Name: In vitro Coculture Assay zur Bewertung pathogeninduzierter Neutrophiler Transepithelmigration (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-06T15:45:00.000+00:00
Duration: 14 min 14 s
Description: Lernen Sie die In-vitro-Coculture-Assay-Methode zur Quantifizierung neutrophiler Transepithelmigration bei bakterieller Infektion. Dieses Modell ermöglicht die Untersuchung immunologischer Mechanismen in der Zellbiologie.

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Diese Arbeit wurde von NIH (1 R01 AI095338-01A1) finanziell unterstützt.

<ol><li>Burns, A. R., Smith, C. W., Walker, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+structural+features+that+influence+neutrophil+emigration+into+the+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Unique structural features that influence neutrophil emigration into the lung.</a> Physiol. Rev. 83, 309-336 (2003).</li>
<li>Hurley, B. P., McCormick, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+epithelial+defense+systems+protect+against+bacterial+threats%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Gastroenterol.+Rep%22%5BJournal%5D)">Intestinal epithelial defense systems protect against bacterial threats.</a> Curr. Gastroenterol. Rep. 6, 355-361 (2004).</li>
<li>McCormick, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial-induced+hepoxilin+A3+secretion+as+a+pro-inflammatory+mediator%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">Bacterial-induced hepoxilin A3 secretion as a pro-inflammatory mediator.</a> FEBS J. 274, 3513-3518 (2007).</li>
<li>Mumy, K. L., McCormick, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+neutrophils+in+the+event+of+intestinal+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">The role of neutrophils in the event of intestinal inflammation.</a> Curr. Opin. Pharmacol. 9, 697-701 (2009).</li>
<li>Chin, A. C., Parkos, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathobiology+of+neutrophil+transepithelial+migration%3A+implications+in+mediating+epithelial+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Pathobiology of neutrophil transepithelial migration: implications in mediating epithelial injury.</a> Annu. Rev. Pathol. 2, 111-143 (2007).</li>
<li>Segel, G. B., Halterman, M. W., Lichtman, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+paradox+of+the+neutrophil%27s+role+in+tissue+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Leukoc.+Biol%22%5BJournal%5D)">The paradox of the neutrophil's role in tissue injury.</a> J. Leukoc. Biol. 89, 359-372 (2011).</li>
<li>Weiss, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+destruction+by+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Tissue destruction by neutrophils.</a> N. Engl. J. Med. 320, 365-376 (1989).</li>
<li>Hurley, B. P., Thorpe, C. M., Acheson, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shiga+toxin+translocation+across+intestinal+epithelial+cells+is+enhanced+by+neutrophil+transmigration%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Shiga toxin translocation across intestinal epithelial cells is enhanced by neutrophil transmigration.</a> Infect. Immun. 69, 6148-6155 (2001).</li>
<li>Kohler, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salmonella+enterica+serovar+Typhimurium+regulates+intercellular+junction+proteins+and+facilitates+transepithelial+neutrophil+and+bacterial+passage%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Gastrointest.+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Salmonella enterica serovar Typhimurium regulates intercellular junction proteins and facilitates transepithelial neutrophil and bacterial passage.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 293, 178-187 (2007).</li>
<li>Gane, J., Stockley, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+neutrophil+transmigration+across+the+vascular+endothelium+in+COPD%5BTitle%5D)+AND+%22Thorax%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of neutrophil transmigration across the vascular endothelium in COPD.</a> Thorax. 67, 553-561 (2012).</li>
<li>Grommes, J., Soehnlein, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+neutrophils+to+acute+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Contribution of neutrophils to acute lung injury.</a> Mol. Med. 17, 293-307 (2011).</li>
<li>Nakagome, K., Matsushita, S., Nagata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophilic+inflammation+in+severe+asthma%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+Arch.+Allergy+Immunol.%22%5BJournal%5D)">Neutrophilic inflammation in severe asthma.</a> Int. Arch. Allergy Immunol.. 158 Suppl 1, 96-102 (2012).</li>
<li>Choi, E. Y., Santoso, S., Chavakis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+neutrophil+transendothelial+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Biosci%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of neutrophil transendothelial migration.</a> Front. Biosci. 14, 1596-1605 (2009).</li>
<li>Louis, N. A., Campbell, E., Colgan, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model+systems+to+investigate+neutrophil+adhesion+and+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Model systems to investigate neutrophil adhesion and chemotaxis.</a> Methods Mol. Biol. 412, 257-270 (2007).</li>
<li>Craig, A., Mai, J., Cai, S., Jeyaseelan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+recruitment+to+the+lungs+during+bacterial+pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Neutrophil recruitment to the lungs during bacterial pneumonia.</a> Infect. Immun. 77, 568-575 (2009).</li>
<li>Hurley, B. P., McCormick, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+tissue+culture+results+into+animal+models%3A+the+case+of+Salmonella+typhimurium%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Translating tissue culture results into animal models: the case of Salmonella typhimurium.</a> Trends Microbiol. 11, 562-569 (2003).</li>
<li>Lee, W. Y., Chin, A. C., Voss, S., Parkos, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+neutrophil+transepithelial+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">In vitro neutrophil transepithelial migration.</a> Methods Mol. Biol. 341, 205-215 (2006).</li>
<li>Hurley, B. P., Siccardi, D., Mrsny, R. J., McCormick, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymorphonuclear+cell+transmigration+induced+by+Pseudomonas+aeruginosa+requires+the+eicosanoid+hepoxilin+A3%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Polymorphonuclear cell transmigration induced by Pseudomonas aeruginosa requires the eicosanoid hepoxilin A3.</a> J. Immunol. 173, 5712-5720 (2004).</li>
<li>McCormick, B. A., Colgan, S. P., Delp-Archer, C., Miller, S. I., Madara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salmonella+typhimurium+attachment+to+human+intestinal+epithelial+monolayers%3A+transcellular+signalling+to+subepithelial+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Salmonella typhimurium attachment to human intestinal epithelial monolayers: transcellular signalling to subepithelial neutrophils.</a> J. Cell Biol. 123, 895-907 (1993).</li>
<li>McCormick, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+attachment+of+Salmonella+typhimurium+to+intestinal+epithelia+imprints+the+subepithelial+matrix+with+gradients+chemotactic+for+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Surface attachment of Salmonella typhimurium to intestinal epithelia imprints the subepithelial matrix with gradients chemotactic for neutrophils.</a> J. Cell Biol. 131, 1599-1608 (1995).</li>
<li>Mrsny, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+hepoxilin+A3+in+inflammatory+events%3A+a+required+role+in+neutrophil+migration+across+intestinal+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Identification of hepoxilin A3 in inflammatory events: a required role in neutrophil migration across intestinal epithelia.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 7421-7426 (2004).</li>
<li>Tamang, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepoxilin+A%283%29+facilitates+neutrophilic+breach+of+lipoxygenase-expressing+airway+epithelial+barriers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Hepoxilin A(3) facilitates neutrophilic breach of lipoxygenase-expressing airway epithelial barriers.</a> J. Immunol. 189, 4960-4969 (2012).</li>
<li>McCormick, B. A., Parkos, C. A., Colgan, S. P., Carnes, D. K., Madara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apical+secretion+of+a+pathogen-elicited+epithelial+chemoattractant+activity+in+response+to+surface+colonization+of+intestinal+epithelia+by+Salmonella+typhimurium%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Apical secretion of a pathogen-elicited epithelial chemoattractant activity in response to surface colonization of intestinal epithelia by Salmonella typhimurium.</a> J. Immunol. 160, 455-466 (1998).</li>
<li>Boll, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enteroaggregative+Escherichia+coli+promotes+transepithelial+migration+of+neutrophils+through+a+conserved+12-lipoxygenase+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Enteroaggregative Escherichia coli promotes transepithelial migration of neutrophils through a conserved 12-lipoxygenase pathway.</a> Cell Microbiol. 14, 120-132 (2012).</li>
<li>Hurley, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+two-component+sensor+response+regulator+RoxS%2FRoxR+plays+a+role+in+Pseudomonas+aeruginosa+interactions+with+airway+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+Infect%22%5BJournal%5D)">The two-component sensor response regulator RoxS/RoxR plays a role in Pseudomonas aeruginosa interactions with airway epithelial cells.</a> Microbes Infect. 12, 190-198 (2010).</li>
<li>Hurley, B. P., Williams, N. L., McCormick, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+phospholipase+A2+in+Pseudomonas+aeruginosa-mediated+PMN+transepithelial+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Lung+Cell+Mol.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Involvement of phospholipase A2 in Pseudomonas aeruginosa-mediated PMN transepithelial migration.</a> Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 290, L703-L709 (2006).</li>
<li>McCormick, B. A., Siber, A. M., Maurelli, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+of+the+Shigella+flexneri+virulence+plasmid+in+the+ability+to+induce+trafficking+of+neutrophils+across+polarized+monolayers+of+the+intestinal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Requirement of the Shigella flexneri virulence plasmid in the ability to induce trafficking of neutrophils across polarized monolayers of the intestinal epithelium.</a> Infect. Immun. 66, 4237-4243 (1998).</li>
<li>Savkovic, S. D., Koutsouris, A., Hecht, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attachment+of+a+noninvasive+enteric+pathogen%2C+enteropathogenic+Escherichia+coli%2C+to+cultured+human+intestinal+epithelial+monolayers+induces+transmigration+of+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Attachment of a noninvasive enteric pathogen, enteropathogenic Escherichia coli, to cultured human intestinal epithelial monolayers induces transmigration of neutrophils.</a> Infect. Immun. 64, 4480-4487 (1996).</li>
<li>Agbor, T. A., Demma, Z. C., Mumy, K. L., Bien, J. D., McCormick, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ERM+protein%2C+ezrin%2C+regulates+neutrophil+transmigration+by+modulating+the+apical+localization+of+MRP2+in+response+to+the+SipA+effector+protein+during+Salmonella+typhimurium+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The ERM protein, ezrin, regulates neutrophil transmigration by modulating the apical localization of MRP2 in response to the SipA effector protein during Salmonella typhimurium infection.</a> Cell Microbiol. 13, 2007-2021 (2011).</li>
<li>Pazos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multidrug+resistance-associated+transporter+2+regulates+mucosal+inflammation+by+facilitating+the+synthesis+of+hepoxilin+A3%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Multidrug resistance-associated transporter 2 regulates mucosal inflammation by facilitating the synthesis of hepoxilin A3.</a> J. Immunol. 181, 8044-8052 (2008).</li>
<li>Agace, W. W., Patarroyo, M., Svensson, M., Carlemalm, E., Svanborg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escherichia+coli+induces+transuroepithelial+neutrophil+migration+by+an+intercellular+adhesion+molecule-1-dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Escherichia coli induces transuroepithelial neutrophil migration by an intercellular adhesion molecule-1-dependent mechanism.</a> Infect. Immun. 63, 4054-4062 (1995).</li>
<li>Bhowmick, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+Disease+during+Streptococcus+pneumoniae+Acute+Lung+Infection+Requires+12-Lipoxygenase-Dependent+Inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Systemic Disease during Streptococcus pneumoniae Acute Lung Infection Requires 12-Lipoxygenase-Dependent Inflammation.</a> J. Immunol. , (2013).</li>
<li>Hurley, B. P., Pirzai, W., Mumy, K. L., Gronert, K., McCormick, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+eicosanoid-generating+capacity+of+cytoplasmic+phospholipase+A2+in+Pseudomonas+aeruginosa-infected+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Lung+Cell+Mol.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Selective eicosanoid-generating capacity of cytoplasmic phospholipase A2 in Pseudomonas aeruginosa-infected epithelial cells.</a> Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 300, 286-294 (2011).</li>
<li>Hurley, B. P., Sin, A., McCormick, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesion+molecules+involved+in+hepoxilin+A3-mediated+neutrophil+transepithelial+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Exp.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Adhesion molecules involved in hepoxilin A3-mediated neutrophil transepithelial migration.</a> Clin. Exp. Immunol. 151, 297-305 (2008).</li>
<li>Frank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Research+Topic+on+Pseudomonas+aeruginosa%2C+Biology%2C+Genetics%2C+and+Host-Pathogen+Interactions.%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Research Topic on Pseudomonas aeruginosa, Biology, Genetics, and Host-Pathogen Interactions.</a> Front. Microbiol. 3, 20 (2012).</li>
<li>Lyczak, J. B., Cannon, C. L., Pier, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+infections+associated+with+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Lung infections associated with cystic fibrosis.</a> Clin. Microbiol. Rev. 15, 194-222 (2002).</li>
<li>Bucior, I., Mostov, K., Engel, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa-mediated+damage+requires+distinct+receptors+at+the+apical+and+basolateral+surfaces+of+the+polarized+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa-mediated damage requires distinct receptors at the apical and basolateral surfaces of the polarized epithelium.</a> Infect. Immun. 78, 939-953 (2010).</li>
<li>Kierbel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+exploits+a+PIP3-dependent+pathway+to+transform+apical+into+basolateral+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa exploits a PIP3-dependent pathway to transform apical into basolateral membrane.</a> J. Cell Biol. 177, 21-27 (2007).</li>
<li>Lee, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+secreted+Salmonella+protein+induces+a+proinflammatory+response+in+epithelial+cells%2C+which+promotes+neutrophil+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A secreted Salmonella protein induces a proinflammatory response in epithelial cells, which promotes neutrophil migration.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 12283-12288 (2000).</li>
<li>Zurawski, D. V., Mumy, K. L., Faherty, C. S., McCormick, B. A., Maurelli, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shigella+flexneri+type+III+secretion+system+effectors+OspB+and+OspF+target+the+nucleus+to+downregulate+the+host+inflammatory+response+via+interactions+with+retinoblastoma+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Shigella flexneri type III secretion system effectors OspB and OspF target the nucleus to downregulate the host inflammatory response via interactions with retinoblastoma protein.</a> Mol. Microbiol. 71, 350-368 (2009).</li>
<li>Brazil, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+migration+across+intestinal+epithelium%3A+evidence+for+a+role+of+CD44+in+regulating+detachment+of+migrating+cells+from+the+luminal+surface%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Neutrophil migration across intestinal epithelium: evidence for a role of CD44 in regulating detachment of migrating cells from the luminal surface.</a> J. Immunol. 185, 7026-7036 (2010).</li>
<li>Lawrence, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antiadhesive+role+of+apical+decay-accelerating+factor+%28CD55%29+in+human+neutrophil+transmigration+across+mucosal+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Antiadhesive role of apical decay-accelerating factor (CD55) in human neutrophil transmigration across mucosal epithelia.</a> J. Exp. Med. 198, 999-1010 (2003).</li>
<li>Hodges, K., Hecht, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interspecies+communication+in+the+gut%2C+from+bacterial+delivery+to+host-cell+response%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Interspecies communication in the gut, from bacterial delivery to host-cell response.</a> J. Physiol. 590, 433-440 (2012).</li>
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Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Neutrophile Migration über Schleimhautepitheloberflächen ist ein häufiges Merkmal in der Krankheitspathologie nach einer Infektion mit bakteriellen Krankheitserregern3. Die hier beschriebene Methode bietet einen schnellen, einfachen Ansatz, um dieses diskrete Ereignis experimentell zu isolieren, indem ein menschliches In-vitro-Kokultur-Assay-System verwendet wird, das ein Merkmal des entzündlichen Prozesses modelliert, der durch bakterielle Infektionen ausgelöst wird. Dieses System wurde ursprünglich...

Schleimhautoberflächen dienen als physikalische und immunologische Barrieren, die Schutz vor äußeren Bedrohungen bieten, die in der Umwelt allgegenwärtig sind1,2. Diese schützende Epithelbarriere kann beeinträchtigt werden, wenn pathogene Organismen in2eindringen. Im Falle eines bakteriellen Erregers löst diese Begegnung oft einen entzündlichen Prozess aus, indem sie das angeborene Immunsystem aktiviert und eine schnelle Mobilisierung von First Responder-Granulozyten, bekannt als Neutrophile2-4,auslöst. Chemotaktische Wirkstoffe, die die Neutrophilenrekrutierung erleichtern, werden zum Teil von den Mukosalepithelzellen produziert, die versuchen, den Wirt von dem beleidigenden Erreger2-4zu befreien. Übermäßige oder ungelöste neutrophile Infiltration der Schleimhautepitheloberfläche kann eine signifikante Pathologie verursachen1,5. Dies ist eine Folge von unspezifischen Gewebeschäden, die durch das antibakterielle Neutrophilenarsenal5-7verursacht werden. In solchen Fällen wird die bakterielle Clearance-Kapazität von Neutrophilen durch die Zerstörung des Wirtsgewebes während einer infektiösen Beleidigung überschattet.  Eine Störung der funktionalen Epithelbarriere kann zu einer verstärkten Exposition des darunter liegenden Gewebes gegenüber Mikroorganismen und/oder Toxinen führen und die Krankheitspathologie weiter verschlimmeren8,9. Diese Folgen können in mehreren Organsystemen einschließlich der Lunge und des Verdauungstraktes beobachtet werden1,5. Darüber hinaus sind nichtinfektiöse entzündliche Erkrankungen wie schwere Asthmaanfälle, chronisch obstruktive Lungenerkrankung (COPD), akutes Atemnotsyndrom (ARDS) und entzündliche Darmerkrankungen (IBD) durch den pathologischen Bruch der Schleimhautepithelbarriere durch eine übermäßige neutrophile Reaktion4,5,10-12gekennzeichnet.
Der komplexe Prozess der Neutrophilenrekrutierung nach einer Schleimhautinfektion umfasst mehrere abgeschottete Schritte1,5,13,14. Zunächst müssen Neutrophile über eine Reihe von Zell-zu-Zell-Wechselwirkungen, die die transendotheliale Migration erleichtern, aus dem Kreislauf abweichen1,13. Neutrophile navigieren als nächstes durch den vorhandenen interstitiellen Raum, der die extrazelluläre Matrix1,14enthält. Um das Lumen der infizierten Schleimhaut zu erreichen, müssen Neutrophile dann über die Epithelbarriere1,4,5wandern. Dieses komplizierte multistep Phänomen wird oft aggregiert mit in vivo Tiermodelle der Infektion15untersucht. Solche Modelle sind nützlich, um die Notwendigkeit spezifischer Faktoren wie Chemokine, Adhäsionsmoleküle oder Signalwege zu ermitteln, die am Gesamtprozess beteiligt sind, aber weitgehend unzureichend sind, um molekulare Beiträge zu lösen, die für jeden einzelnen unterteilten Schritt kritisch sind16. Cokultivierte In-vitro-Systeme, die trans-endotheliale, transmatrix- oder transepitheliale Migration von Neutrophilen modellieren, waren in dieser Hinsicht besonders nützlich1,14,16,17.
Ein robustes Cokultur-Assay-System wurde entwickelt, um Mechanismen zu entschlüsseln, die für die neutrophile transepitheliale Migration als Reaktion auf pathogene Infektionen verantwortlich sind18-22. Dieses Modell beinhaltet die Infektion der apikalen Oberfläche polarisierter menschlicher Epithelzellschichten mit einem bakteriellen Erreger, gefolgt von der Anwendung frisch isolierter menschlicher Neutrophile auf die basolaterale Oberfläche18-22. Neutrophile wandern über die Epithelbarriere als Reaktion auf epitheliale chemotaktische Produkte, die nach pathogener Infektion18,21-23sezerniert wurden. Dieses Modellsystem wurde mit Darm- und Lungenepithelkulturen eingesetzt, die geeigneten gewebespezifischen bakteriellen Krankheitserregern ausgesetzt sind, und hat neuartige molekulare Mechanismen enthüllt, die für den Neutrophilenrekrutierungsprozess während einer Schleimhautinfektion wichtig sind3,8,19,24-28. Die Stärke dieses In-vitro-Kokulturmodells besteht darin, dass ein reduktionistischer Ansatz es dem Forscher ermöglicht, den Erreger, die Epithelbarriere und/oder neutrophile in einem gut kontrollierten, hochreproduzierbaren, ziemlich preiswerten System experimentell zu manipulieren. Die aus diesem Ansatz gewonnenen Erkenntnisse können effektiv genutzt werden, um eine fokussierte Analyse von kompartumlierten Ereignissen während der Neutrophilenrekrutierung mit In-vivo-Infektionsmodellen 22,29,30durchzuführen.
Dieser Artikel zeigt die verschiedenen Schritte, die für die erfolgreiche Etablierung dieses reproduzierbaren Modells erforderlich sind, um pathogene induzierte neutrophile transepitheliale Migration zu erforschen. Lungenepithelbarrieren, die mit dem Erreger Pseudomonas aeruginosa infiziert sind, sind in diesem Artikel enthalten; andere Gewebeepithelien und Krankheitserreger können jedoch durch geringfügige Modifikationen ersetzt werden. Die Aussaat und Kultivierung polarisierter Lungenepithelzellschichten auf invertierten kollagenbeschichteten durchlässigen Transwellfiltern wird hierin detailliert beschrieben, ebenso wie das Wachstum der pathogenen P. aeruginosa und die Isolierung von Neutrophilen aus Vollblut. Wie diese Komponenten kombiniert werden, um pathogeninduzierte neutrophile transepitheliale Migration zu beobachten, wird zusammen mit geeigneten positiven und negativen Kontrollen vorgestellt, um einen reproduzierbaren Assay zu etablieren. Die Vielseitigkeit dieses Ansatzes zur Untersuchung verschiedener Aspekte der pathogenen induzierten neutrophilen transepitheliale Migration wird unter Bezugnahme auf spezifische Studien in der Literatur diskutiert.

<table><tbody><tr><td>NCl-H292 Zellen</td><td>ATCC</td><td>CRL-1848</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 Medium</td><td>ATCC</td><td>30-2001</td><td></td></tr><tr><td>Pseudomonas aeruginosa PAO1</td><td>ATCC</td><td>#47085</td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli MC1000</td><td>ATCC</td><td>#39531</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS (1x) flüssig</td><td>Invitrogen</td><td>14190-144</td><td>ohne Calcium und Magnesium</td></tr><tr><td>Hitze Inaktiviertes fötales Rinderserum</td><td>Invitrogen</td><td>10082-147</td><td>10% dem Kulturmedium zugesetzt</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td>100x: 10.000 Einheiten Penicillin und 10.000 &; Mikro; g Streptomycin pro ml.</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0,05%)</td><td>Invitrogen</td><td>25300-062</td><td>50 ml Aliquots werden gefroren bei -20 °C gelagert.&nbsp; Aliquot in Gebrauch kann bei 4 &ordm; C kurzfristig.&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Hank's Balanced Salt Solution - HBSS(-)</td><td>Invitrogen</td><td>14175-079</td><td>Steril, ohne Calcium und Magnesium</td></tr><tr><td>Trypanblaue Lösung</td><td>Invitrogen</td><td>15250-061.</td><td>Aktie = 0,4 %</td></tr><tr><td>Kollagen, Rattenschwanz</td><td>Invitrogen</td><td>A10483-01</td><td>Kann auch im Labor direkt aus den Schwänzen von Ratten unter Verwendung von Standardprotokollen isoliert werden</td></tr><tr><td>Zitronensäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1909-500G</td><td>Bestandteil von 1 M Citratpuffer und saurer Citrat Dextrose (ACD) Lösung</td></tr><tr><td>Natriumcitrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4641-500G</td><td>Bestandteil von 1 M Citratpuffer</td></tr><tr><td>Dextrose wasserfrei</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8066-250G</td><td>Bestandteil der Lösung von saurer Citratdextrose (ACD)</td></tr><tr><td>Ammoniumchlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>213330-500G</td><td>Bestandteil des Lysepuffers der roten Blutkörperchen (RBC)</td></tr><tr><td>Natriumbicarbonat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6014-500G</td><td>Bestandteil des Lysepuffers der roten Blutkörperchen (RBC)</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>ED-100G</td><td>Bestandteil des Lysepuffers der roten Blutkörperchen (RBC)</td></tr><tr><td>HBSS(+)-Pulver</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1387-10L</td><td>Schlüsselkomponente von HBSS+</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375-500G</td><td>Komponente von HBSS+</td></tr><tr><td>Sigmacote</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SL2-25ML</td><td>Befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers, um Pipettenspitzen aus Glas zu beschichten</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-9284</td><td></td></tr><tr><td>2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonsäure) Diammoniumsalz (ABTS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9941-50TAB</td><td>Schlüsselkomponente der ABTS-Substratlösung</td></tr><tr><td>30%ige Wasserstoffperoxidlösung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1009-100ML</td><td>Bestandteil der ABTS-Substratlösung</td></tr><tr><td>N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLP oder fMLF)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F-3506</td><td>Es sollte eine Stammlösung von 10 mM in DMSO hergestellt und die Aliquote bei -20 μC gelagert werden.</td></tr><tr><td>Gelatine Typ B</td><td>Fisher Scientific</td><td>M-12026</td><td></td></tr><tr><td>Pseudomonas-Isolationsagar</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0927-17-1</td><td>Hersteller folgen Anleitung zur Herstellung von PIA-Platten</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>45-001-749</td><td>Optional, kann die Reinheit von Neutrophilen verbessern</td></tr><tr><td>24-Well-Migrationsplatte Corning</td><td>Incorporated</td><td>#3524</td><td></td></tr><tr><td>24-Well-Waschplatte</td><td>Falcon</td><td>35-1147</td><td>Kann wiederverwendet werden, wenn sie in 70% Ethanol eingeweicht und vor der Wiederverwendung gründlich gewaschen</td></tr> wird <tr><td>96-Well-Platte</td><td>Fisher Scientific</td><td>#12565501</td><td></td></tr><tr><td>Transwell Permeable Supports&nbsp;</td><td>Corning Incorporated</td><td>#3415</td><td>Polycarbonat; Durchmesser: 6,5 mm; Wuchsfläche: 0,33 cm2; Gericht: 24-Well-Platte; Porengröße: 3,0 & Mikro; m</td></tr><tr><td>Petrischale</td><td>Falcon</td><td>35-1013</td><td>Jede Petrischale fasst 24 umgedrehte 0,33 cm2 Transwells.&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>500 ml 0,2 &mu; m Filter / Kolben</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-740-25A</td><td>Zur Sterilisation von saurer Citrat-Dextrose-Lösung (ACD)</td></tr><tr><td>5-3/4 in Glas Pasteur-Pipette</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20A</td><td>Spitzen vor dem Gebrauch mit Sigmacote beschichten</td></tr><tr><td>Hämostat</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-812-14</td><td>Gebogenes, gezacktes</td></tr><tr><td>Invertoskop Inverses Mikroskop</td><td>Zeiss</td><td>#342222</td><td></td></tr><tr><td>Versa-Max Mikroplatten-Reader</td><td>für molekulare Geräte</td><td>#432789</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro coculture assay zur bewertung pathogeninduzierter neutrophiler transepithelmigration

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

Schleimhautoberflächen dienen als Schutzbarrieren gegen pathogene Organismen. Angeborene Immunantworten werden bei der Erfassung von Krankheitserregern aktiviert, die zur Infiltration von Geweben mit wandernden Entzündungszellen führen, in erster Linie Neutrophilen. Dieser Prozess hat das Potenzial, gewebezerstörend zu sein, wenn er übermäßig ist oder in einem ungelösten Zustand gehalten wird.  Cokultivierte In-vitro-Modelle können verwendet werden, um die einzigartigen molekularen Mechanismen zu untersuchen, die an pathogenerinduzierter neutrophiler transepitheliale Migration beteiligt sind. Diese Art von Modell bietet Vielseitigkeit im experimentellen Design mit der Möglichkeit für die kontrollierte Manipulation des Erregers, Epithelbarriere, oder Neutrophil. Die pathogene Infektion der apikalen Oberfläche polarisierter Epithelmonolayer, die auf durchlässigen Transwellfiltern angebaut werden, löst physiologisch relevante basolaterale zu apikale transepitheliale Migration von Neutrophilen aus, die auf die basolaterale Oberfläche aufgetragen werden. Das hier beschriebene In-vitro-Modell zeigt die verschiedenen Schritte, die zum Nachweis der neutrophilen Migration über eine polarisierte Lungenepithelmonoschicht erforderlich sind, die mit der pathogenen P. aeruginosa (PAO1) infiziert ist. Die Aussaat und Kultivierung durchlässiger Transwells mit menschlichen Lungenepithelzellen wird beschrieben, zusammen mit der Isolierung von Neutrophilen aus ganzem menschlichen Blut und der Kultivierung von PAO1 und nichtpathogenem K12 E. coli (MC1000).  Der Emigrationsprozess und die quantitative Analyse erfolgreich migrierter Neutrophilen, die als Reaktion auf pathogene Infektionen mobilisiert wurden, werden mit repräsentativen Daten, einschließlich positiver und negativer Kontrollen, dargestellt. Dieses In-vitro-Modellsystem kann manipuliert und auf andere Schleimhautoberflächen aufgebracht werden. Entzündungsreaktionen, die eine übermäßige neutrophile Infiltration beinhalten, können zerstörerisch für Wirtsgewebe sein und können ohne pathogene Infektionen auftreten. Ein besseres Verständnis der molekularen Mechanismen, die die neutrophile transepitheliale Migration durch experimentelle Manipulation des hier beschriebenen In-vitro-Kokultur-Assay-Systems fördern, hat ein erhebliches Potenzial, neue therapeutische Ziele für eine Reihe von mukosalen infektiösen sowie entzündlichen Erkrankungen zu identifizieren.

Mehrere Studien haben gezeigt, dass pathogeninfizierte Epithelschichten die neutrophile transepitheliale Migration erleichtern3,8,19,24-28,31,32. Dies geschieht über eine pathogen-spezifische Induktion eines epitheliaalzellabgeleiteten neutrophilen chemotaktischen Gradienten3,23. Zum Beispiel bewirkt die pathogene P. aeruginosa, die mit der apikalen Oberfläche von Lungenepithelzellen interagiert, dass eine beträchtliche Anzahl von Neutrophilen über die Epithelschicht18,22,25,26,33,34</...

Neutrophile transepitheliale Migration als Reaktion auf eine mukosasale bakterielle Infektion trägt zu Epithelverletzungen und klinischen Erkrankungen bei. Es wurde ein In-vitro-Modell entwickelt, das Erreger, menschliche Neutrophile und polarisierte menschliche Epithelzellschichten kombiniert, die auf Transwell-Filtern angebaut werden, um Untersuchungen zur Entwirrung der molekularen Mechanismen zu erleichtern, die dieses Phänomen orchestrieren.

In vitro Coculture Assay zur Bewertung pathogeninduzierter Neutrophiler Transepithelmigration

Mucosal surfaces serve as protective barriers against pathogenic organisms.&#160;Innate immune responses are activated upon sensing pathogen leading to ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, die Anzahl der Neutrophilen zu bestimmen, die als Reaktion auf eine Infektion eine Epithelzell-Monoschicht durchquert haben. Dies wird erreicht, indem transwells kollagenkodierend werden, bevor epitheliale Zellmonoschichten mit dem invertierten Transwell-Filtermanöver sorgfältig kultiviert werden. In einem zweiten Schritt wird ein bakterieller Krankheitserreger kultiviert, um die apikale Oberfläche der auf den Transwell-Filtern gewachsenen Epithelmonoschicht zu infizieren, wodurch die Epithelzellen endogene neutrophile Chemolockstoffe produzieren.Als nächstes werden aus Vollblut isolierte Neutrophile auf die basolaterale Seite der infizierten epithelialen Monoschichten gegeben, die auf Transwell-Filtern gezüchtet wurden, um die Migration von Neutrophilen von der basolateralen zur apikalen Seite zu testen. Es werden Ergebnisse erzielt, die einen signifikanten Anstieg der Anzahl von transepithelial migrierenden Neutrophilen zeigen, die als Reaktion auf infizierte epitheliale Monoschichten beobachtet wurden, basierend auf der Quantifizierung der Myeloperoxidase aus migrierten Neutrophilen. Die visuelle Demonstration dieser Metho

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

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Lernen Sie die In-vitro-Coculture-Assay-Methode zur Quantifizierung neutrophiler Transepithelmigration bei bakterieller Infektion. Dieses Modell ermöglicht die Untersuchung immunologischer Mechanismen in der Zellbiologie.

In vitro Coculture Assay zur Bewertung pathogeninduzierter Neutrophiler Transepithelmigration

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