Isolierung, Kultur und Imaging von humanen fötalen Pankreas-Zellhaufen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, humane fetale Pankreaszellcluster zu isolieren. Dies geschieht durch eine erste Reinigung und ein grobes Zerkleinern der Bauchspeicheldrüse. Als nächstes wird das Bauchspeicheldrüsengewebe mit Kollagenase verdaut.

Dann werden die verdauten Aggregate resuspendiert und in Petrischalen plattiert. Schließlich werden die Zellen auf HTB-Neun-Matrix plattiert oder als Aggregate inkubiert, und es wird ein Experiment durchgeführt. Letztendlich ist R-T-P-C-R.

Die westliche Blutanalyse oder Immunfluoreszenzmikroskopie wird verwendet, um Veränderungen in der Gen- oder Proteinexpression oder -lokalisation darzustellen. Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die Therapie von Typ-1-Diabetes, da eine Reihe kritischer biochemischer Prozesse, die den Übergang von menschlichen Pankreas-Vorläuferzellen in reife, auf Glukose reagierende insulinsekretierende Zellen in vitro regulieren, unbekannt sind. Im Allgemeinen haben Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten mit einer unvollständigen oder übermäßigen Verdauung, die zu einer schlechten Bildung von fetalen Pankreaszellclustern führt.

Lopez, ein Techniker aus meinem Labor, wird dieses Verfahren vorführen: Um mit der Präparierung der fötalen Bauchspeicheldrüse zu beginnen, Flüssigkeit abzusaugen und die Bauchspeicheldrüse mit einer Pinzette ohne HBSS in die 60-Millimeter-Schale zu übertragen und sichtbares Milzfett oder Bindegewebe zu entfernen. Verwenden Sie etwa einen halben Milliliter HBSS, um die Bauchspeicheldrüse zu spülen, bevor Sie sie mit einer Pinzette in einen kleinen sterilen Tiegel und in einen Eiskübel überführen. Legen Sie den Tiegel in eine Halterung für ein 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen und schneiden Sie mit zwei Scheren die Bauchspeicheldrüse mehrere Minuten lang kräftig auf, indem Sie eine Seite der Schere in einer festen Position halten und nur die gegenüberliegenden Griffe bewegen, während Sie die Spitzen der Schere auf dem Boden des Tiegels bei 1,5 Millilitern Kollagenase auflegen und die zerkleinerte Bauchspeicheldrüse auf ein Fläschchen mit Kollagenase legen, das vorbereitet wurde.

Gemäß dem Textprotokoll und in einen auf 37 Grad Celsius bei 200 U/min eingestellten Wasserbadschüttler für bis zu 10 Minuten stellen. Überprüfen Sie in den ersten fünf Minuten nicht häufiger als einmal. Die Verdauungszeit hängt von der Gewebequalität ab, bereits sechs Minuten können ausreichend sein.

Der Endpunkt ist, wenn die Partikel klein und gleichmäßig sind. Um die Kollagenase-Aktivität zu stoppen. Verwenden Sie kaltes HBSS, um das Fläschchen zu füllen, legen Sie es dann auf Eis und lassen Sie die Klumpen 10 Minuten lang ruhen.

Nach der Inkubation wird die oberste Schicht abgesaugt, so dass sie etwas weniger als zur Hälfte gefüllt ist. Wenn DNA-Stränge aufgrund des Zelltods bei 100 Mikrolitern von 10 Milligramm pro Milliliter DNA in die Lösung vorhanden sind, dann übertragen Sie die Zellen in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen und fügen Sie fünf Milliliter HBSS-Zentrifuge für fünf Minuten bei 300 g hinzu. Nach dem Aspirieren des HBSS werden die Zellen in fünf Millilitern Medium suspendiert, das RPMI 1640 Glutamat, 10 % normales menschliches Serum, 10 millimolare Häufe, pH 7,2, Penicillin-Streptomycin und Pilzzone enthält.

Dann werden die Zellen in eine 60-Millimeter-Petrischale gegeben und 72 Stunden lang in Suspension bei 37 Grad Celsius inkubiert, um sie zu aggregieren und iccs zu bilden. Nach der Inkubationsplatte wechseln die Zellen auf der Matrix der humanen Zelllinie HTB neun, wie zuvor beschrieben, alle 48 Stunden das Wachstumsmedium, um eine Immunfluoreszenz an Adhärenzzellen durchzuführen. Wir entfernen das Kulturmedium und waschen die Zellen mit PBS.

Nachdem Sie die Zellen einmal mit 10 Millilitern PBS gewaschen haben, fügen Sie 4%PFA hinzu, um die Zellen 20 Minuten lang bei Raumtemperatur zu fixieren, und verwenden Sie dann PBS, um die Zellen zweimal zu waschen. Nachdem Sie die Zellen 10 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 0,2 % Tritton X 100 in PBS inkubiert und die Zellen zweimal mit PBS gewaschen haben, inkubieren Sie die Zellen eine Stunde lang in Blockierungspuffer, pipettieren Sie 60 Mikroliter der primären Antikörperlösung auf Perfil, das in einem verschließbaren Behälter gegeben wurde. Entfernen Sie dann den Deckglas von der 12-Well-Platte und tupfen Sie den zusätzlichen Blockierungspuffer ab, bevor Sie ihn auf den primären Antikörpertropfen legen.

Inkubieren Sie die Probe 90 Minuten lang bei Raumtemperatur. Nachdem Sie die Proben dreimal gewaschen haben, geben Sie einen Tropfen fluoreszierender Sekundärantikörper auf ein Stück Paraform mit PBS. Spülen Sie die Proben ab und tupfen Sie das überschüssige PBS mit Seidenpapier ab, bevor Sie es auf den Tropfen der Antikörperlösung geben.

Schützen Sie die Probe vor Licht und inkubieren Sie sie eine Stunde lang bei Raumtemperatur, nachdem Sie die Proben gewaschen und wie zuvor abgetupft haben, fügen Sie einen Tropfen Eindeckgel hinzu und drehen Sie das Deckglas auf einen Objektträger. Verwenden Sie eine Aspiration, um überschüssiges Einbettgel zu entfernen, und klopfen Sie die Rückseite einer 200-Mikroliter-Pipettenspitze vorsichtig aus allen Luftblasen. Lassen Sie die Proben 20 Minuten trocknen und untersuchen Sie sie unter einem Fluoreszenz- oder Konfokalmikroskop.

Die sorgfältige Vorbereitung der fetalen ICCs ist entscheidend für den Erfolg des in diesem Video beschriebenen Protokolls. Diese Serie von Panels veranschaulicht, wie die Zellen typischerweise in definierten Zeiträumen nach der Beschichtung aussehen. Zum Beispiel erscheinen die frisch plattierten Zellaggregate nach der Aufreinigung als kleine, spärliche, klare Cluster, die nur wenige Zellen enthalten.

Nach den ersten 24 Stunden werden viele der Zellcluster größer und zahlreiche kleine Cluster bleiben nach 48 Stunden übrig. Die Cluster haben sich deutlich ausgedehnt, sind aber nach 72 Stunden immer noch asymmetrisch. Die ICCs sollten klar sein, relativ einheitlich in Größe und Form und können entweder auf Matrizen plattiert werden oder weitere 72 Stunden lang mit oder ohne Chemikalien oder Medikamente wachsen lassen, um endokrine Zellen der Bauchspeicheldrüse zu erzeugen.

Diese Abbildungen zeigen eine Reihe von häufig verwendeten Antikörpern, um entweder die ICC-Proliferation oder die Differenzierung zum Pankreasendoderm zu beurteilen. Hier wurden iccs auf HTV neun plattiert, vier Tage lang gezüchtet und für PDX eins, einen kritischen Marker für die Entwicklung der Bauchspeicheldrüse, gefärbt. Obwohl wir routinemäßig In-vitro-Färbungen von ICCs durchführen, werden humane fetale ICCs häufiger unter die Nierenkapsel von Nacktmäusen transplantiert und können sich in vivo vermehren und differenzieren.

In diesem Beispiel wurden in Paraffin eingebettete Nierenschnitte, die transplantierte ICCs enthielten, mit dem Epithelzellmarker Cytokeratin in grün und KI 67 in rot gefärbt, um die Zellproliferation zu beurteilen. In einem anderen Beispiel wurden sowohl Humaninsulin in Grün als auch Glucagon in Rot nach Transplantation und Reifung unter der Nierenkapsel einer Nacktmaus nachgewiesen. Sobald Sie ein Meister sind, kann diese Technik in 90 Minuten ausgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.

Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass jede Charge von Kollagenase unterschiedlich ist und empirisch optimiert werden muss. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie Kultur und Bild isolieren können. Menschliche fötale Pankreaszellcluster.