Name: Metabolische Markierung von Leucin Rich-Repeat-Kinasen 1 und 2 mit radioaktivem Phosphat (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-18T11:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: Lernen Sie die metabolische Markierung von LRRK1 und LRRK2 mit radioaktivem Phosphat-32 in Zellen. Diese Methode ermöglicht die Quantifizierung der zellulären Phosphorylierungsniveaus dieser Kinasen.

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Wir sind auch dankbar, dass der Michael J. Fox Foundation unterstützt diese Studie. Wir danken der Forschungsgemeinschaft - FWO Flandern (FWO Projekt G.0666.09, Senior Researcher Stipendium für JMT), die Binnenschifffahrt SBO/80020 Projekt Neuro-TARGET, die KU Leuven (OT/08/052A und IOF-KP/07 / 001) für ihre Unterstützung. Diese Forschung wurde zum Teil auch von den Fonds-Druwé Eerdekens von der König-Baudouin-Stiftung verwaltet JMT unterstützt.

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<li>Sheng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ser1292+autophosphorylation+is+an+indicator+of+LRRK2+kinase+activity+and+contributes+to+the+cellular+effects+of+PD+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Ser1292 autophosphorylation is an indicator of LRRK2 kinase activity and contributes to the cellular effects of PD mutations.</a> Sci Transl Med. 4, 164ra161(2012).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation-dependent+14-3-3+binding+to+LRRK2+is+impaired+by+common+mutations+of+familial+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation-dependent 14-3-3 binding to LRRK2 is impaired by common mutations of familial Parkinson's disease.</a> PLoS One. 6, e17153(2011).</li>
<li>Dzamko, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+LRRK2+kinase+activity+leads+to+dephosphorylation+of+Ser%28910%29%2FSer%28935%29%2C+disruption+of+14-3-3+binding+and+altered+cytoplasmic+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Inhibition of LRRK2 kinase activity leads to dephosphorylation of Ser(910)/Ser(935), disruption of 14-3-3 binding and altered cytoplasmic localization.</a> Biochem J. 430 (910), 405-413 (2010).</li>
</ol>

Autoren haben nichts zu offenbaren.

Dieses Papier stellt eine Basisprotokoll zum Testen von allgemeinen Phosphorylierung von LRRK2 LRRK1 und in Zelllinien unter Verwendung metabolische Markierung mit 32 P-Orthophosphat. Die Gesamtstrategie ist einfach. LRRK affinitätsmarkierten Proteine ​​in HEK293T-Zellen, die einem Medium mit 32 P-Orthophosphat ausgesetzt sind, ausgedrückt. Die 32 P-Orthophosphat durch die Zellen bereits nach wenigen Stunden Inkubation und alle Moleküle in der Zelle, die Phosphate assimiliert werden dabe...

Leucin rich repeat-Kinasen 1 und 2 (LRRK1 und LRRK2) sind Multidomänen-Paralogen, die eine ähnliche Domäne Organisation teilen. Beide Proteine ​​kodieren, eine GTPase Sequenz ähnlich der Ras-Familie von GTPasen (Ras komplexer Proteine ​​oder ROC) sowie einen C-terminalen Domäne des ROC (COR), effektiv Klassifizieren beide Proteine ​​an den Proteinfamilie ROCO 5,6. N-Terminus der ROC-COR Domain Tandem, beide Proteine ​​kodieren ein Leucin-reichen Repeat-Domäne sowie eine Ankyrin-ähnlichen Domäne, während nur LRRK2 kodiert eine zusätzliche Gürteltier domein 6-8. C-Terminus der ROC-COR, beide Proteine ​​teilen eine Serin-Threonin-Kinase-Domäne, während nur LRRK2 kodiert ein WD40-Domäne in der C-terminalen Region 8. Die genaue Rolle der zellulären LRRK1 und LRRK2 müssen noch aufgeklärt werden, aber LRRK1 in Tyrosinkinase-Rezeptor-Signal 1,2 gebracht worden, während die genetische Beweise deuten auf eine Rolle von LRRK2 in der Pathogenese von Parkinson-Krankheit 3,4. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; Die Phosphorylierung von Proteinen ist eine gemeinsame Regulationsmechanismus in den Zellen. Zum Beispiel kann die Phosphorylierung essentiell für die Aktivierung von Enzymen bzw. für die Einstellung von Proteinen mit einem Signalisierungs komplex sein. Die zelluläre Phosphorylierung von LRRK2 wurde umfassend charakterisiert und phosphosite Mapping hat eine Mehrheit der zellulären Phosphorylierungsstellen in einem Cluster zwischen der Ankyrin repeat und Leucin-reichen Wiederholungsdomänen auftreten 9-11 gezeigt. Obwohl LRRK1 zellulären Phosphorylierungsstellen noch nicht abgebildet werden, Beweise aus Studien mit Phosphoprotein-Färbung von Blots von immun LRRK1 Protein aus COS7-Zellen legt nahe, dass LRRK1 Protein in Zellen phosphoryliert 12. Dieses Papier stellt eine Basisprotokoll zum Testen von allgemeinen Phosphorylierung von LRRK2 LRRK1 und in Zelllinien unter Verwendung metabolische Markierung mit 32 P-Orthophosphat. Die Gesamtstrategie ist einfach. Affinity getaggt LRRK proteIns in HEK293T-Zellen, die einem Medium, das 32 ​​P-Orthophosphat ausgesetzt sind ausgedrückt. Die 32 P-Orthophosphat durch die Zellen bereits nach wenigen Stunden Inkubation und alle Moleküle in der Zelle, die Phosphate assimiliert werden dabei radioaktiv markiert. Der Affinitäts-Tag (3xflag) wird dann verwendet, um die LRRK Proteine ​​von anderen zellulären Komponenten durch Immunpräzipitation isoliert werden. Immunpräzipitate werden dann über SDS-PAGE aufgetrennt, auf PVDF-Membranen und Analyse der enthaltenen Phosphate durch Autoradiographie (32 P-Signal) und Western-Detektion (Protein-Signal) der Proteine ​​auf den Blots durchgeführt.

<table><tbody><tr><td>Phosphor-32-Radionuklid, 1 mCi, Pufferdisnatriumphosphat in 1 ml Wasser</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEX011001MC</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#8217; s Modifiziertes Eagle Medium (D-MEM) (1X), flüssig (hohe Glukose)</td><td>Invitrogen</td><td>11971-025</td><td>Dieses Medium enthält keine Phosphate</td></tr><tr><td>Anti Flag M2 affiinty gel</td><td>Sigma</td><td>A2220</td><td>Für ein gleichwertiges Produkt mit rotem Gel (nützlich, um die Kügelchen leichter sichtbar zu machen), verwenden Sie Kat. Nr. F2426.</td></tr><tr><td>Extra dicker Löschfilter</td><td>Bio-Rad</td><td>1703965</td><td></td></tr><tr><td>Ponceau S Lösung</td><td>Sigma</td><td>P7170</td><td></td></tr></tbody></table>

metabolische markierung von leucin rich-repeat-kinasen 1 und 2 mit radioaktivem phosphat

Metabolic Labeling of Leucine Rich Repeat Kinases 1 and 2 with Radioactive Phosphate

Leucin-reichen Repeat-Kinasen 1 und 2 (LRRK1 und LRRK2) Paraloge, die eine ähnliche Domänenorganisation zu teilen, die eine Serin-Threonin-Kinasedomäne, einem Ras komplexer Proteine ​​Domain (ROC), einer C-terminalen Domäne des ROC (COR), und Leucin-reichen und Ankyrin-Repeats, wie am N-Terminus. Die genaue Rolle der zellulären LRRK1 und LRRK2 müssen noch aufgeklärt werden, aber LRRK1 in Tyrosinkinase-Rezeptor-Signal 1,2 gebracht worden, während LRRK2 in der Pathogenese von Parkinson-Krankheit 3,4 gebracht. In diesem Bericht stellen wir ein Protokoll, um die LRRK1 und LRRK2-Proteine ​​in Zellen, die mit 32 P-Orthophosphat zu kennzeichnen, wodurch ein Mittel, um die Gesamt Phosphorylierung dieser 2-Proteine ​​in Zellen zu messen bietet. Kurz, getaggt Affinität LRRK Proteine ​​in HEK293T Zellen, die Medium mit 32 P-Orthophosphat ausgesetzt sind, zum Ausdruck gebracht. Die 32 P-Orthophosphat von den Zellen assimiliert nach wenigenStunden Inkubation und alle Moleküle in der Zelle, die Phosphate sind dabei radioaktiv markiert. Über die Affinitätsmarkierung (3xflag) die LRRK Proteine ​​von anderen zellulären Komponenten durch Immunpräzipitation isoliert. Immunpräzipitate werden dann über SDS-PAGE aufgetrennt, auf PVDF-Membranen und Analyse der enthaltenen Phosphate durch Autoradiographie (32 P-Signal) und Western-Detektion (Protein-Signal) der Proteine ​​auf den Blots durchgeführt. Das Protokoll kann leicht angepasst werden, um die Phosphorylierung von einem anderen Protein, das in Zellen exprimiert wird und durch Immunpräzipitation isoliert werden kann, zu überwachen.

<html> Um die Gesamt Phosphorylierung von LRRK1 und LRRK2 in Zellen zu vergleichen, getaggt 3xflag LRRK1 und LRRK2 wurden in HEK293T-Zellen 15 ausgedrückt. Zellen wurden in 6-Well-Platten und mit 32 P markiert und analysiert, wie oben in dem Protokoll Text beschrieben. Abbildung 1 zeigt repräsentative Ergebnisse für die metabolische Markierung von LRRK1 und LRRK2 in HEK293T-Zellen. Radioaktiven Phosphateinbau wird sowohl LRRK1 und LRRK2 beobachtet. Nach Quantifizierung der 32</...

Leucin-reichen Repeat-Kinasen 1 und 2 (LRRK1 und LRRK2) sind Multidomänen-Proteine, die sowohl GTPase und Kinase-Domänen kodieren, und die in Zellen phosphoryliert sind. Hier präsentieren wir ein Protokoll zur LRRK1 und LRRK2 in Zellen mit 32 P-Orthophosphat zu kennzeichnen, wodurch ein Mittel, um ihre Gesamtzell Phosphorylierung zu messen bietet.

Metabolische Markierung von Leucin Rich-Repeat-Kinasen 1 und 2 mit radioaktivem Phosphat

Leucine rich repeat kinases 1 and 2 (LRRK1 and LRRK2) are paralogs which share a similar domain organization, including a serine-threonine kinase domain, ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, die interessierenden Proteine mit radioaktiven Phosphaten zu markieren, um die Proteine und die zellulären Phosphorylierungsniveaus zu quantifizieren. Dies wird erreicht, indem Zellen in Gegenwart von Phosphor 32 kultiviert werden, um die Phosphatmodifikationen von Proteinen, die in den Zellen exprimiert werden, radioaktiv zu markieren. In einem zweiten Schritt werden markierte Zellen lysiert und Lysate mit einem Affinitätskügelchen inkubiert, um die zu analysierenden Proteine immunaufzureinigen.Als nächstes werden Proben von markierten und gereinigten Proteinen auf Natriumsulfat und Polyacrylamid-Gelelektrophorese aufgebracht und auf Polyolainfluoridmembranen geblottet. Um den Einbau von radioaktivem Phosphat und den Proteingehalt nachzuweisen, werden Ergebnisse erzielt, die zeigen, dass die leucinreichen Repeatkinasen eins und zwei, abgekürzt L rrk one und L rrk two, in Zellen auf vergleichbare Werte phosphoryliert sind, basierend auf Autoradiographie und Immundetektion. Ein Hauptvorteil der metabolischen Markierungstechnik im Vergleich zu anderen Techniken wie Phospho, Immunblotting, besteht darin, dass diese Technik die Bestimmung der gesamten zellulären Phosphorylierungsniveaus von Proteinen ermöglicht, auch für Proteine, für die keine Phospho-Antikörper verfügbar sind.Ein weiterer großer Vorteil dieser Technik besteht darin, dass quantitative Vergleiche zwischen verschiedenen Proteinen in ihrem gesamten zellulären Phosphorylierungsgrad durchgeführt werden können. Das Verfahren wird von F gao, einem Techniker aus unserem Labor, demonstriert. Um mit der Kultivierung von HEC 2 93 T-Zelllinien unter Standardkulturbedingungen in dcos modifiziertem Eagle, Medium oder DMM mit 8% fötalem Kalb, Serum und Gentamycin zu beginnen. Expandieren Sie die Platte und exprimieren Sie das mit L rrk markierte Triple-Flag-Protein über Transfektion oder lentivirale Vektor-vermittelte Transduktion, wie im Textprotokoll beschrieben.Wenn die Zellen zu 80 bis 100 % konfluent sind, spülen Sie sie mit vorgewärmtem phosphatfreiem DMM. Unter laminarer Strömung wird ein Falcon-Röhrchen mit 2,1 Millilitern phosphatfreiem TM pro m pro Sechs-Well-Platte von Zellen vorbereitet, die mit Phosphor markiert werden sollen. 32 Orthophosphat.Bereiten Sie den Prüfstand vor, an dem die Experimente mit ionisierender Strahlung durchgeführt werden. Der Arbeitsraum ist mit einer Auffangmatte abgedeckt, auf die eine Schutzfolie aus saugfähigem Material gelegt wird. Sorgen Sie auch für einen Plexiglasbehälter auf der Arbeitsfläche und legen Sie das Rohr mit dem phosphatfreien Medium hinein.Nehmen Sie den mit Blei ausgekleideten Behälter mit der Durchstechflasche mit dem Phosphor 32-Etikett Orthophosphat aus dem Kühlschrank und bringen Sie ihn zur Radioaktivitätsbank. Überwachen Sie den Behälter auf externe radioaktive Kontamination mit einem Geigerzähler und verdünnen Sie das mit Phosphor 32 markierte Orthophosphat in das Röhrchen mit phosphatfreiem DMEM. Fügen Sie eine Konzentration von 24 Mikrocurie pro Milliliter hinzu.Bewahren Sie die Tube im Plexiglasglas auf. Verschließen Sie den Behälter mit dem Rest des mit Phosphor 32 gekennzeichneten Orthophosphats, bevor Sie ihn wieder in den Kühlschrank stellen. Nehmen Sie anschließend die sechs Well-Platten mit den zu markierenden Zellen aus dem Inkubator und stellen Sie sie auf die Radioaktivitätsbank.Den mittleren Überstand entfernen und entsorgen. Geben Sie dann zwei Milliliter des phosphatfreien Mediums hinzu, das Phosphor enthält. 32 markiertes Orthophosphat pro Well.Legen Sie die Kulturplatten in eine Plexiglasbox und überwachen Sie den Behälter dann mit einem Geigerzähler auf externe radioaktive Kontamination. Bringen Sie dann die Plexiglasbox mit den Zellen in einen eukaryotischen Zellinkubator, der der isotopischen Stoffwechselmarkierung gewidmet ist, und inkubieren Sie die Zellen für ein bis 20 Stunden. An diesem Punkt des Protokolls können die Zellen mit einer Verbindung behandelt werden, falls gewünscht, wie in dem Textprotokoll angewiesen. Nach der Zellbehandlung und Inkubation wird das Medium aus den Zellen entfernt und in ein Abfallsammelröhrchen entsorgt, das in das Plexiglasgefäß gelegt wird.Spülen Sie die Zellen zweimal mit zwei Millilitern eiskalter, gepufferter Tris-Kochsalzlösung. Entsorgen Sie die Spüllösung in das Abfallsammelrohr. Geben Sie dann 0,5 Milliliter eiskalten Immunpräzipitations-Lysepuffer in jede Vertiefung und sammeln Sie das Lysat durch Auf- und Abpipettieren.Um alle lysierten Zellen zu lösen, wird das Lysat in ein Mikrozentrifugenröhrchen überführt und mindestens 10 Minuten vor der Zentrifusion auf Eis inkubiert, wie im Textprotokoll angegeben, um das interessierende Protein durch Immunreinigung zu isolieren. Übertragen Sie zunächst die Mikrozentrifugenröhrchen mit Zentrifugenlysaten zurück auf Eis. Anschließend wird der Überstand in Mikrozentrifugenröhrchen mit einem Fassungsvermögen von 10 Mikrolitern (10 Mikroliter Bettvolumen) M und zwei Drehzahlen pipettiert.Äquilibriert, wie im Textprotokoll beschrieben, übertragen Sie die Mikrozentrifugenröhrchen in ein 50-Milliliter-Röhrchen. Nachdem Sie die Mikrozentrifugenröhrchen in beschriftete 50-Milliliter-Röhrchen auf Eis übertragen haben, legen Sie die Proben auf eine rotierende Vorrichtung hinter einem Plexiglasschild in dem dafür vorgesehenen Bereich eines Kühlraums, um sie ein bis 20 Stunden lang nach der Inkubation bei vier Grad Celsius zu mischen, drehen Sie die proteingebundene Flagge M zwei aro-Kügelchen in Mikrozentrifugenröhrchen herunter, nachdem Sie den Überstand in ein Abfallsammelröhrchen entsorgt haben. Fahren Sie mit dem Waschen der Kügelchen fort, wie im Textprotokoll beschrieben.Anschließend werden die gewaschenen Kügelchen in 40 Mikrolitern SDS-Ladepuffer für IP-Proben resuspendiert. Erhitzen Sie die Proben im Ladepuffer zwei Minuten lang auf 95 Grad Celsius, bevor Sie sie eine Minute lang bei mehr als 1000 Mal g zentrifugieren, um die Kügelchen zu pelletieren. Bereiten Sie das Proteingelelektrophoresemodul auf der Radioaktivitätsbank hinter einem Perspec-Bildschirm vor. Laden Sie die Proben auf drei bis 8 %T Trisacetat-SDS-Seitengele, einschließlich eines Molekulargewichtsmarkers, der zur Unterscheidung der Größen von Proteinen mit hohem Molekulargewicht vor der Elektrophorese geeignet ist. Nach der Elektrophorese nehmen Sie das Gel aus dem Kunststoffgehäuse und geben Sie es in einen Behälter mit Western-Blotting-Transferpuffer.Nach der Vorbereitung des Gels und der PVDF-Membran. Bereiten Sie das Blotting-Sandwich auf der Oberfläche des Semi-Dry-Blotting-Moduls vor, wie im Textprotokoll beschrieben. Übertragen Sie die Proteine nach dem Transfer ein bis zwei Stunden lang bei 15 Volt.Entfernen Sie die PVDF-Membran mit den geblotteten Proteinen aus dem Blotting-Modul und trocknen Sie die Membran, um eine Autoradiographie durchzuführen. Setzen Sie die Membran zunächst ein bis fünf Tage lang einer Phosphoreszenzplatte aus. Lesen Sie den Phosphor 32 mit einem Phosphoreszenzscanner von der belichteten Phosphoreszenzplatte ab und speichern Sie das Bild als hochauflösendes tiff, um den Proteinspiegel durch Immundetektion nachzuweisen.Rehydrieren Sie die Membranen, indem Sie sie kurz in Methanol tauchen und dann in ein flaches Blott-Inkubationsgefäß mit PBS überführen. Blockieren Sie die Membranen in PBST mit 5 % Milch. Inkubieren Sie die Blots mit Anti-LR K zwei Antikörpern oder Anti-Flag Antikörpern und verarbeiten Sie sie mit geeigneten Waschschritten und sekundärer Antikörperinkubation weiter.Führen Sie nach der Antikörperapplikation einen Chemilumineszenznachweis durch, um die relativen Proteinspiegel von LRRK zwei zu bestätigen. Schließlich wird die Quantifizierung der Assoziation von Phosphor 32 in LRK zwei mittels diametraler Analyse durchgeführt, wie sie im Textprotokoll beschrieben ist. Hier sind repräsentative Ergebnisse für die metabolische Markierung von L Rrk eins und L Rrk zwei in HEC 2 93 T-Zellen gezeigt. Dargestellt ist ein repräsentatives Autoradiogramm des Phosphor-32-Einbaus sowie ein repräsentativer Western Blot der Detektion L Rrk one und L Rrk two über ihre Triple-Flag-Tags.Der Einbau von radioaktivem Phosphat wird sowohl für L rrk eins als auch für L rrk zwei beobachtet. Nach Quantifizierung des Phosphorgehalts normalisierten sich die 32 Spiegel auf die Proteinwerte, die durch dichtemetrische Analyse des Immunnachweises mit Anti-Flag-Antikörpern gemessen wurden. Es wurde festgestellt, dass L rrk eins unter den getesteten Bedingungen einen durchschnittlichen Phosphorylierungsgrad aufwies, der niedriger ist als L rrk zwei, obwohl die statistische Signifikanz nicht erreicht wird. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Radioaktivität äußerst gefährlich sein kann und die Vorsichtsmaßnahmen wie sehr persönliche Schutzausrüstung und das Arbeiten über Verfahren, die von der Sicherheitsabteilung Ihrer Einrichtung bereitgestellt werden, immer über die Durchführung dieses Protokolls getroffen werden sollten.

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Stoffwechselweg der Firmung und der Entdeckung durch 13 C-Kennzeichnung von proteinogenen Aminosäuren

Phosphoinositiden signalisieren Lipide, deren relative Häufigkeit schnell ändert als Reaktion auf verschiedene Reize. Dieser Artikel beschreibt eine Methode, um die Fülle der Phosphoinositiden Messung durch metabolisch Markierung von Zellen mit 3 H-myo-Inositol, gefolgt von Extraktion und Deacylierung. Extrahiert glycero-inositides werden dann durch Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie getrennt und durch Strömungs Szintillations quantifiziert.

Radiomarkierung und Quantifizierung von Cellular Ebenen Phosphoinositide von High Performance Liquid Chromatography-gekoppelten Durchflussscintilla

Wir beschreiben hier eine Methode zur Identifizierung mehrerer Phosphorylierungen eines intrinsisch ungeordneten Proteins mittels Kernspinresonanzspektroskopie (NMR), wobei das Tau-Protein als Fallstudie verwendet wird. Rekombinantes Tau wird vor der Datenerfassung und -analyse in vitro durch eine Kinase isotopenangereichert und modifiziert.

Kernresonanzspektroskopie zur Identifizierung von Multiple Phosphorylierungen von intrinsisch ungeordneten Proteinen

Proteinkinasen sind hochentwickelte Signalisierungsenzyme und Gerüste, die für die inter- und intrazelluläre Signaltransduktion kritisch sind. Wir stellen ein Protokoll zur Messung der Kinaseaktivität durch die Verwendung von radioaktiv markiertem Adenosintriphosphat ([γ- 32 P] ATP) vor, ein zuverlässiges Verfahren zur Erleichterung der zellulären Signalregulation.

Test der Proteinkinase-Aktivität mit radioaktiv markiertem ATP

Peptid-Konkurrenz-Assays sind weit verbreitet in einer Vielzahl von molekularen und immunologischen Experimenten verwendet. Dieses Papier beschreibt eine detaillierte Methode für einen in vitro- Oligopeptid-konkurrierenden Kinase-Assay und die damit verbundenen Validierungsverfahren, die nützlich sein können, um spezifische Phosphorylierungsstellen zu finden.

Oligopeptid-Konkurrenz-Assay zur Phosphorylierungsbestimmung

Die vorliegende Studie beschreibt eine einfache Methode zur Erkennung von endogenen Ebenen der Rab10 Phosphorylierung von Leucin-reiche wiederholen Kinase 2.

Rab10 Phosphorylierung Erkennung von LRRK2 Aktivität mit SDS-PAGE mit einem Phosphat-Bindung

Wir charakterisierten ein neues Kinase-Protein mit robusten biochemischen Ansätzen: Western Blot-Analyse mit einem speziellen Antikörper an verschiedenen Zelllinien und Geweben, Wechselwirkungen durch Coimmunozipitungsexperimente, Kinase-Aktivität, die von Western Blot mit einem phosphospezifischen Antikörper und durch die ATP-Kennzeichnung von32P.

Charakterisierung auf molekularer Ebene mit robusten biochemischen Ansätzen eines neuen Kinase-Proteins

Dieses Protokoll beschreibt einen nicht radioaktiven Test zur Messung der Kinaseaktivität von Polynukleotid-Kinasen (PNKs) auf kleinen DNA- und RNA-Substraten.

Nichtradioaktiver Test zur Messung der Polynukleotid-Phosphorylierung kleiner Nukleotidsubstrate

Dieses Video zeigt Techniken für die Kennzeichnung von menschlichen embryonalen Stammzellen und mesenchymalen Stammzellen mit fluoreszierenden Farbstoffen. Diese Technik kann für eine in vivo Verfolgung der transplantierten Stammzellen mit optischen Bildgebung und zur histopathologischen Korrelation mit Fluoreszenzmikroskopie eingesetzt werden.

Labeling Stammzellen mit fluoreszierenden Farbstoffen zur nicht-invasiven Detektion mit Optical Imaging

Lernen Sie die metabolische Markierung von LRRK1 und LRRK2 mit radioaktivem Phosphat-32 in Zellen. Diese Methode ermöglicht die Quantifizierung der zellulären Phosphorylierungsniveaus dieser Kinasen.

Metabolische Markierung von Leucin Rich-Repeat-Kinasen 1 und 2 mit radioaktivem Phosphat

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