Name: Metabolische Markierung von Leucin Rich-Repeat-Kinasen 1 und 2 mit radioaktivem Phosphat (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-18T11:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: Lernen Sie die metabolische Markierung von LRRK1 und LRRK2 mit radioaktivem Phosphat-32 in Zellen. Diese Methode ermöglicht die Quantifizierung der zellulären Phosphorylierungsniveaus dieser Kinasen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wir sind auch dankbar, dass der Michael J. Fox Foundation unterstützt diese Studie. Wir danken der Forschungsgemeinschaft - FWO Flandern (FWO Projekt G.0666.09, Senior Researcher Stipendium für JMT), die Binnenschifffahrt SBO/80020 Projekt Neuro-TARGET, die KU Leuven (OT/08/052A und IOF-KP/07 / 001) für ihre Unterstützung. Diese Forschung wurde zum Teil auch von den Fonds-Druwé Eerdekens von der König-Baudouin-Stiftung verwaltet JMT unterstützt.

<ol><li>Hanafusa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leucine-rich+repeat+kinase+LRRK1+regulates+endosomal+trafficking+of+the+EGF+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Leucine-rich repeat kinase LRRK1 regulates endosomal trafficking of the EGF receptor.</a> Nat Commun. 2, 158(2011).</li>
<li>Titz, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+proximal+signaling+network+of+the+BCR-ABL1+oncogene+shows+a+modular+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">The proximal signaling network of the BCR-ABL1 oncogene shows a modular organization.</a> Oncogene. 29, 5895-5910 (2010).</li>
<li>Cookson, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+leucine-rich+repeat+kinase+2+%28LRRK2%29+in+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The role of leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) in Parkinson's disease.</a> Nat Rev Neurosci. 11, 791-797 (2010).</li>
<li>Taymans, J. M., Cookson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+dominant+parkinsonism%3B+the+toxic+triangle+of+LRRK2%2C+alpha-synuclein+and+tau%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of dominant parkinsonism; the toxic triangle of LRRK2, alpha-synuclein and tau.</a> Bioessays. 32, 227-235 (2010).</li>
<li>Lewis, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+function+of+ROCO+proteins+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">The function of ROCO proteins in health and disease.</a> Biol Cell. 101, 183-191 (2009).</li>
<li>Marin, I., van Egmond, W. N., van Haastert, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Roco+protein+family%3A+a+functional+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">The Roco protein family: a functional perspective.</a> FASEB J. 22, 3103-3110 (2008).</li>
<li>Marin, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Parkinson+disease+gene+LRRK2%3A+evolutionary+and+structural+insights%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.Biol.Evol%22%5BJournal%5D)">The Parkinson disease gene LRRK2: evolutionary and structural insights.</a> Mol.Biol.Evol. 23, 2423-2433 (2006).</li>
<li>Marin, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ancient+origin+of+the+Parkinson+disease+gene+LRRK2%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Evol%22%5BJournal%5D)">Ancient origin of the Parkinson disease gene LRRK2.</a> J Mol Evol. 67, 41-50 (2008).</li>
<li>Lobbestael, E., Baekelandt, V., Taymans, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+of+LRRK2%3A+from+kinase+to+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Soc+Trans%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation of LRRK2: from kinase to substrate.</a> Biochem Soc Trans. 40, 1102-1110 (2012).</li>
<li>Gloeckner, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphopeptide+Analysis+Reveals+Two+Discrete+Clusters+of+Phosphorylation+in+the+N-Terminus+and+the+Roc+Domain+of+the+Parkinson-Disease+Associated+Protein+Kinase+LRRK2%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Phosphopeptide Analysis Reveals Two Discrete Clusters of Phosphorylation in the N-Terminus and the Roc Domain of the Parkinson-Disease Associated Protein Kinase LRRK2.</a> J Proteome Res. 9, 1738-1745 (2010).</li>
<li>Nichols, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((14-3-3+binding+to+LRRK2+is+disrupted+by+multiple+Parkinson%27s+disease-associated+mutations+and+regulates+cytoplasmic+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">14-3-3 binding to LRRK2 is disrupted by multiple Parkinson's disease-associated mutations and regulates cytoplasmic localization.</a> Biochem J. 430, 393-404 (2010).</li>
<li>Greggio, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+LRRK2%2Fdardarin+associated+with+Parkinson+disease+are+more+toxic+than+equivalent+mutations+in+the+homologous+kinase+LRRK1%5BTitle%5D)+AND+%22J.Neurochem%22%5BJournal%5D)">Mutations in LRRK2/dardarin associated with Parkinson disease are more toxic than equivalent mutations in the homologous kinase LRRK1.</a> J.Neurochem. 102, 93-102 (2007).</li>
<li>Taymans, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LRRK2+Kinase+Activity+Is+Dependent+on+LRRK2+GTP+Binding+Capacity+but+Independent+of+LRRK2+GTP+Binding%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">LRRK2 Kinase Activity Is Dependent on LRRK2 GTP Binding Capacity but Independent of LRRK2 GTP Binding.</a> PLoS One. 6, 23207-23 (2011).</li>
<li>Daniëls, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insight+into+the+mode+of+action+of+the+LRRK2+Y1699C+pathogenic+mutant%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Insight into the mode of action of the LRRK2 Y1699C pathogenic mutant.</a> J Neurochem. 116, 304-315 (2011).</li>
<li>Civiero, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+characterization+of+highly+purified+leucine-rich+repeat+kinases+1+and+2+demonstrates+formation+of+homodimers%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Biochemical characterization of highly purified leucine-rich repeat kinases 1 and 2 demonstrates formation of homodimers.</a> PLoS One. 7, e43472(2012).</li>
<li>Taymans, J. M., Van den Haute, C., Baekelandt, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+PINK1+and+LRRK2+in+rat+and+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.Neurochem%22%5BJournal%5D)">Distribution of PINK1 and LRRK2 in rat and mouse brain.</a> J.Neurochem. 98, 951-961 (2006).</li>
<li>Lewis, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assaying+the+kinase+activity+of+LRRK2+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Assaying the kinase activity of LRRK2 in vitro.</a> J Vis Exp. , (2012).</li>
<li>Lobbestael, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+detection+of+transgene+expression+in+the+brain+using+small+epitope+tags%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical detection of transgene expression in the brain using small epitope tags.</a> BMC Biotechnol. 10, 16(2010).</li>
<li>Davies, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+Characterization+and+Optimization+of+Leucine+Rich+Repeat+Kinase+2+%28LRRK2%29+Monoclonal+Antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Comprehensive Characterization and Optimization of Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) Monoclonal Antibodies.</a> Biochem J. , (2013).</li>
<li>West, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkinson%27s+disease-associated+mutations+in+LRRK2+link+enhanced+GTP-binding+and+kinase+activities+to+neuronal+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.Mol.Genet%22%5BJournal%5D)">Parkinson's disease-associated mutations in LRRK2 link enhanced GTP-binding and kinase activities to neuronal toxicity.</a> Hum.Mol.Genet. 16, 223-232 (2007).</li>
<li>Sheng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ser1292+autophosphorylation+is+an+indicator+of+LRRK2+kinase+activity+and+contributes+to+the+cellular+effects+of+PD+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Ser1292 autophosphorylation is an indicator of LRRK2 kinase activity and contributes to the cellular effects of PD mutations.</a> Sci Transl Med. 4, 164ra161(2012).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation-dependent+14-3-3+binding+to+LRRK2+is+impaired+by+common+mutations+of+familial+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation-dependent 14-3-3 binding to LRRK2 is impaired by common mutations of familial Parkinson's disease.</a> PLoS One. 6, e17153(2011).</li>
<li>Dzamko, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+LRRK2+kinase+activity+leads+to+dephosphorylation+of+Ser%28910%29%2FSer%28935%29%2C+disruption+of+14-3-3+binding+and+altered+cytoplasmic+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Inhibition of LRRK2 kinase activity leads to dephosphorylation of Ser(910)/Ser(935), disruption of 14-3-3 binding and altered cytoplasmic localization.</a> Biochem J. 430 (910), 405-413 (2010).</li>
</ol>

Autoren haben nichts zu offenbaren.

Dieses Papier stellt eine Basisprotokoll zum Testen von allgemeinen Phosphorylierung von LRRK2 LRRK1 und in Zelllinien unter Verwendung metabolische Markierung mit 32 P-Orthophosphat. Die Gesamtstrategie ist einfach. LRRK affinitätsmarkierten Proteine ​​in HEK293T-Zellen, die einem Medium mit 32 P-Orthophosphat ausgesetzt sind, ausgedrückt. Die 32 P-Orthophosphat durch die Zellen bereits nach wenigen Stunden Inkubation und alle Moleküle in der Zelle, die Phosphate assimiliert werden dabe...

Leucin rich repeat-Kinasen 1 und 2 (LRRK1 und LRRK2) sind Multidomänen-Paralogen, die eine ähnliche Domäne Organisation teilen. Beide Proteine ​​kodieren, eine GTPase Sequenz ähnlich der Ras-Familie von GTPasen (Ras komplexer Proteine ​​oder ROC) sowie einen C-terminalen Domäne des ROC (COR), effektiv Klassifizieren beide Proteine ​​an den Proteinfamilie ROCO 5,6. N-Terminus der ROC-COR Domain Tandem, beide Proteine ​​kodieren ein Leucin-reichen Repeat-Domäne sowie eine Ankyrin-ähnlichen Domäne, während nur LRRK2 kodiert eine zusätzliche Gürteltier domein 6-8. C-Terminus der ROC-COR, beide Proteine ​​teilen eine Serin-Threonin-Kinase-Domäne, während nur LRRK2 kodiert ein WD40-Domäne in der C-terminalen Region 8. Die genaue Rolle der zellulären LRRK1 und LRRK2 müssen noch aufgeklärt werden, aber LRRK1 in Tyrosinkinase-Rezeptor-Signal 1,2 gebracht worden, während die genetische Beweise deuten auf eine Rolle von LRRK2 in der Pathogenese von Parkinson-Krankheit 3,4. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; Die Phosphorylierung von Proteinen ist eine gemeinsame Regulationsmechanismus in den Zellen. Zum Beispiel kann die Phosphorylierung essentiell für die Aktivierung von Enzymen bzw. für die Einstellung von Proteinen mit einem Signalisierungs komplex sein. Die zelluläre Phosphorylierung von LRRK2 wurde umfassend charakterisiert und phosphosite Mapping hat eine Mehrheit der zellulären Phosphorylierungsstellen in einem Cluster zwischen der Ankyrin repeat und Leucin-reichen Wiederholungsdomänen auftreten 9-11 gezeigt. Obwohl LRRK1 zellulären Phosphorylierungsstellen noch nicht abgebildet werden, Beweise aus Studien mit Phosphoprotein-Färbung von Blots von immun LRRK1 Protein aus COS7-Zellen legt nahe, dass LRRK1 Protein in Zellen phosphoryliert 12. Dieses Papier stellt eine Basisprotokoll zum Testen von allgemeinen Phosphorylierung von LRRK2 LRRK1 und in Zelllinien unter Verwendung metabolische Markierung mit 32 P-Orthophosphat. Die Gesamtstrategie ist einfach. Affinity getaggt LRRK proteIns in HEK293T-Zellen, die einem Medium, das 32 ​​P-Orthophosphat ausgesetzt sind ausgedrückt. Die 32 P-Orthophosphat durch die Zellen bereits nach wenigen Stunden Inkubation und alle Moleküle in der Zelle, die Phosphate assimiliert werden dabei radioaktiv markiert. Der Affinitäts-Tag (3xflag) wird dann verwendet, um die LRRK Proteine ​​von anderen zellulären Komponenten durch Immunpräzipitation isoliert werden. Immunpräzipitate werden dann über SDS-PAGE aufgetrennt, auf PVDF-Membranen und Analyse der enthaltenen Phosphate durch Autoradiographie (32 P-Signal) und Western-Detektion (Protein-Signal) der Proteine ​​auf den Blots durchgeführt.

<table><tbody><tr><td>Phosphor-32-Radionuklid, 1 mCi, Pufferdisnatriumphosphat in 1 ml Wasser</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEX011001MC</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#8217; s Modifiziertes Eagle Medium (D-MEM) (1X), flüssig (hohe Glukose)</td><td>Invitrogen</td><td>11971-025</td><td>Dieses Medium enthält keine Phosphate</td></tr><tr><td>Anti Flag M2 affiinty gel</td><td>Sigma</td><td>A2220</td><td>Für ein gleichwertiges Produkt mit rotem Gel (nützlich, um die Kügelchen leichter sichtbar zu machen), verwenden Sie Kat. Nr. F2426.</td></tr><tr><td>Extra dicker Löschfilter</td><td>Bio-Rad</td><td>1703965</td><td></td></tr><tr><td>Ponceau S Lösung</td><td>Sigma</td><td>P7170</td><td></td></tr></tbody></table>

metabolische markierung von leucin rich-repeat-kinasen 1 und 2 mit radioaktivem phosphat

Metabolic Labeling of Leucine Rich Repeat Kinases 1 and 2 with Radioactive Phosphate

Leucin-reichen Repeat-Kinasen 1 und 2 (LRRK1 und LRRK2) Paraloge, die eine ähnliche Domänenorganisation zu teilen, die eine Serin-Threonin-Kinasedomäne, einem Ras komplexer Proteine ​​Domain (ROC), einer C-terminalen Domäne des ROC (COR), und Leucin-reichen und Ankyrin-Repeats, wie am N-Terminus. Die genaue Rolle der zellulären LRRK1 und LRRK2 müssen noch aufgeklärt werden, aber LRRK1 in Tyrosinkinase-Rezeptor-Signal 1,2 gebracht worden, während LRRK2 in der Pathogenese von Parkinson-Krankheit 3,4 gebracht. In diesem Bericht stellen wir ein Protokoll, um die LRRK1 und LRRK2-Proteine ​​in Zellen, die mit 32 P-Orthophosphat zu kennzeichnen, wodurch ein Mittel, um die Gesamt Phosphorylierung dieser 2-Proteine ​​in Zellen zu messen bietet. Kurz, getaggt Affinität LRRK Proteine ​​in HEK293T Zellen, die Medium mit 32 P-Orthophosphat ausgesetzt sind, zum Ausdruck gebracht. Die 32 P-Orthophosphat von den Zellen assimiliert nach wenigenStunden Inkubation und alle Moleküle in der Zelle, die Phosphate sind dabei radioaktiv markiert. Über die Affinitätsmarkierung (3xflag) die LRRK Proteine ​​von anderen zellulären Komponenten durch Immunpräzipitation isoliert. Immunpräzipitate werden dann über SDS-PAGE aufgetrennt, auf PVDF-Membranen und Analyse der enthaltenen Phosphate durch Autoradiographie (32 P-Signal) und Western-Detektion (Protein-Signal) der Proteine ​​auf den Blots durchgeführt. Das Protokoll kann leicht angepasst werden, um die Phosphorylierung von einem anderen Protein, das in Zellen exprimiert wird und durch Immunpräzipitation isoliert werden kann, zu überwachen.

<html> Um die Gesamt Phosphorylierung von LRRK1 und LRRK2 in Zellen zu vergleichen, getaggt 3xflag LRRK1 und LRRK2 wurden in HEK293T-Zellen 15 ausgedrückt. Zellen wurden in 6-Well-Platten und mit 32 P markiert und analysiert, wie oben in dem Protokoll Text beschrieben. Abbildung 1 zeigt repräsentative Ergebnisse für die metabolische Markierung von LRRK1 und LRRK2 in HEK293T-Zellen. Radioaktiven Phosphateinbau wird sowohl LRRK1 und LRRK2 beobachtet. Nach Quantifizierung der 32</...

Leucin-reichen Repeat-Kinasen 1 und 2 (LRRK1 und LRRK2) sind Multidomänen-Proteine, die sowohl GTPase und Kinase-Domänen kodieren, und die in Zellen phosphoryliert sind. Hier präsentieren wir ein Protokoll zur LRRK1 und LRRK2 in Zellen mit 32 P-Orthophosphat zu kennzeichnen, wodurch ein Mittel, um ihre Gesamtzell Phosphorylierung zu messen bietet.

Metabolische Markierung von Leucin Rich-Repeat-Kinasen 1 und 2 mit radioaktivem Phosphat

Leucine rich repeat kinases 1 and 2 (LRRK1 and LRRK2) are paralogs which share a similar domain organization, including a serine-threonine kinase domain, ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, die interessierenden Proteine mit radioaktiven Phosphaten zu markieren, um die Proteine und die zellulären Phosphorylierungsniveaus zu quantifizieren. Dies wird erreicht, indem Zellen in Gegenwart von Phosphor 32 kultiviert werden, um die Phosphatmodifikationen von Proteinen, die in den Zellen exprimiert werden, radioaktiv zu markieren. In einem zweiten Schritt werden markierte Zellen lysiert und Lysate mit einem Affinitätskügelchen inkubiert, um die zu analysierenden Proteine immunaufzureinigen.Als nächstes werden Proben von markierten und gereinigten Proteinen auf Natriumsulfat und Polyacrylamid-Gelelektrophorese aufgebracht und auf Polyolainfluoridmembranen geblottet. Um den Einbau von radioaktivem Phosphat und den Proteingehalt nachzuweisen, werden Ergebnisse erzielt, die zeigen, dass die leucinreichen Repeatkinasen eins und zwei, abgekürzt L rrk one und L rrk two, in Zellen auf vergleichbare Werte phosphoryliert sind, basierend auf Autoradiographie und Immundetektion. Ein Hauptvorteil der metabolischen Markierungstechnik im Vergleich zu anderen Techniken wie Phospho, Immunblotting, besteht darin, dass diese Technik die B

metabolic-labeling-leucine-rich-repeat-kinases-1-2-with-radioactive

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Leucin rich repeat kinase 2 ist ein großes Multidomain-Kinase, Mutationen, bei denen sind die häufigste genetische Ursache der Parkinson-Krankheit. Die Analyse der Kinase-Aktivität dieses Proteins hat sich als wichtiges Instrument für das Verständnis der Biologie und Dysfunktion des Proteins werden. In diesem...

Untersuchen der Kinase-Aktivität von LRRK2 In-vitro-</em

13 C-Isotopenmarkierung ist eine nützliche Technik für die Bestimmung der Zelle zentralen Stoffwechsel für verschiedene Arten von Mikroorganismen. Nachdem die Zellen mit einer bestimmten markiertem Substrat gezüchtet haben, können GC-MS-Messung zeigen funktionale Stoffwechselwege auf einzigartige Kennzeichnung Muster in proteinogenen Aminosäuren basiert.

Stoffwechselweg der Firmung und der Entdeckung durch 13 C-Kennzeichnung von proteinogenen Aminosäuren

Phosphoinositiden signalisieren Lipide, deren relative Häufigkeit schnell ändert als Reaktion auf verschiedene Reize. Dieser Artikel beschreibt eine Methode, um die Fülle der Phosphoinositiden Messung durch metabolisch Markierung von Zellen mit 3 H-myo-Inositol, gefolgt von Extraktion und Deacylierung. Extrahiert glycero-inositides werden dann durch Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie getrennt und durch Strömungs Szintillations quantifiziert.

Radiomarkierung und Quantifizierung von Cellular Ebenen Phosphoinositide von High Performance Liquid Chromatography-gekoppelten Durchflussscintilla

Wir beschreiben hier eine Methode zur Identifizierung mehrerer Phosphorylierungen eines intrinsisch ungeordneten Proteins mittels Kernspinresonanzspektroskopie (NMR), wobei das Tau-Protein als Fallstudie verwendet wird. Rekombinantes Tau wird vor der Datenerfassung und -analyse in vitro durch eine Kinase isotopenangereichert und modifiziert.

Kernresonanzspektroskopie zur Identifizierung von Multiple Phosphorylierungen von intrinsisch ungeordneten Proteinen

Proteinkinasen sind hochentwickelte Signalisierungsenzyme und Gerüste, die für die inter- und intrazelluläre Signaltransduktion kritisch sind. Wir stellen ein Protokoll zur Messung der Kinaseaktivität durch die Verwendung von radioaktiv markiertem Adenosintriphosphat ([γ- 32 P] ATP) vor, ein zuverlässiges Verfahren zur Erleichterung der zellulären Signalregulation.

Test der Proteinkinase-Aktivität mit radioaktiv markiertem ATP

Peptid-Konkurrenz-Assays sind weit verbreitet in einer Vielzahl von molekularen und immunologischen Experimenten verwendet. Dieses Papier beschreibt eine detaillierte Methode für einen in vitro- Oligopeptid-konkurrierenden Kinase-Assay und die damit verbundenen Validierungsverfahren, die nützlich sein können, um spezifische Phosphorylierungsstellen zu finden.

Oligopeptid-Konkurrenz-Assay zur Phosphorylierungsbestimmung

Die vorliegende Studie beschreibt eine einfache Methode zur Erkennung von endogenen Ebenen der Rab10 Phosphorylierung von Leucin-reiche wiederholen Kinase 2.

Rab10 Phosphorylierung Erkennung von LRRK2 Aktivität mit SDS-PAGE mit einem Phosphat-Bindung

Wir charakterisierten ein neues Kinase-Protein mit robusten biochemischen Ansätzen: Western Blot-Analyse mit einem speziellen Antikörper an verschiedenen Zelllinien und Geweben, Wechselwirkungen durch Coimmunozipitungsexperimente, Kinase-Aktivität, die von Western Blot mit einem phosphospezifischen Antikörper und durch die ATP-Kennzeichnung von32P.

Charakterisierung auf molekularer Ebene mit robusten biochemischen Ansätzen eines neuen Kinase-Proteins

Dieses Protokoll beschreibt einen nicht radioaktiven Test zur Messung der Kinaseaktivität von Polynukleotid-Kinasen (PNKs) auf kleinen DNA- und RNA-Substraten.

Nichtradioaktiver Test zur Messung der Polynukleotid-Phosphorylierung kleiner Nukleotidsubstrate

Dieses Video zeigt Techniken für die Kennzeichnung von menschlichen embryonalen Stammzellen und mesenchymalen Stammzellen mit fluoreszierenden Farbstoffen. Diese Technik kann für eine in vivo Verfolgung der transplantierten Stammzellen mit optischen Bildgebung und zur histopathologischen Korrelation mit Fluoreszenzmikroskopie eingesetzt werden.

Labeling Stammzellen mit fluoreszierenden Farbstoffen zur nicht-invasiven Detektion mit Optical Imaging

Lernen Sie die metabolische Markierung von LRRK1 und LRRK2 mit radioaktivem Phosphat-32 in Zellen. Diese Methode ermöglicht die Quantifizierung der zellulären Phosphorylierungsniveaus dieser Kinasen.

Metabolische Markierung von Leucin Rich-Repeat-Kinasen 1 und 2 mit radioaktivem Phosphat

Weitere Videos entdecken