Name: Herstellung von primären Neuronen für die Visualisierung von Neuriten in einem tiefgefrorenen Zustand unter Verwendung von Kryo-Elektronentomographie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 59 s
Description: Erfahren Sie die Vorbereitung primärer Rattenneuronen auf EM-Gittern für Kryo-Elektronentomographie. Diese Methode ermöglicht die hochaufgelöste 3D-Visualisierung von Neuriten im gefrorenen Zustand ohne chemische Fixierung.

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Diese Forschung wurde von den NIH Zuschüsse (PN2EY016525 und P41GM103832) unterstützt. SHS wurde von einem Stipendium der Nanobiologie interdisziplinäre Graduate Training Program des WM Keck Zentrum für interdisziplinäre Bioscience Ausbildung von der Golfküste Konsortien (NIH Grant No T32EB009379) unterstützt. SHS seziert, wuchs und Stein DRG und Hippocampus-Zellen; gesammelt Kryo-EM-und Kryo-ET Daten der DRG und Hippocampus Axone, rekonstruiert und Farb kommentierte den Neigungs Serie. MRG seziert und bereitgestellt Hippocampus-Zellen in MNR Labor. SC in Kippserie Annotation unterstützt. SHS wurde von CW auf, wie man zu sezieren und zu wachsen Neuronen trainiert. SHS, WCM und WC konzipiert die Experimente. SHS bereit, das Manuskript mit dem Input von anderen Autoren. Dieses Video wurde am Center for Cellular Imaging und Nanoanalytik (C-CINA) des Biozentrum t gefilmter Universität Basel. C-CINA in der Abteilung für Biosysteme (D-BSSE) der ETH Zürich, in Basel, in der Schweiz integriert.

1. Zubereitung der Speisen mit EM Grids für Überzug primären Neuronen <ol><li> Überprüfen Sie die Integrität der löchrigen Kohlenstoff auf den Gold-EM-Gitter mit einem Lichtmikroskop bei einer Vergrößerung von mindestens 25X. Stellen Sie sicher, Kohlenstoff Löcher sind&gt; 98% intakt. </li><li> Für Beschichtung primären Neuronen, verwenden Sie einen Bunsenbrenner flamm sterilisieren EM-Gitter und gleichzeitig machen sie hydrophil. Pinzette zu holen die EM Gitter am Rand, nicht das zentrale Gitterbereich. ACHTUNG: Lassen Sie eine brenn Bunsenbrenner unbeaufsichtigt und nicht Handschuhen oder Pinzette mit Kunststoff-Komponenten während der Durchführung dieser Schritte aus: <ol><li> Vor dem Anzünden des Bunsenbrenners, stellen Sie die Luft-und Gas Anpassungen minimal offene Position. </li><li> Zünden Sie die Bunsenbrenner mit einem Stürmer Feuerstein oder Gasfeuerzeug. </li><li> Ändern Sie die Luft-und Gas Anpassungen, um eine kleine, blau innere Flamme in einem größeren, helleren blauen / violetten Flamme zu erreichen. Die Spitze der inneren Flamme ist der heißeste Teil der Flamme. Der Knopf unterunterhalb der Brenner stellt die Menge des Gases, das in das Brennerrohr, während das Rohr des Brenners geschwenkt werden, um die Menge an Luft, die in den Brenner anzupassen. Durch Drehen des Lufteinstellung im Uhrzeigersinn verringert die Luft (was in einer lila Flamme) und gegen den Uhrzeigersinn erhöht die Luft (was eine gelbe Flamme). </li><li> Mit Pinzette aus Metall (keine Kunststoffteile), um die EM Netz halten, geben sie schnell durch die Flamme zweimal, mit Blick auf Kohlenstoff-Seite nach oben. Die Kohlenstoff-Seiten wird matter (weniger glänzend) sind und mit einer gräulichen Farbton als die andere Seite. </li><li> Das Raster (Kohlenstoff-Seite nach oben) sofort in die Mitte des Glasbodenschale innerhalb von 10 cm des Bunsenbrenners gebracht übertragen. Verwenden Sie eine EM Gitter pro Schale (Abbildung 1). Verwenden Sie nur Glasboden Gerichte, die vorsterilisierten werden, dh über Gamma-Bestrahlung. </li></ol></li><li> Verwenden Sie ein Lichtmikroskop, um das Raster Integrität (Kohlenstoff Löcher intakt), während er weiterhin den EM Gitter im Inneren des Glas bott überprüfenom Schüssel (um eine Kontamination zu vermeiden). Bei der Anwendung jeder Stoff auf dem Gitter oder etwas, das in Kontakt mit den Neuronen kommen wird, sterile Verfahren und sterile Pipettenspitzen. </li><li> In einer Gewebekultur Kapuze mit sterilen Verfahren gelten 250 ul des geeigneten Beschichtungssubstanz langsam und vorsichtig an die zentrale Glasfläche der Petrischale. Stellen Sie sicher, dass der geeigneten Beschichtungssubstanz umfasst die gesamte EM-Raster. <ol><li> Für hippocampale Neuronen verwenden, Poly-L-Lysin (PLL, 1 mg / ml) als Beschichtungsstoff, hergestellt wie zuvor beschrieben 19. Beachten Sie, dass 250 ul pro EM Gitter benötigt, pro Schale, so skaliert die Batch entsprechend. Für Hinterwurzelganglien (DRG) Neuronen, verwenden Sie eine gallertartige Proteinmischung von Engelbreth-Holm-Swarm (EHS)-Maus-Sarkom-Zellen sezerniert (siehe Tabelle der Materialien und Reagenzien) als Beschichtungsstoff, bereiten Sie wie folgt. Beachten Sie, dass 250 ul pro EM Gitter benötigt, pro Schale, so skaliert die Batch entsprechend. <ol><li> Tauen Sie eine Vorratsflascheder gallertartige Proteinmischung von Engelbreth-Holm-Swarm (EHS)-Maus-Sarkom-Zellen bei 4 ° C über Nacht abgesondert </li><li> Halten Sie die kalte gallertartige Proteinmischung von Engelbreth-Holm-Swarm (EHS)-Maus-Sarkom-Zellen und alle verwendet, um die Lösung zu Komponenten, dh, indem man sie auf Eis ausgeschieden wird. </li><li> Während auf Eis, verdünnt diese gelatineartigen Protein-Mischung in Neurobasal Medium, um eine Verdünnung von 1:20 zu ergeben (dh verdünnte 500 ul des gelartigen Proteinmischung in 10 ml Neurobasalmedium). </li><li> Teilen verdünnt gallertartige Proteingemisch in 1 ml Aliquots, und keine zusätzlichen Aliquots bei -20 ° C sofort speichern </li><li> Bewerben 250 ul pro EM Raster, pro Gericht, wie in Abschnitt 1.4 beschrieben. </li></ol></li></ol></li><li> Decken Sie die Petrischale mit seiner Ober-und inkubieren (entweder mit PLL zur Hippocampus-Proben, OR mit der gallertartige Proteinmischung für DRG-Proben) für 1 h bei Raumtemperatur in der Gewebekultur Kapuze. </li><li> Aspibewerten alle PLL (für Hippocampus-Proben) oder die gallertartige Proteingemisch (DRG für Proben) von den Gerichten. Um dies zu tun, verwenden Sie das Vakuumsystem in der Gewebekultur Kapuze. Verwenden Sie eine sterile Pipettenspitze in die Vakuumröhre angebracht. Vermeiden Sie direkten Kontakt mit dem EM-Raster. </li><li> Verwenden einen einstellbaren Luftverdrängungspipette zu 250 ul sterilem PBS (Phosphat-gepufferte Salzlösung) sorgfältig gelten für die EM Gitter in dem mittleren Bereich jeder Glaspetrischale, so dass der EM Gitter vollständig von PBS behandelt. Dann saugen Sie den PBS aus jedem Gericht. 3x wiederholen. </li><li> Lassen Sie die Gerichte, die mit EM-Gitter unter der Gewebekultur Haube für 15 Minuten trocknen. Achten Sie darauf, sie durch die Kontrolle unter dem Lichtmikroskop in der Gewebekulturraum vollständig trocken sind. Stellen Sie sicher, es gibt keine Blasen an Feuchtigkeit in der Startaufstellung. Wenn ja, sorgfältig absaugen neben dem EM-Raster, um diese zusätzliche Feuchtigkeit zu beseitigen. Die beschichtete Gitter sollte sofort für die Plattierung der Neuronen verwendet werden. </li></ol> 2. Vorbereitung und PlAting Primäre Neuronen auf EM-Grids <ol><li> Um primäre Neuronen ersten sezieren, trypsinize (mit 2,5% Trypsin) und verreiben, um die Platte hippocampi (oder Hinterwurzelganglien von 18 Tage alten Rattenembryonen) in einzelne Zellen zu distanzieren, wie zuvor beschrieben 19. <ol><li> Man reibt ist ein gebräuchlicher Begriff von Neurobiologen zur distanziert Klumpen von Zellen in einzelne Zellen zu beschreiben, vor allem durch die Verwendung einer Glaspipette mit einer feuerpolierten Spitze. Das Ergebnis wird durch vorsichtig und langsam Ziehen und Lösen der Zellen, oben und unten, mehrere Male (~ 30) durch die Pipette erreicht. </li></ol></li><li> Befolgen Sie die Anweisungen, wie zuvor für DRG-Dissektion und Zellisolierung 24 beschrieben, unter Hinweis auf 0,25% Trypsin (in HBSS) verwenden, um die Ratten-DRG-Neuronen isolieren, verwenden, anstatt die Enzyme vorgeschlagen (Papain, Kollagenase / Dispase), die besser geeignet sind für Maus DRG-Neuronen. </li><li> Berechnen Sie die Anzahl der isolierten Neuronen (dh mit einer Zählkammer)und diesen Wert um das entsprechende Volumen der Zellen zu berechnen, die jedem Gericht beantragen, um eine Konzentration von 50.000 Zellen / ml pro Schale zu erreichen. Die maximale Lautstärke anzuwenden ist 250 ul. Beachten Sie, dass dies nur füllt den zentralen Glasfläche nicht die gesamte Schale. </li><li> Geschirr für 30 Minuten in einem CO 2-Inkubator bei 37 ° C. Lassen Zellen sich zu erholen und zu halten. </li><li> Langsam zu jedem Gericht hinzufügen 1,5 ml erwärmt Medien, kümmert sich nicht um die EM-Netz stören. Die Art der Medien hängt vom Zelltyp (Hippocampus-oder DRG). <ol><li> Die geeignete Medien für entweder 19 oder Hippokampus-Neuronen Hinterwurzelganglienneuronen 24, die in einem 37 ° C Wasserbad vor der Verwendung erwärmt werden. Das Geschirr über Nacht inkubieren im CO 2-Inkubator. </li><li> Für Hippocampus-Neuronen, verändern die Medien am nächsten Tag. Ändern der Hälfte der Medien alle zwei Tage weiter für 14 Tage. Wärmen Sie die Medien in einem 37 ° C Wasserbad vor der Verwendung. </li&gt; <li> Für DRG-Neuronen, dem Tag nach Dissektion / Beschichtung, eine frische Bestand an Medien mit einer anti-mitotische Mittel (Uridin und 5&#39;-Fluoro-2&#39;-desoxyuridin) einen 10 mM Stammlösung von jeweils getrennt, verwenden Sie eine endgültige Konzentration von 10 &amp;mgr; M für jeden. Entfernen Sie die Hälfte des DRG-Medien (875 ul) und fügen Sie 875 ml frisches Medium mit der anti-mitotische Mittel. <ol><li> Für DRG-Neuronen, alle zwei Tage für die erste Woche, alternative verändernden Medien zwischen anti-mitotische Medien-und Standard-DRG-Medien. Für die zweite Woche, ändern Sie Standard-DRG-Medien alle zwei Tage. </li></ol></li></ol></li></ol> 3. Verglasen von Neuronen auf EM-Grids <ol><li> Bereiten Sie alle Geräte und Materialien für das Einfrieren und Lagern der Gold EM-Gitter bei tiefen Temperaturen: eine Verglasung Gerät mit einer feuchten Kammer 17, feinen Punktfach Pinzette zur Verglasung Maschine, lange flache Punkt Pinzette, Dewar (n) von flüssigem Stickstoff (LN 2) coolant Behälter, EM Grid-Storage-Box, Calcium-freier Filterpapier. </li><li> Starten Sie die Verglasungseinrichtung. Stellen Sie die Luftfeuchtigkeit bis 100% und die Temperatur auf 32 ° C. In dem Abschnitt &quot;Console&quot;, stellen Sie die Zeit auf Null Blot Sekunden. Dies ermöglicht die manuelle Lösch durch die Seitenfenster des Feuchtekammer der Verglasung Maschine. </li><li> Gehen Sie mit dem kalziumfreien Filterpapier mit Handschuhen, Schichtung, so dass sie drei Papiere gestapelt sind. Schneiden Sie den Stapel in 0,5 cm breite Streifen, die ~ 2 cm lang sind. Biegen sie in einem 90 ° Winkel, so daß eine Seite des Papiers eine 0,5 cm x 0,5 cm Fläche (Fig. 2). Mit einer Pinzette aus der Mitte Papier und legen Sie es auf einem anderen kalziumfreies Filterpapier bis zum Gebrauch. </li><li> Setzen Sie den Grid-Storage-Button in der Knopfhalter in der Kammer der Verglasung. Füllen Sie den Innenraum des Kühlmittelbehälter mit flüssigem Stickstoff und warten, bis eine vollständige Verdampfung. Füllen Sie den äußeren Kammer the Kühlmittelbehälter mit flüssigem Stickstoff, bis stabile Temperatur erreicht man zum nächsten Schritt. Füllen Sie den Innenraum mit hochreinem gasförmigen Ethan, die in einen flüssigen Zustand in der gekühlten Kammer kondensiert wird. </li><li> Bewegen Sie den Teller (es) aus dem Inkubator zu einem großen 100 mm Polystyrolschale für den Transport zum Verglasen Raum, wenn nicht in der unmittelbaren Umgebung. Mit den spezialisierten Verglasung Pinzette sorgfältig wählen Sie die EM Gitter aus der Schüssel. Beachten welche Seite die Neuronen auf der EM Gitter wächst, wird die Position für den nächsten Schritt wichtig. Verwenden Sie den schwarzen Schiebe-Sperre auf die Pinzette, um sicher zu verriegeln der Pinzette auf die EM-Raster. </li><li> Legen Sie die Pinzette in den Verglasungs Maschine so daß die Seite des EM-Gitter, auf dem die Neuronen auf der linken Seite angeklebt Flächen weg von der Seitenlochöffnung des Verglasungs Maschine. Fahren Sie die Fach Pinzette in den Verglasungs Maschine. </li><li> Setzen Sie den Kühlmittelbehälter in der entsprechenden InhaberVerglasung der Maschine. Es sollte mit angemessenen LN 2 und flüssigem Ethan gefüllt werden. Mit dem entsprechenden Bildschirm Kommando der Verglasung Maschine, heben Sie den Kühlmittelraum nach oben, bis es mit der Unterseite der Feuchtigkeitskammer gespült. </li><li> Mit den flachen Pinzette Punkt, fassen einen Rand des Filterpapiers, so dass die kürzere Seite (die 0,5 cm x 0,5 cm Fläche) senkrecht zu den Pinzetten ist. Diese Fläche wird für Lösch (2B) in direkten Kontakt mit dem EM-Gitter kommen. Das Filterpapier vorsichtig in die Seitenöffnung des Feuchtekammer der Verglasung Maschine (Abbildung 2A). Stabil halten das Papier gegen die EM Gitter (der abgewandten Seite der Probe) für 10 Sekunden. Entsorgen Sie das Papier danach stürzen und sofort einfrieren die Probe in flüssigem Ethan mit der Automatisierung der Verglasung Maschine. </li><li> Ihre tiefgefrorenen EM Netz transferieren Sie einen der Schlitze in einer derGrid-Storage-Tasten. Wiederholen Sie den Vorgang für weitere EM-Gitter in den Gerichten. Die EM Grid-Storage-Tasten in diesen Experimenten verwendet mehrere tiefgefrorenen EM-Gitter zu speichern. </li></ol> 4. Bildsammlung, Verarbeitung und Annotation <ol><li> Fahren Sie mit 2-D-elektronenmikroskopischen Aufnahmen und / oder 3-D-Neige Serie 5 der Neuriten mit einem Kryo-Elektronenmikroskop unter einer Niedrigdosis-Zustand zu sammeln. Die 2-D-Bilder wurden bestimmt, um die Qualität des Netzes in Bezug auf die Dicke des Eises und die möglichen Bereichen zu beurteilen nützlich für die 3-D-Tilt-Serie zu sein. <ol><li> In diesem Fall wurden alle Bilder gesammelt unter Verwendung eines 4k x 4k CCD-Kamera mit einem 200 kV-Elektronen-Mikroskop mit einem einzigen Neigungs flüssigem Stickstoff Kryo Transferhalter ausgestattet angebracht, bei 20k Mikroskopvergrößerung zu einem Zielunterfokus von 7 um und Probenahme von 4,4 Å / Pixel. </li><li> Um ein 3D-Schnittbild der Probe zu erhalten, nehmen Sie eine Reihe von Projektionsbildern, während schrittweise Kippen der Proben alOng einer Achse des Transmissionselektronenmikroskop (TEM). Angesichts der Neigungswinkel und andere experimentelle Einstellungen, gibt es verschiedene Software zur Verfügung, um automatisch die Neigung zu sammeln Serie 5. Die 3-D Kippserie hier dargestellt wurden auf die gleiche Mikroskop mit halbautomatischen Kippserie Erfassungssoftware 26 über einen Bereich von -60 ° bis 60 ° in 5 °-Schritten mit einer Gesamtdosis von ca. 60 E / A 2 gesammelt. </li></ol></li><li> Rekonstruieren Sie den Neigungs Reihe der Neuriten mit Bildverarbeitungssoftware 21, wie zuvor für andere Proben 5,29 beschrieben. </li><li> Farbanno die 3-D-Merkmale der Neuriten durch Segmentieren des ersten Schichtbild und Erzeugen eines Oberflächenmodells unter Verwendung eines 3-D-Bildverarbeitungssoftware, wie zuvor beschrieben 5. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Wir zeigen, dass embryonale Rattenneuronen (Hinterwurzelganglien und Hippocampus) auf Gold-Elektronenmikroskopie (EM) Gittern gewachsen und im Glaskörper Eis dünn genug für ihre Neuriten, die abgebildet werden unter Verwendung von 2-D-Kryo-EM-und 3-D-Kryo-eingefroren werden ET. Während Hippocampus Neuriten haben zuvor mit Kryo-ET 8,10,18,23 abgebildet wurde, detailliert ein Protokoll für die erfolgreiche Replikation genug mit im Handel erhältlichen Geräte gefehlt hat. Darüber hinaus, während ihre Forschungen ...

Neuronen stellen die komplexe Schaltung für die Funktion des zentralen und peripheren Nervensystem durch die Ausarbeitung Dendriten und Axone, um Informationen, die oft recht lang, um mit nachgeschalteten Neuronen kommunizieren. Neuritenwachstum spielt eine fundamentale Rolle in der Embryonalentwicklung und neuronalen Differenzierung und Erhaltung von Neuriten kritisch unterstützt die Funktion des Nervensystems. Neuritische Prozesse verfügen kritisch in neuronalen Verletzungen und Regeneration sowie Erkrankungen des Nervensystems. Die Untersuchung der neuronalen Architektur ist entscheidend, sowohl die normalen und erkrankten Gehirn zu verstehen. Glücklicherweise gibt es physiologisch relevanten neuronalen Zellkultur-Systeme, dass komplexe und heterogene Zellstrukturen rekapitulieren kann. Auf der Grundlage der experimentellen Aufklärung der festen Plattformen effektive Visualisierung Strategien, die qualitativen und quantitativen Analysen der neuronalen Morphologie ermöglichen benötigt. Besonders nützlich wäreist eine detaillierte Methode, die eine einheitliche Plattform zur Visualisierung von Neuriten, beide Axonen und Dendriten im Nanometerbereich enthält. Traditionelle Elektronenmikroskopie erfordert die Verwendung von organischen Lösungsmittels während der Dehydratisierung und Harzeinbettung, die Verzerrungen in den Proben von ihrem wahren Zustand induzieren kann. So die Interpretation der Ergebnisse 4,9,25 Begrenzung - Bis heute sind die meisten strukturellen Charakterisierung auf der Nanometerskala auf größere Zellen oder Geweben, die zu solchen aggressiven Chemikalien ausgesetzt sind, basiert. Darüber hinaus für die Elektronenstrahldurch, Schnitte für Organismen oder Zell Vorsprünge aufweist eine Dicke von mehr als 1 um 12 erforderlich. Schließlich, geschnitten oder gefräst Gewebe Ergebnisse in der Sammlung von diskreten Scheibe spezifischen Datensätzen, so schwerfällig die Definition des Lang Funktion von Neuriten. Selbst für Kryo-EM, in der Schnitt eine tiefgefrorenen Probe möglich ist, stellt die Methode Kompression Artifwirkt ein. In den letzten Jahren haben die Forscher gelernt, wie Neuronen im Hippocampus direkt auf EM-Gitter und Flash-Einfrieren in flüssigem Ethan zu Neuriten mit Kryo-ET 8,10,18,23 anschließend visualisieren wachsen. Doch solche Studien entweder eine Sonderanfertigung 10,23 oder mangelnde Informationen über die Löschschritt zum Erzeugen dünn genug glasigen Eis für Routine-Visualisierung 8,18. Zum Beispiel empfiehlt eine Studie, die Verwendung von 30-40 sec für Abtupfen der EM Gitter 10, jedoch ist dieser Wert nicht für den allgemeinen Gebrauch optimiert, sondern ist spezifisch für diese maßgeschneiderte Tauchgefriergerät. Mit einer Sonderanfertigung, anstatt einen handelsüblichen 17 ein für die Aufrechterhaltung der Luftfeuchte vor stürzen Gefrieren der Probe kann eine Hürde für die weit verbreiteten Reproduzierbarkeit darstellen. Während diese Studien haben bei der Visualisierung von Neuriten Kryo-ET bahnbrech wurde, haben wir einen Schritt weiter, um die ap erkundenbarkeit der Kryo-ET zu einer Vielzahl von neuronalen Proben (hippocampalen und dorsalen Wurzelganglienneuronen). Darüber diskutieren wir beide optimale und suboptimale Ergebnisse sowie die möglichen Artefakte, die auftreten können mit einem Kryo-ET für solche Proben. Definieren einer detaillierten Technik für die Erhaltung und Visualisierung ganze Neuriten im Nanometerbereich in einer nahezu nativen Zustand würde die Fähigkeit für mehr Forscher zur Durchführung von ultrastrukturellen Studien zu verbessern. Zu diesem Zweck wird mit kommerziell erhältlichen Ausrüstung, um nicht fixierte, ungefärbten Neuronen vorzubereiten, zu visualisieren Neuriten beschreiben wir eine effektive und detaillierte Protokoll. Dies ist ein wichtiger erster Schritt zur Detaillierung der Ultrastruktur von gesunden Neuriten und den Grundstein für das Verständnis, was strukturelle Unterschiede im Nervensystem Modelle Krankheit vorliegen legen. Seit Kryo-ET kann nicht fixierten, ungefärbten Neuriten-Funktionen in 3-D auf der Nanometerskala zu beheben, wird das Verfahren machen es möglich, wie nieVordergrund zu neuritische Architektur 12 zu definieren.

<table><tbody><tr><td>Dumont #7 Pinzette</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>72803-01</td><td>Für die Handhabung von EM-Gittern</td></tr><tr><td>Glasbodenschalen</td><td>MatTek Corp.</td><td>P35G-1.5-10C</td><td>Für wachsende Proben</td></tr><tr><td>Elektronenmikroskopie-Gitter</td><td>Quantifoil</td><td>Holey Carbon, Au 200, R 2/2</td><td>Für wachsende Proben</td></tr><tr><td>Kalziumfreies Filterpapier</td><td>Whatman</td><td>1541-055</td><td>Zum Ablöschen von Proben</td></tr><tr><td>Große lange Pinzetten mit flacher Spitze</td><td>Excelta Corporation</td><td>E003-000590, 25-SA</td><td>Zum Ablöschen von Proben</td></tr><tr><td>Vitrifikationsgerät und Pinzette</td><td>FEI</td><td>Vitrobot Mark III</td><td>Zum Einfrieren von Proben</td></tr><tr><td>Minigrid-Aufbewahrungsboxen</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>160-40</td><td>Zur Aufbewahrung von EM-Gittern</td></tr><tr><td>Kryo-Transferhalter</td><td>Gatan</td><td>626 Single Tilt Flüssigstickstoff Kryo-Transferhalter</td><td>Für bildgebende Proben</td></tr><tr><td>Halbautomatische Tilt-Serienerfassungssoftware</td><td>SerialEM</td><td>http://bio3d.colorado.edu/SerialEM/</td> <td>Für bildgebende Proben</td></tr><tr><td>Bildverarbeitungssoftware</td><td>IMOD eTomo</td><td>http://bio3d.colorado.edu/imod/</td> <td>Für die Bildverarbeitung</td></tr><tr><td>Transmissionselektronenmikroskop für KryoEM</td><td>JEOL, Tokyo</td><td>200-kV JEM2100 LaB6 Elektronenmikroskop</td><td>Für die Bildgebung</td></tr><tr><td>von Proben 4k x 4k CCD-Kamera</td><td>Gatan</td><td>N/A</td><td>Für die Bildgebung</td></tr><tr><td>von Proben 3D-Annotationssoftware</td><td>Visage Imaging GmbH</td><td>Amira/Avizo</td><td>Für die Verarbeitung von 3D-Daten</td></tr><tr><td>Software für das digitale Zusammenfügen von 2D-Bildern</td><td>Adobe</td><td>Adobe Photoshop</td><td>Zur Verarbeitung von 2D-Daten</td></tr><tr><td>DMEM, Invitrogen mit hohem Glukosegehalt</td><td></td><td>11965-118</td><td>Für Hippocampuskulturen</td></tr><tr><td>Borsäure</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B-0252</td><td>Für Hippocampuskulturen</td></tr><tr><td>Natriumtetraborat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B-9876</td><td>Für Hippocampuskulturen</td></tr><tr><td>Poly-L-Lysin&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P2636-500MG</td><td>Für Hippocampuskulturen</td></tr><tr><td>Filtersystem</td><td>Corning</td><td>430758</td><td>Für Hippocampuskulturen</td></tr><tr><td>Neurobasales Medium</td><td>Invitrogen</td><td>21103-049</td><td>Für DRG-Kultur</td></tr><tr><td>B-27 Ergänzung</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td>Für DRG-Kultur</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td>Für DRG-Kultur</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Invitrogen</td><td>35050-061</td><td>für DRG-Kultur</td></tr><tr><td>Rekombinante Ratte b-NGF</td><td>R& D Systems</td><td>556-NG</td><td>Für DRG-Kultur</td></tr><tr><td>Uridin</td><td>Sigma</td><td>U3003-5G</td><td>Für DRG-Kultur</td></tr><tr><td>5'-Fluor-2'-Desoxyuridin</td><td>Sigma</td><td>F0503-100MG</td><td>Für DRG-Kultur</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>356234</td><td>Für DRG-Kultur</td></tr></tbody></table>

herstellung von primären neuronen für die visualisierung von neuriten in einem tiefgefrorenen zustand unter verwendung von kryo-elektronentomographie

Preparation of Primary Neurons for Visualizing Neurites in a Frozen-hydrated State Using Cryo-Electron Tomography

Neuriten, beide Dendriten und Axone sind neuronale zelluläre Prozesse, die die Leitung der elektrischen Impulse zwischen den Neuronen zu ermöglichen. Festlegen der Struktur von Neuriten ist entscheidend für das Verständnis, wie diese Prozesse bewegen, Materialien und Signale, die synaptische Kommunikation unterstützen. Elektronenmikroskopie (EM) wurde traditionell verwendet, um die ultrastrukturelle Merkmale in Neuriten beurteilen, jedoch kann die Exposition gegenüber organischen Lösemittel während der Dehydratisierung und Harzeinbettungsstrukturen verzerren. Ein wichtiges Ziel ist die unerfüllte Formulierung von Verfahren, die für die strukturelle Auswertungen nicht durch solche Artefakte beeinflusst ermöglichen. Hier haben wir eine detaillierte und reproduzierbare Protokoll für wachsende und Schockgefrieren ganze Neuriten von verschiedenen primären Neuronen auf Elektronenmikroskopie Gitter gefolgt von deren Untersuchung mit Kryoelektronentomographie (Kryo-ET) eingerichtet. Diese Technik ermöglicht 3-D-Visualisierung von gefrorenen, hydratisierten Neuriten in Nanometer-Auflösung, die Erleichterung assessment ihrer morphologischen Unterschiede. Unser Protokoll liefert eine beispiellose Ansicht der Hinterwurzelganglien (DRG) Neuriten und eine Visualisierung des Hippocampus in der Nähe von Neuriten-nativen Zustand. Als solche sind diese Methoden schaffen ein Fundament für zukünftige Studien auf Neuriten der beiden normalen Neuronen und die von neurologischen Erkrankungen betroffen.

Vor dem Einfrieren und Bildgebung mittels Kryo-ET, sollte leicht Mikroskopbilder der EM-Gitter, auf dem die Neuronen wachsen genommen werden. Neuriten sollten deutlich sichtbar, ohne signifikante Überlappung miteinander sein. Eine farbige Box in 3A repräsentiert einen Bereich, der vergrößerten wird, um eine höhere Vergrößerung in 3B, in der Neuriten erstrecken sich über die Gitterwerk des Gitters zu zeigen. Jedes Gitter-Platz ist einer löchrigen Kohlenstoffschicht, die die Nervenzellen ...

Neuronale Prozesse zur ultrastrukturellen Analyse zu erhalten, beschreiben wir ein Protokoll für die Beschichtung von primären Neuronen auf Elektronenmikroskopie Gitter gefolgt von einem Blitzgefrieren, wodurch Proben in einer Schicht von glasartigem Eis suspendiert. Diese Proben können mit einer Kryo-Elektronenmikroskop auf Strukturen im Nanometerbereich sichtbar zu prüfen.

Herstellung von primären Neuronen für die Visualisierung von Neuriten in einem tiefgefrorenen Zustand unter Verwendung von Kryo-Elektronentomographie

Neurites, both dendrites and axons, are neuronal cellular processes that enable the conduction of electrical impulses between neurons. Defining the ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, primäre Rattenneuronen so zu kultivieren, dass sie für die Visualisierung mittels Kryo-Elektronenmikroskopie geeignet sind. Dies wird erreicht, indem zunächst Petrischalen mit EM-Gittern zur Anzucht primärer Neuronen vorbereitet werden. Der zweite Schritt besteht darin, die primären Neuronen vorzubereiten und auf den EM-Gittern zu platzieren.Anschließend erfolgt die Vitrifizierung von Neuronen auf EM-Gittern. Der letzte Schritt besteht darin, Bilder mittels Kryo-Elektronenmikroskopie aufzunehmen, gefolgt von der Nachbearbeitung und Annotation. Letztendlich werden Kryo-Elektronenmikroskopie und Tomographie verwendet, um die Ultrastruktur von Neuriten im schockgefrorenen, hydratisierten Zustand darzustellen.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden liegt darin, dass sie zur 3D-Visualisierung gefroren-hydratisierter Neuriten mit nanometrischer Auflösung ohne Verwendung chemischer Fixiermittel verwendet werden kann. Dadurch wird die Beurteilung morphologischer Merkmale, die dem nativen Zustand näherkommen, erleichtert. Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie die Integrität des gelochten Kohlenstoffs auf den Gold-EM-Gittern überprüfen.Überprüfen Sie mithilfe eines Lichtmikroskops bei einer Vergrößerung von mindestens 25-fach, ob die Kohlenstofflöcher zu mehr als 98 % intakt sind. Verwenden Sie zum Aufbringen primärer Neuronen einen Bunsenbrenner, um die EM-Gitter zu flammensterilisieren und gleichzeitig hydrophil zu machen. Überführen Sie das Gitter unverzüglich mit der Kohlenstoffseite nach oben in die Mitte des Objektträgers.Untere Schale, eine EM-Grid pro Schale platzieren und ausschließlich vorsterilisierte Glasbodenschalen verwenden. Anschließend unter dem Gewebekulturhauben mit einem Lichtmikroskop die Integrität des Gitters überprüfen, während die EM-Grid weiterhin in der Glasbodenschale verbleibt; dann 250 Mikroliter der geeigneten Beschichtungssubstanz auf den zentralen Glasbereich der Petrischale auftragen. Langsam und vorsichtig sicherstellen, dass die Beschichtungssubstanz das gesamte EM-Gitter vollständig bedeckt.Anschließend die Petrischale mit ihrem Deckel abdecken und die Proben eine Stunde bei Raumtemperatur inkubieren lassen. Danach die gesamte Polyol-Lysin-Mischung mithilfe einer sterilen Pipettenspitze, die an das Vakuumrohr in der Abzugshaube angeschlossen ist, aus den Schalen abziehen. Direkten Kontakt mit dem E-EM-Gitter vermeiden.Anschließend 250 Mikroliter sterilem PBS mit einer justierbaren Luftverdrängungspipette vorsichtig auftragen, um den EM-Grid im zentralen Glasbereich jeder Petrischale vollständig zu bedecken. Danach das PBS aus jeder Schale abpipettieren. Wiederholen Sie diesen Vorgang danach dreimal.Lassen Sie die Schalen mit den EM-Gittern 15 Minuten lang in der Zellkulturhaube trocknen. Überprüfen Sie dies unter dem Lichtmikroskop. Stellen Sie sicher, dass sie vollständig trocken sind und sich keine Feuchtigkeitsblasen im Gitter befinden.Alternativ vorsichtig neben dem EM-Gitter absaugen, um die überschüssige Feuchtigkeit zu entfernen; das beschichtete Gitter sollte unmittelbar für die Plättierung der Neuronen verwendet werden. Berechnen Sie in diesem Verfahren das geeignete Zellvolumen für jede Schale, um eine Konzentration von 50.000 Zellen pro Milliliter pro Schale zu erreichen. Die maximale Auftragsmenge sollte 250 Mikroliter betragen, um lediglich den zentralen Glasbereich zu füllen, nicht die gesamte Schale.Als Nächstes die Schalen 30 Minuten lang in einem CO2-Inkubator bei 37 Grad Celsius inkubieren, um den Zellen Zeit zur Erholung und Anheftung zu geben; danach langsam 1,5 Milliliter des vorgewärmten Zellmediums zu jeder Schale hinzufügen und dabei vermeiden, das EM-Gitter für hippocampale Neuronen zu berühren. Am nächsten Tag das Medium wechseln und anschließend alle zwei Tage die Hälfte des Mediums für 14 Tage erneuern. In diesem Verfahren bereiten Sie die Ausrüstung und alle Materialien zur Einfrierung und Lagerung der goldenen EM-Gitter bei kryogenen Temperaturen vor, dazu gehören ein Vitrifikationsgerät mit Feuchtigkeitskammer, calciumfreies Filterpapier, ein Paar lange flache Spitzenpinzetten, ein Paar feine spezialisierte Pinzetten für die Vitrifikationsmaschine, ein Behälter mit flüssigem Stickstoff, ein Kühlbehälter und die EM-Gitter-Lagerbox.Schalten Sie als Nächstes das Vitrifizierungsgerät ein. Stellen Sie die Luftfeuchtigkeit auf 100 % und die Temperatur auf 32 Grad Celsius ein. Legen Sie im Optionenbereich die Blockierzeit auf null Sekunden fest.Dadurch ist eine manuelle Abtrocknung durch das Seitenfenster der Feuchtkammer möglich. Danach drei kalziumfreie Filterpapiere stapeln. Den Stapel in Streifen schneiden, die 0,5 cm breit sind und etwa zwei Zentimeter lang sind; anschließend die Streifen im 90-Grad-Winkel knicken, sodass ein Abschnitt des Papiers 0,5 cm mal 0,5 cm groß ist.Dieser Abschnitt wird zum Abblotten der Probe verwendet. Entfernen Sie das mittlere Papier und legen Sie es bis zur Verwendung auf ein anderes calciumfreies Filterpapier. Verwenden Sie danach die spezielle Vitrifikationspinzette, um das EM-Gitter vorsichtig aus der Schale zu entnehmen.Beachten Sie die Seite des EM-Rasters, auf der die Neuronen wachsen, da die Position für den nächsten Schritt wichtig ist. Verwenden Sie dann die schwarze Schiebeverriegelung an der Pinzette, um die Pinzette sicher am EM-Raster zu befestigen. Führen Sie nun die Pinzette in die Vitrifizierungsmaschine ein, sodass die Seite des EM-Rasters, auf der die Neuronen haften, nach links und weg von der kreisförmigen Öffnung an der Seite der Vitrifizierungsmaschine zeigt.Ziehen Sie dann die Pinzette, die das EM-Gitter hält, in die Vitrifizierungsmaschine zurück. Danach stellen Sie den Kühlmittelbehälter, der mit ausreichend flüssigem LN2 und flüssigem Ethan gefüllt ist, mithilfe des entsprechenden Bildschirmbefehls der Vitrifizierungsmaschine in den geeigneten Halter der Vitrifizierungsmaschine. Heben Sie die Kühlmittelkammer nach oben, bis sie bündig mit der Unterseite der Feuchtigkeitskammer steht, und verwenden Sie hierfür die flache Pinzette.Greifen Sie eine Kante des Filterpapiers so, dass die kürzere Seite senkrecht zu der Pinzette steht. Diese Seite kommt direkt mit dem EM-Gitter für das Abtupfen in Kontakt. Führen Sie nun vorsichtig das Filterpapier in das seitliche Loch der Feuchtigkeitskammer ein. Halten Sie das Papier 10 Sekunden lang fest gegen das EM-Gitter, entsorgen Sie es danach und tauchen Sie sofort ein.Frieren Sie die Probe in flüssigem Ethan unter Verwendung der Automatik der Vitrifizierungsmaschine ein. Danach überführen Sie das gefrorene, hydratisierte EM-Gitter vorsichtig in einen der Schlitzplätze der Gitteraufbewahrung. Dies ist ein Lichtmikroskopbild des zentralen Bereichs eines EM-Gitters bei 10-facher Vergrößerung, auf dem zwei Wochen lang primäre Rattenneuronen gewachsen sind.Hier ist die vergrößerte Ansicht der aquafarbenen Box, in der die Neuronen und ihre Neuritausläufer beobachtet werden. Dies ist eine Elektronenmikrografie eines Neuritausläufers, der sich von dem Neuronenkörper nach außen erstreckt, bei 4K-Vergrößerung. Die blaue Box wird hier in Nahansicht dargestellt, wobei die inneren Strukturen der Neuriten bei 20 K-Vergrößerung deutlich sichtbar sind.Dieses Video zeigt einen 3D-rekonstruierten Stapel von Mikroaufnahmen eines Neuriten aus einer primären Kultur von Ratten-Hippocampus-Neuronen. Die Aufnahme erfolgte mittels Tomographie, gefolgt von der entsprechenden 3D-Farbannotation. Hier ist ein weiteres Video, das einen 3D-rekonstruierten Bildstapel eines Axons aus einem dorsalen Wurzelganglion der Ratte zeigt, aufgenommen mittels Kryo-Elektronentomographie, gefolgt von der entsprechenden 3D-Farbannotation. Dargestellt ist außerdem eine Montage aus vier 2D-Kryo-EM-Aufnahmen eines separaten Axons des dorsalen Wurzelganglions der Ratte, aufgenommen bei 20 Kfacher Vergrößerung.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie primäre Neuronen auf Elektronenmikroskopie-Gittern so präpariert werden, dass sie in einem schockgefrorenen, hydratisierten Zustand mittels Kryo-Elektronentomographie sichtbar gemacht werden können.

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Quelle: Schönherr, S., et. al. Kombinierte optogenetische und Gefrierfraktur-Replikat-Immunmarkierung zur Untersuchung der inputspezifischen Anordnung von Glutamatrezeptoren in der Maus-Amygdala. J. Vis. exp. (2016)Dieses Video zeigt die Immunmarkierung von gefrierfrakturierten Nachbildungen von Hirngewebe von Mäusen für die Elektronenmikroskopie. Die gebrochenen und beschichteten Repliken werden verdaut, um Rezeptoren freizulegen. Primäre und goldmarkierte Sekundärantikörper werden...

Immunmarkierung von neuronalen Membranproteinen in einer gefriergebrochenen Probe von Hirngewebe der Maus

Wir präsentieren ein Protokoll der Golgi-Cox-Färbung in dicken Hirnschnitten für die Verwendung, um Neuronen mit langen Dendritenbäume innerhalb einzelner Gewebeproben enthalten ist, zu visualisieren. Zwei Varianten dieses Protokolls werden auch vorgestellt, Kresylviolett Gegenfärbung einzubeziehen und das Einfrieren von nicht verarbeiteten Gehirne für die Langzeitlagerung.

Imaging Neurone innerhalb Dickhirnschnitten Mit der Golgi-Cox-Methode

Hier bieten wir eine einfache, kostengünstige und zeitsparendes Protokoll zu chemisch fixieren Primaten Hirngewebe mit Acrolein Fixiermittel, so dass für die Langzeitarchivierung, die kompatibel mit vorge Einbettung Immunhistochemie für die Transmissionselektronenmikroskopie.

Herstellung von nichtmenschlichen Primaten Hirngewebe für die Pre-Einbettung Immunhistochemie und Elektronenmikroskopie

Basierend auf der in vitro lentiviralen Entwicklung neuronaler Vorläufer, ihrer Co-Transplantation in Wilde-Gehirne und der gepaarten morphometrischen Auswertung von "Test"- und "Kontrollderivaten" ermöglicht diese Methode eine genaue Modellierung der In-vivo-Genkontrolle neokortikaler Neuronenmorphologie auf einfache und erschwingliche Weise.

Intraventrikuläre Transplantation von engineered Neuronal Precursors for In Vivo Neuroarchitecture Studies

Hier wird ein Protokoll vorgestellt, das die Probenvorbereitungs- und Datenerfassungsschritte beschreibt, die in der Kryo-Soft-Röntgentomographie (SXT) erforderlich sind, um die Ultrastruktur ganzer kryokonservierter Zellen mit einer Auflösung von 25 nm Halbtonhöhe abzubilden.

Eine kartographische 3D-Beschreibung der Zelle durch Kryo-Soft-Röntgentomographie

Fokussiertes Ionenstrahlfräsen zur Herstellung von glasartigen On-Grid-Lamellen aus tiefgefrorenen biologischen Proben für die Kryo-Elektronentomographie.

Präparation von Lamellen aus glasartigen biologischen Proben mit einem Zweistrahl-Rasterelektronenmikroskop für die Kryo-Elektronentomographie

Wir präsentieren ein Protokoll zur Lamellenpräparation von gefrorenen biologischen Proben mittels kryofokussiertem Ionenstrahl-Mikrobearbeitung für hochauflösende Strukturstudien von Makromolekülen in situ mit Kryo-Elektronentomographie. Das vorgestellte Protokoll enthält Richtlinien für die Herstellung von hochwertigen Lamellen mit hoher Reproduzierbarkeit zur strukturellen Charakterisierung von Makromolekülen innerhalb der Saccharomyces cerevisiae.

Herstellung und Kryo-FIB-Mikrobearbeitung von Saccharomyces cerevisiae für die Kryo-Elektronentomographie

Das Ziel dieses Protokolls ist es, die Zelladhäsion und das Wachstum auf gezielte Bereiche von Gittern für die Kryo-Elektronenmikroskopie zu lenken. Dies wird durch das Auftragen einer Antifouling-Schicht erreicht, die in benutzerdefinierten Mustern abgetragen wird, gefolgt von der Ablagerung von extrazellulären Matrixproteinen in den gemusterten Bereichen vor der Zellaussaat.

Mikrostrukturierung von Transmissionselektronenmikroskopie-Gittern zur direkten Zellpositionierung innerhalb von Ganzzell-Kryo-Elektronentomographie-Workflows

Die Kryo-STEM-Tomographie bietet eine Möglichkeit, Organellen intakter Zellen ohne Einbettung, Schnitt oder andere invasive Präparate sichtbar zu machen. Die erzielte 3D-Auflösung liegt derzeit im Bereich von wenigen Nanometern, mit einem Sichtfeld von mehreren Mikrometern und einer zugänglichen Dicke in der Größenordnung von 1 μm.

Visualisierung von Organellen in situ mittels Kryo-STEM-Tomographie

Dieses Videoprotokoll veranschaulicht die Durchführung einer Rastertransmissionselektronenmikroskopie-Tomographie von virologischen Proben. Für optimale Ergebnisse werden die Proben durch Hochdruckgefrieren und anschließende Gefriersubstitution vorbereitet.

Rastertransmissionselektronenmikroskopie-Tomographie in der Virologie: 3D-Bildgebung von unter hohem Druck eingefrorenen, gefriersubstituierten Proben

Dieses Protokoll standardisiert die Kryo-Elektronen-Tomographie (Kryo-ET) für dickes Gewebe, indem es Hochdruck-Gefrieren (HPF) mit der Waffelmethode, kryogenen Fokusionenstrahl (Cryo-FIB) Lift-out und dosissymmetrische, parallele Aufnahme integriert, wodurch gleichmäßig dünne Lamellen und vitrifizierte Proben für eine reproduzierbare In-situ-Analyse im Maus-Hippocampus entstehen.

Kryo-Elektronen-Tomographie-Workflow für dickes Gewebe demonstriert im Maus-Hippocampus

Erfahren Sie die Vorbereitung primärer Rattenneuronen auf EM-Gittern für Kryo-Elektronentomographie. Diese Methode ermöglicht die hochaufgelöste 3D-Visualisierung von Neuriten im gefrorenen Zustand ohne chemische Fixierung.

Herstellung von primären Neuronen für die Visualisierung von Neuriten in einem tiefgefrorenen Zustand unter Verwendung von Kryo-Elektronentomographie (Video) | JoVE Journal

Herstellung von primären Neuronen für die Visualisierung von Neuriten in einem tiefgefrorenen Zustand unter Verwendung von Kryo-Elektronentomographie

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