Schnelle Micro-Iontophorese von Glutamat und GABA: Ein nützliches Tool, um Synaptic Integration Untersuchen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Integration von Inputs entlang der sehr komplexen Struktur des neuronalen dendritischen Baums zu verstehen, die schließlich zur neuronalen Ausgabe von Aktionspotentialen am Axon führt. Dies wird erreicht, indem zunächst die entsprechenden ionenaporetischen Pipetten gezogen werden. Der zweite Schritt besteht darin, die ionenaporetischen Pipetten zu testen und ihre Kapazität korrekt zu kompensieren.

Legen Sie als Nächstes die Konfiguration der gesamten Zelle fest. Der letzte Schritt besteht darin, sich dem Dendriten zu nähern und postsynaptische Potentiale in der aufgezeichneten Zelle hervorzurufen. Letztendlich ermöglicht die schnelle Mikro-Iontophorese die Untersuchung der Integration mehrerer Inputs, die auch zu verschiedenen Neurotransmittersystemen gehören können.

Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im neurowissenschaftlichen Bereich zu beantworten, wie und unter welchen Bedingungen inhibitorische und exzitatorische Inputs integriert werden. Dies kann zu neuronaler Ausgabe führen. Beginnen Sie diesen Vorgang, indem Sie Pipetten mit sehr kleinen Spitzen ziehen, um die Neurotransmitter-Iontophorese zu kontrollieren.

Mit einem horizontalen oder vertikalen Pipettenabzieher lassen sich mit mehreren Zugschritten kleine feine Spitzen erzielen. Die Spitze sollte aber trotzdem steif genug sein, um in das Gewebe einzudringen. Richten Sie als Nächstes den ionenaporetischen Verstärker ein, um die Pipettenleistung in einer Kammer ohne Gewebe zu testen.

Füllen Sie die Pipette mit Neurotransmitter und farbstoffhaltiger Lösung. Setze es dann in das A CSF ein. Kompensieren Sie anschließend die Kapazität mit dem Verstärker.

In der Regel haben sehr scharfe Pipetten eine höhere Kapazität als stumpfe, nachdem ihre Kapazität korrekt kompensiert wurde. Überprüfen Sie den Widerstand der Pipette mit der eingebauten Funktion des Mikro-Iontophorese-Verstärkers. Die Pipette sollte einen Widerstand zwischen 25 und 90 Megaohm haben.

Fokussieren Sie sich anschließend auf die Pipettenspitze mit einem 60 x oder 40 x Wasserimmersionsobjektiv. Wechseln Sie dann zur Fluoreszenzbildgebung. Wenn fluoreszierendes D aus der Pipettenspitze austritt, legen Sie einen kleinen positiven Retentionsstrom im Falle von Glutamat oder einen negativen Reservstrom im Fall von Gaba an.

Wenn das nicht hilft, das Leck zu verhindern, wechsle die Pipette. Legen Sie anschließend einen starken Stufenstrom an die Pipette an oder verwenden Sie den manuellen Auslöser Überwachen Sie das Fluoreszenzbild der Pipettenspitze, um zu sehen, ob die Lösung ausgestoßen werden kann. Wenn keine sichtbare Leckage vorhanden ist und der Testauswurf erfolgreich ist, überprüfen Sie die Kapazitätskompensation und starten Sie den Versuch.

Im Allgemeinen können ionenaporetische Ereignisse je nach gewünschtem Experiment an definierten Orten evoziert werden. Zum Beispiel an einem stacheligen Dendriten für die Glutamat-Mikrophorese oder am dendritischen Schaft, Soma- oder Axon-Anfangssegment für die GABA-Mikrophorese. Nach dem Festlegen der gesamten Zellkonfiguration platzieren Sie die ionenaporetische Pipettenspitze in einem Abstand von etwa einem Mikrometer zum Dendriten oder einem anderen interessierenden Kompartiment.

Stellen Sie sicher, dass kein Neurotransmitter austritt und dass die Pipette und die Kapazität korrekt kompensiert werden. Wenn die Annäherung an die Zelle mit einer mit Glutamat gefüllten ionenaporetischen Pipette eine nachweisbare Depolarisation der Membran verursacht, tritt potentielles Glutamat aus der Pipette aus. Versuchen Sie, den Retentionsstrom einzustellen oder die ionenaporetische Pipette zu wechseln.

Legen Sie anschließend kurze negative Impulse an die ionenaporetische Pipette für den Glutamatstrom beginnend bei Null an und erhöhen Sie den Strom systematisch. Dies hilft herauszufinden, in welchem Bereich der Ionenaporetische Strom im spezifischen Versuchsaufbau die gewünschten Reaktionen hervorruft. Wenn keine Reaktion erkennbar ist, heben Sie die ionenaporetische Pipette einige hundert Mikrometer an und legen Sie einen starken Strom von mehr als 0,1 Mikroampere an, um die Spitze zu reinigen.

Stellen Sie dann die Kapazitätskompensation ein. Nähern Sie sich erneut der Zelle und versuchen Sie es erneut. Wenn immer noch keine Reaktion erfolgt, versuchen Sie, den Haltestrom zu reduzieren.

Seien Sie jedoch sehr vorsichtig mit der Reduzierung des Retentionsstroms, da dies zu einer unkontrollierten Freisetzung von Neurotransmittern führen kann. Überwachen Sie daher ständig die Aufzeichnung, um entsprechende Änderungen des Membranpotentials zu erkennen. Wenn Glutamat aus der Pipette austritt, lehnen Sie die Pipette für die Gaba-Mikro-Iontophorese ab.

Füllen Sie eine neue Pipette mit GABA-Lösung. Es ist sehr wichtig, die richtige Polarität für den Auswurfstrom zu haben, wenn der Transmitter in der Pipette gewechselt wird. Ändern Sie für den GABA-Auswurf die Einstellungen auf normal, was zu einem positiven Auswurfstrom führt, um die GABAergen Ereignisse leichter zu erkennen.

Injizieren Sie lange Stromschritte, die zu Änderungen des Membranpotentials von etwa minus 100 Millivolt auf minus 48 Millivolt führen. Mit diesem Protokoll kann die treibende Kraft der Chloridionen erhöht werden, wodurch die Ereignisse prominenter werden und das Gleichgewicht des Ereignisses sichtbar wird. Diese schematische Zeichnung zeigt die Mikro-Iontophorese mit einfachem Glutamat.

Das hier gezeigte EPSP wird in einem pyramidalen Neuron von CA one mit Glutamat-Iontophorese evoziert, und der hier dargestellte dendritische Natrium-Calcium-Spike wird an einem Dendriten eines pyramidalen Neurons von CA one evoziert. Die untere Kurve zeigt die Steigung der Spannungskurve an, und der Peak gibt die Spitzensteigung der dendritischen Spitze an. Wenn der an die Ionophorpipette angelegte Strom erhöht wird, nimmt die EPSP-Amplitude zu, bis sie die Aktionspotentialschwelle überschreitet.

Die schematische Zeichnung zeigt die doppelte Glutamat-Mikro-Iontophorese an verschiedenen Stellen des dendritischen Baumes. Dieses ionenretische EPSP wird an einem proximalen Dendri eines pyramidalen Neurons evoziert, und dieses wird an einem distalen Dite evoziert. Diese schematische Zeichnung zeigt die GABA-Mikrophorese.

Das hier gezeigte retische IPSP wird an einem proximalen Dendriten eines Pyramidenneurons aus Kalifornien evoziert, und eine lange Strominjektion mit unterschiedlichen Amplituden, die über die Patch-Pipette an ein Pyramidenneuron von Kalifornien angelegt wird, hilft bei der Bestimmung des Umkehrpotentials des evozierten Ereignisses; das evozierte Ereignis kehrt sich bei etwa minus 70 Millivolt um. Schließlich zeigt diese schematische Zeichnung die gleichzeitige Glutamat- und GABA-Iontophorese, die die Integration von Anregung und Hemmung untersucht. Die dendritischen Spikes, die durch die retische Anwendung von Glutamat allein hervorgerufen werden.

In den nachfolgenden Sweeps werden hier gezeigt. Die Spitzen der unteren Leiterbahn, die die Steigung der Spannungskurve zeigen, deuten auf das Auftreten der dendritischen Spikes hin, und hier wird nur GABAerge IPSP ionisch evoziert. Schließlich werden sowohl das glutamaterge als auch das GABAerge Ereignis zusammen evoziert, was zur Hemmung der dendritischen Spikes führt.

Nach dem Anschauen dieses Videos sollte es sehr einfach sein, eine schnelle Mikroresis in Ihrem Labor zu etablieren und einen Einblick zu gewinnen, wie synaptische Inputs in Neuronen integriert sind.