Tests für die Identifizierung neuer Antivirale gegen Blauzungenvirus

Drei Assays, einschließlich des zytopathischen Effekts (CPE)-basierte Assays, Dosis-Wirkungs-Assay und Time-of-Addition (TOA)-Assay entwickelt, optimiert, validiert und genutzt, um neue antivirale Mittel gegen Blauzungenvirus (BTV) zu identifizieren, sowie um den möglichen Mechanismus-of-Aktion (MoA) für neu identifizierten antiviralen Medikamenten zu bestimmen.

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die Identifizierung und Charakterisierung von niedermolekularen antiviralen Wirkstoffen gegen das Virus der Blauzungenkrankheit (BTV) mit Hilfe des CPE-basierten Zellviabilitätsassays. Dies wird erreicht, indem zunächst eine Bibliothek antiviraler Verbindungen unter Verwendung des zytopathischen Effekts oder CPE-basierten Assays mit dem Zelltiter-Glühreagenz gescreent wird. Anschließend wird die antivirale Wirksamkeit bestätigt und die Zytotoxizität ausgewählter Virostatika mit Hilfe des Dosis-Wirkungs-Assays bewertet.

Schließlich wird der Zeitpunkt der Zugabe-Assay durchgeführt, um das mögliche virale Lebenszyklusstadium ausgewählter Virostatika zu bestimmen, das zu den möglichen Wirkmechanismen führt. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die neuartige Virostatika mit potenter antiviraler CIE und geringer Zytotoxizität basierend auf dem Dosis-Wirkungs-Assay und dem Time-of-Addition-Assay zeigen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber den bestehenden Methoden wie dem TCI D 50-Assay in einem Plaque-Assay besteht darin, dass diese Technik eine empfindliche, robuste und hochreproduktive Methode zum Screening und zur Kategorisierung von Antivirenprogrammen gegen bestimmte Viren, einschließlich Glutenviren, bietet, die messbares CP in infizierten Zellen induzieren. Zur Vorbereitung auf den CPE-basierten Assay aus BSR-Zellen, die in supplementiertem DMEM gehalten werden, verwenden Sie einen Microflow-Select-Dispenser zur Säen Sie 20 Mikroliter Zellen mit 5.000 Zellen pro Vertiefung zu einem 384 aus.

Well: Mikrotiterplatten inkubieren die Zellen zwei bis drei Stunden lang, damit sie vollständig an der Platte haften können, fügen Sie dann antivirale Verbindungen in einer Endkonzentration von 10 Mikromolaren in jede Vertiefung hinzu und mischen Sie sie vollständig. Verwenden Sie das Assay-Medium, um das gereinigte und vermehrte BTV der Plaque auf den gewünschten Titer zu verdünnen, und fügen Sie für die Kontrolle fünf Mikroliter BTV mit dem angegebenen MOI in jede Vertiefung hinzu. Nun, fügen Sie fünf Mikroliter Testmedium hinzu, legen Sie eine Nassbox mit der Testplatte in den Inkubator und inkubieren Sie die infizierten Zellen 72 Stunden lang bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid und 80 bis 95 % Luftfeuchtigkeit.

Nehmen Sie dann die Assay-Platte aus dem Inkubator, tauen Sie anschließend den CTG-Puffer und das lyophilisierte CTG-Substrat auf Raumtemperatur auf und äquilibrieren Sie sie. Dann rekonstituieren Sie die homogene CTG-Reagenzlösung, indem Sie das lyophilisierte Enzymsubstrat und das Pufferreagenz gemäß den Anweisungen des Herstellers mischen. Nachdem Sie die Assay-Platten 15 Minuten lang auf Raumtemperatur äquilibriert haben, verwenden Sie einen Dispenser, um 25 Mikroliter CTG-Reagenzien in jede Vertiefung zu geben, inkubieren Sie 15 Minuten lang im Dunkeln, bevor Sie einen Multi-Mode-Reader mit einer Integrationszeit von 0,1 Sekunden verwenden, um Lumineszenzsignale zu messen. Aussaat von 5.000 BSR-Zellen pro Well in einer 384-Well-Mikroplatte für den Dosis-Wirkungs-Assay mit 20 Mikrolitern für den antiviralen Wirksamkeitsassay und 25 Mikrolitern für der Zytotoxizitätstest.

Nach einer zwei- bis dreistündigen Inkubation weisen Sie acht Replikate für jede Konzentration der Verbindung pro Assay zu, wie hier gezeigt. Weisen Sie die erste Säule als Positivkontrolle ohne Zugabe von Verbindung oder Virus und die letzte Säule als Negativkontrolle zu, indem Sie nur für den antiviralen Wirksamkeitsassay Viren hinzufügen. Verdünnte Verbindungen auf 50 Mikromolar im Assay-Medium und in die zweite Säule fügen Sie 20 Mikroliter pro Vertiefung hinzu. Mit einer halbautomatischen Achtkanalpipette.

Mischen Sie die Verbindung fünfmal bis zu einer Konzentration von 25 Mikromolaren. Als nächstes werden 20 Mikroliter der Mischung aus der zweiten Säule in die dritte Spalte überführt und gut gemischt, was zu einer Konzentration von 12,5 Mikromolar führt. Wiederholen Sie dies zweimal.

Serielle Verdünnung bis zur 11. Säule, die eine Endkonzentration von 0,04 Mikromolar hat. Fügen Sie dann fünf Mikroliter Medium in Spalte eins als Positivkontrolle nur für die Zelle und fünf Mikroliter BTV pro Vertiefung in Spalte 12 als nur eine BTV-Infektion A hinzu. Negativkontrolle: Geben Sie fünf Mikroliter BTV pro Vertiefung von Spalte zwei bis Spalte 11 für den Zytotoxizitätstest hinzu und verdünnen Sie die Verbindung auf eine Anfangskonzentration von 200 Mikromolaren.

Geben Sie 25 Mikroliter pro Vertiefung der Verbindung in die zweite Säule und mischen Sie fünfmal, um die Konzentration auf 100 Mikromolar zu bringen. Die zweifache Reihenverdünnung wird durchgeführt, indem 25 Mikroliter von Spalte zwei in die benachbarte Säule drei überführt und durch Spalte 12 fortgesetzt wird. Nach dem Mischen der Säule 12 werden 25 Mikroliter des Gemisches aspiriert und verworfen.

Spalte eins ist die reine Zellkontrolle sowohl für den antiviralen als auch für den Zytotoxizitätsassay. Legen Sie eine Nassbox mit der Assay-Platte für 72 Stunden in den Inkubator und nehmen Sie die Platte anschließend heraus. Verwenden Sie dann das CT G-Kit, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu messen.

Verwenden Sie eine biostatistische und grafische Software, um den Mittelwert, den Standardabweichungskoeffizienten, die Variationen und den Prozentsatz der Zellviabilität für jede Verbindungskonzentration zu berechnen, und führen Sie eine nichtlineare Regressionsanalyse durch, um die EC 50 und CC 50 jeder Verbindung zu bestimmen. Bereiten Sie sich auf den Zeitpunkt der Zugabe oder den TOA-Assay vor, indem Sie 5.000 Zellen pro Vertiefung in 15 Mikrolitern in den Spalten eins bis 24 von 384 aussäen. Gut Mikroplatte für jede Verbindung.

Nutzen Sie alle 24 Spalten mit acht Replikaten für jeden Zeitpunkt. Weisen Sie Spalte eins als reine Zellkontrolle zu, indem Sie 10 Mikroliter pro Vertiefung des Assay-Mediums hinzufügen; markieren Sie Spalte 24 nur als BTV-Infektion. Negativkontrolle durch Zugabe von fünf Mikrolitern pro Vertiefung des Testmediums und fünf Mikrolitern pro Vertiefung des Virus bei einem MOI von 0,01.

In einem Endvolumen von 25 Mikrolitern pro Vertiefung wählen Sie die geraden Säulen von Spalte zwei bis 22 als antivirale Wirksamkeitsbewertungssäulen zu verschiedenen Stunden nach der Infektion oder HPI in diesen Spalten, infizieren Sie Zellen mit fünf Mikrolitern pro Vertiefung BTV bei einem MOI von 0,01 bei unterschiedlichen HPI, fügen Sie auch fünf Mikroliter pro Vertiefung verdünnter Verbindung mit einem Endvolumen von 25 Mikrolitern pro Vertiefung für die bezeichnete minus zwei hinzu und minus einem HPI. Fügen Sie die Verbindung vor der BTV-Infektion zu BSR-Zellen hinzu, um HPI zu erhalten. Fügen Sie die Verbindung und BTV gleichzeitig der Kultur hinzu. Legen Sie parallel dazu die ungeraden Spalten von drei bis 23 als zusammengesetzte Steuerelemente fest, die den verschiedenen Zeitpunkten in diesen Spalten entsprechen.

Fügen Sie fünf Mikroliter pro Vertiefung des Testmediums und fünf Mikroliter pro Vertiefung der verdünnten Verbindung in einem Endvolumen von 25 Mikrolitern pro Vertiefung hinzu. Nachdem Sie die Zellen im Inkubator auf 72 HPI inkubiert haben, nehmen Sie die Assay-Platte heraus und verwenden Sie das Zelltiter-Glow-Kit, um die Zellviabilität zu bestimmen. Verwenden Sie schließlich eine Software, die Lumineszenzsignale verarbeitet, die über das Multimode-Lesegerät empfangen werden, um den Mittelwert zu bestimmen.

S-T-D-E-V CV und prozentualer Anteil der Lebensfähigkeit der Schutzzellen für jede Behandlung Unter Verwendung des CPE-Assays zur Quantifizierung von zellulärem A TP in lebenden Zellen haben wir zuvor mehrere vielversprechende Leitsubstanzen mit starker antiviraler Wirksamkeit, geringer Toxizität und hoher Selektivität identifiziert. Zum Beispiel wurde bestimmt, dass die Verbindung 0 5 2 einen EC 50 von 0,27 plus oder minus 0,12 Mikromol und CC 50 von 82,69 Mikromolar aufweist, die beide typische regressive Kurven aufweisen. Im Rahmen der nichtlinearen Regressionsanalyse wurde festgestellt, dass der SI 50 von C 0 5 2 auf der Grundlage seiner EC 50- und CC 50-Werte 306 auf der nanomolaren Skala antivirale Wirksamkeit, geringe Toxizität und folglich hoher SI 50 darauf hindeutet, dass C 0 5 2 ein wirksames und selektives antivirales Mittel gegen BTV sein könnte, wie hier zu sehen ist. Die Zellen wurden mit BTV bei einem MOI von 0,01 in Gegenwart von 10 verschiedenen Konzentrationen von C 0,5 2 infiziert und die Zellviabilität wurde bei 72 HPI bestimmt.

Mit dem CTG-Kit stellt jeder Datenpunkt Mittelwerte und SD aus fünf Replikaten dar. Der TOA-Assay wurde verwendet, um die möglichen Stadien des viralen Lebenszyklus zu bestimmen, auf die die Wirkstoffe abzielen. Wenn C 0 5 2 ein oder zwei Stunden vor der BTV-Infektion hinzugefügt wurde, blieb die antivirale Wirksamkeit auf der nanomolaren Skala, wie in dieser Abbildung zu sehen ist.

Darüber hinaus nahm die Lebensfähigkeit der Zellen weiter ab, wenn C 0 5 2 bei 32 und 48 HPI hinzugefügt wurde, was darauf hindeutet, dass C 0 5 2 über das frühe Stadium des viralen Lebenszyklus, wie z. B. den Eintritt des Virus, hinaus wirken könnte. Da der erste Zyklus der BTV-Virusreplikation in infizierten Zellen innerhalb von 24 HPI in der Regel abgeschlossen ist, deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass C 0 5 2 in den späten Stadien des BTV-Viruslebenszyklus wirken könnte, wie z. B. bei der Virusreplikation, Verpackung, Reifung und Austritt. In der Zwischenzeit ist es auch möglich, dass C 0 5 2 auf die zelluläre Maschinerie des Wirts einwirkt, die in späteren Stadien des viralen Lebenszyklus funktioniert.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie den besten CPE-Aufsatz verwenden können, um das potenzielle Antivirenprogramm gegen die Viren zu identifizieren und zu kategorisieren, die nach der Infektion messbare CPE auslösen.