Herstellung von primären Neuronen für die Visualisierung von Neuriten in einem tiefgefrorenen Zustand unter Verwendung von Kryo-Elektronentomographie

Neuronale Prozesse zur ultrastrukturellen Analyse zu erhalten, beschreiben wir ein Protokoll für die Beschichtung von primären Neuronen auf Elektronenmikroskopie Gitter gefolgt von einem Blitzgefrieren, wodurch Proben in einer Schicht von glasartigem Eis suspendiert. Diese Proben können mit einer Kryo-Elektronenmikroskop auf Strukturen im Nanometerbereich sichtbar zu prüfen.

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, primäre Rattenneuronen so zu züchten, dass ihre Neuronen für die Visualisierung durch Kryo-Elektronenmikroskopie geeignet sind. Dies wird erreicht, indem zunächst Gerichte mit EM-Gittern zum Anrichten der primären Neuronen zubereitet werden. Der zweite Schritt besteht darin, die primären Neuronen vorzubereiten und auf EM-Gittern zu plattieren.

Als nächstes wird die Vitrifizierung von Neuronen auf EM-Gittern durchgeführt. Der letzte Schritt besteht darin, Bilder durch Kryo-Elektronenmikroskopie zu sammeln, gefolgt von der Nachbearbeitung und Annotation. Schließlich werden Kryo-Elektronenmikroskopie und Tomographie eingesetzt, um die Ultrastruktur von Neuriten in einem gefrorenen hydratisierten Zustand zu zeigen.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden besteht darin, dass sie für die 3D-Visualisierung von gefrorenen hydratisierten Neuriten mit Nanometerauflösung ohne den Einsatz chemischer Fixiermittel verwendet werden kann. Dies erleichtert die Beurteilung morphologischer Merkmale, die dem ursprünglichen Zustand näher kommen. Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie die Integrität von heiligem Kohlenstoff auf den goldenen EM-Gittern untersuchen.

Stellen Sie mit einem Lichtmikroskop mit einer mindestens 25-fachen Vergrößerung sicher, dass die Kohlenstofflöcher größer als 98 % intakt sind. Zum Plattieren verwenden primäre Neuronen einen Bunsenbrenner, um die EM-Gitter flammensteril zu machen und sie gleichzeitig hydrophil zu machen. Übertragen Sie den Rost sofort mit der Carbonseite nach oben in die Mitte des Glases.

Bodenschale, platzieren Sie einen EM-Rost pro Schale und verwenden Sie nur vorsterilisierte Glasbodenschalen. Verwenden Sie dann ein Lichtmikroskop, um die Unversehrtheit des Gitters zu überprüfen, während Sie das EM-Gitter noch in der Glasbodenschale in einer Gewebekulturhaube halten, und tragen Sie 250 Mikroliter der entsprechenden Beschichtungssubstanz auf den zentralen Glasbereich der Petrischale auf. Achten Sie langsam und vorsichtig darauf, dass das gesamte E-EM-Gitter von der entsprechenden Beschichtungsmasse bedeckt ist.

Decken Sie anschließend die Petrischale mit ihrem Deckel ab und inkubieren Sie die Proben eine Stunde lang bei Raumtemperatur. Saugen Sie dann das gesamte Polyol-Lysin-Gemisch mit einer sterilen Pipettenspitze aus dem Geschirr ab, die an der Vakuumröhre in der Haube befestigt ist. Vermeiden Sie den direkten Kontakt mit dem E EM Gitter.

Sie anschließend eine Pipette mit einstellbarer Luftverdrängung, um vorsichtig 250 Mikroliter steriles PBS aufzutragen, um das EM-Gitter im zentralen Glasbereich jeder Petrischale vollständig abzudecken. Aspirieren Sie dann das PBS aus jeder Schale. Wiederholen Sie den Vorgang danach dreimal.

Lassen Sie die Schalen mit EM-Gittern 15 Minuten in der Gewebekulturhaube trocknen. Kontrolle unter dem Lichtmikroskop. Achte darauf, dass sie vollständig trocken sind und sich keine Feuchtigkeitsblasen im Gitter befinden.

Andernfalls aspirieren Sie vorsichtig neben dem EM-Gitter, um diese zusätzliche Feuchtigkeit zu entfernen, das beschichtete Gitter sollte sofort zum Plattieren der Neuronen verwendet werden. Berechnen Sie bei diesem Verfahren das geeignete Zellvolumen für jede Schale, um eine Konzentration von 50.000 Zellen pro Milliliter und Schale zu erreichen. Die maximale Anwendungsmenge sollte 250 Mikroliter betragen, um nur die zentrale Glasfläche, nicht die gesamte Schale zu füllen.

Als nächstes inkubieren Sie die Schalen 30 Minuten lang in einem CO2-Inkubator bei 37 Grad Celsius, damit sich die Zellen erholen und nach 30 Minuten anhaften können. Geben Sie langsam 1,5 Milliliter des erwärmten Zellmediums in jede Schale und vermeiden Sie es, das EM-Gitter für Hippocampus-Neuronen zu berühren. Wechseln Sie das Medium am nächsten Tag und dann 14 Tage lang alle zwei Tage die Hälfte des Mediums. Bereiten Sie bei diesem Verfahren das Gerät und alle Materialien für das Einfrieren und die Lagerung der Gold-EM-Gitter bei kryogener Temperatur vor, zu denen ein Vitrifikationsgerät mit einer Feuchtigkeitskammer, kalziumfreies Filterpapier, ein Paar lange Pinzetten mit flacher Spitze, eine spezielle Pinzette mit feiner Spitze für die Vitrifikationsmaschine, ein Macher mit flüssigem Stickstoff gehören, einen Kühlmittelbehälter und die EM-Gitter-Aufbewahrungsbox.

Schalten Sie anschließend das Vitrifikationsgerät ein. Stellen Sie die Luftfeuchtigkeit auf 100% und die Temperatur auf 32 Grad Celsius ein. Legen Sie im Optionsbereich die Blockzeit auf null Sekunden fest.

Dies ermöglicht ein manuelles Abtupfen durch das Seitenfenster der Feuchtigkeitskammer. Stapeln Sie dann drei kalziumfreie Filterpapiere. Schneiden Sie den Stapel in 0,5 Zentimeter breite Streifen, die danach etwa zwei Zentimeter lang sind, und biegen Sie sie in einem 90-Grad-Winkel, so dass ein Abschnitt des Papiers 0,5 Zentimeter mal 0,5 Zentimeter groß ist.

Dieser Abschnitt wird zum Abtupfen der Probe verwendet. Entfernen Sie das mittlere Papier und legen Sie es bis zur Verwendung auf ein anderes kalziumfreies Filterpapier. Verwenden Sie anschließend die spezielle Vitrifikation mit einer Pinzette, um das EM-Gitter vorsichtig aus der Schale zu nehmen.

Beachten Sie die Seite des EM-Gitters, auf der die Neuronen wachsen, da die Position für den nächsten Schritt von Bedeutung ist. Verwenden Sie dann den schwarzen Schiebeverschluss an der Pinzette, um die Pinzette sicher auf dem EM-Gitter zu verriegeln. Führen Sie nun die Pinzette so in die Vitrifikationsmaschine ein, dass die Seite des EM-Gitters, auf der die Neuronen haften, nach links und weg von dem kreisförmigen Öffnungsloch an der Seite der Vitrifikationsmaschine zeigt.

Ziehen Sie dann die Pinzette, mit der das EM-Gitter gehalten ist, in die Vitrifikationsmaschine ein. Stellen Sie anschließend den mit ausreichend LN two und flüssigem Ethan gefüllten Kühlmittelbehälter unter Verwendung des entsprechenden Bildschirmbefehls der Verglasungsmaschine in den entsprechenden Halter der Verglasungsmaschine. Heben Sie die Kühlmittelkammer mit der Flachpinzette nach oben, bis sie mit dem Boden der Feuchtigkeitskammer bündig ist.

Fassen Sie eine Kante des Filterpapiers so, dass die kürzere Seite senkrecht zur Pinzette steht. Diese Fläche kommt zum Blotten in direkten Kontakt mit dem EM-Gitter. Legen Sie nun das Filterpapier vorsichtig stabil in das Seitenloch der Feuchtigkeitskammer ein. Halten Sie das Papier 10 Sekunden lang gegen das EM-Gitter, entsorgen Sie das Papier und tauchen Sie es sofort ein.

Frieren Sie die Probe mit der Automatisierung der Vitrifikationsmaschine in flüssigem Ethan ein. Übertragen Sie anschließend das gefrorene hydratisierte EM-Gitter vorsichtig in einen der Schlitze im Gitterspeicher. Dies ist eine lichtmikroskopische Aufnahme des zentralen Bereichs eines EM-Gitters mit 10-facher Vergrößerung, auf dem primäre Neuronen von Ratten seit zwei Wochen wachsen.

Hier ist die vergrößerte Ansicht der Aqua-Box, in der die Neuronen und ihre Neuritenprojektionen beobachtet sind. Dies ist eine elektronenmikroskopische Aufnahme eines Neuriten, der mit 4K-Vergrößerung aus dem Neuronenkörper nach außen projiziert wird. Hier ist der blaue Kasten aus nächster Nähe zu sehen, wo die inneren Merkmale der Neuriten bei 20 K Vergrößerung deutlich sichtbar sind.

Dieses Video zeigt einen 3D-rekonstruierten Stapel von Mikroaufnahmen eines Neuriten aus der Primärkultur von Hippocampus-Neuronen von Ratten. Es wird mittels Tomographie abgebildet und anschließend mit der entsprechenden 3D-Farbannotation versehen. Hier ist ein weiteres Video, das einen 3D-rekonstruierten Stapel von Bildern eines dorsalen Wurzelganglienaxons der Ratte zeigt, das mittels Kryo-Elektronentomographie gesammelt wurde, gefolgt von der entsprechenden 3D-Farbannotation, und hier ist die Montage von vier 2D-Kryo-EM-Bildern eines separaten dorsalen Wurzelganglienaxons der Ratte, aufgenommen mit 20 K Vergrößerung.

Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie primäre Neuronen auf elektronenmikroskopischen Gittern so präparieren können, dass sie für die Visualisierung ihrer Neuronen in einem gefrorenen hydratisierten Zustand mittels Kryo-Elektronentomographie geeignet sind.