass diese Technik die Bestimmung der gesamten zellulären Phosphorylierungsniveaus von Proteinen ermöglicht, auch für Proteine, für die keine Phospho-Antikörper verfügbar sind.