In vitro Coculture Assay zur Bewertung pathogeninduzierter Neutrophiler Transepithelmigration

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, die Anzahl der Neutrophilen zu bestimmen, die als Reaktion auf eine Infektion eine Epithelzell-Monoschicht durchquert haben. Dies wird erreicht, indem transwells kollagenkodierend werden, bevor epitheliale Zellmonoschichten mit dem invertierten Transwell-Filtermanöver sorgfältig kultiviert werden. In einem zweiten Schritt wird ein bakterieller Krankheitserreger kultiviert, um die apikale Oberfläche der auf den Transwell-Filtern gewachsenen Epithelmonoschicht zu infizieren, wodurch die Epithelzellen endogene neutrophile Chemolockstoffe produzieren.

Als nächstes werden aus Vollblut isolierte Neutrophile auf die basolaterale Seite der infizierten epithelialen Monoschichten gegeben, die auf Transwell-Filtern gezüchtet wurden, um die Migration von Neutrophilen von der basolateralen zur apikalen Seite zu testen. Es werden Ergebnisse erzielt, die einen signifikanten Anstieg der Anzahl von transepithelial migrierenden Neutrophilen zeigen, die als Reaktion auf infizierte epitheliale Monoschichten beobachtet wurden, basierend auf der Quantifizierung der Myeloperoxidase aus migrierten Neutrophilen. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da das invertierte Transwell-Filter-Manöver zur Züchtung und Infektion von Epithelbarrieren unkonventionell ist und daher für unbekannte Forschungsgruppen in ihrem Labor weniger zugänglich sein kann.

Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die Therapie von entzündlichen Erkrankungen der Atemwege mit Infektionen wie Lungenentzündung oder Mukoviszidose, da neuartige Behandlungen entwickelt und getestet werden können, um die Menge der neutrophilen trans-epithelialen Migration zu verringern, was die schädlichen Auswirkungen einer übereifrigen neutrophilen Verletzung der Schleimhautbarrieren abschwächen kann. Neben Mark, der als klinischer Mitarbeiter in meinem Labor tätig ist, werden der leitende Techniker Wahi Preza und der Postdoktorand Michael Pesos das Verfahren demonstrieren. Um mit der Entnahme einer Wachstumsfläche von 0,33 Quadratzentimetern zu beginnen, wird eine Transwells mit einer Porengröße von drei Mikrometern aus der Verpackung genommen und die 24-Well-Platte mit 12 Transwells kopfüber in die Haube gelegt.

Heben Sie die Bodenplatte ab und legen Sie sie beiseite. Transwells stehen nun auf dem Kopf. Auf dem Deckel der 24-Well-Plattenflamme ruht ein Hämostatikum für Sterilität und lässt es abkühlen.

Unter Verwendung des sterilen Hämostatentransfers werden in eine 150 x 25 Millimeter große Petrischale verlagert und in der umgekehrten Position 70 Mikroliter einer vorbereiteten Kollagenlösung von 30 Mikrogramm pro Milliliter in Ethanol auf die Filtermembran jeder invertierten Transwell-Oberfläche pipettiert. Die Spannung sollte dieses Lösungsvolumen an Ort und Stelle halten, da sich beim Zugang zur Oberfläche der Unterseite keine Wände um die Filtermembran herum befinden. Achten Sie darauf, dass die Kollagenlösung nicht an der Seite des Transwells heruntertropft, und vermeiden Sie es, die Transwells während des Beschichtungsvorgangs zu bewegen. Lassen Sie den Deckel der Petrischale mindestens vier Stunden lang abgenommen, damit das Ethanol verdampfen kann. Um die Sterilität während dieses Prozesses zu erhalten.

Lassen Sie den Haubenlüfter und das ultraviolette Licht nach dem Verpacken der Epithelzellen eingeschaltet, wie im Textprotokoll beschrieben. Geben Sie 70 Mikroliter der Resus-Schwebzellenlösung aus einem 15-Milliliter-Röhrchen in jedes mit invertiertem Kollagen beschichtete Transwell. Mischen Sie die Zellsuspension, indem Sie das Röhrchen regelmäßig vorsichtig umdrehen, um zu verhindern, dass sich Zellen während der Aussaat der Transwells am Boden des 15-Milliliter-Röhrchens absetzen.

Sobald alle umgedrehten Transwells mit Epithelzellen besiedelt sind, setzen Sie den Deckel der Petrischale wieder auf und legen Sie die Zellen am nächsten Tag vorsichtig in den Gewebekultur-Inkubator. Geben Sie einen Milliliter Medium in jede Vertiefung der ursprünglichen sterilen 24-Well-Platte und verwenden Sie einen sterilisierten Hämostaten, um jede invertierte Trans-Vertiefung in jede Vertiefung zu stecken, die einen Milliliter Medium enthält. 0,2 Milliliter des Mediums werden in die obere Kammer jeder Trans-Vertiefung gegeben und in den Gewebekultur-Inkubator zurückgeführt.

Entfernen Sie die 24-Well-Platte, die Epithelschichten stützt und mindestens acht Tage lang auf der Unterseite der Transwell-Filtermembranen kultiviert wurde, aus dem Inkubator. Fassen Sie den Rand jedes Trans-Wells mit einem Hämostaten an und heben Sie es aus der 24-Well-Platte. Drehen Sie den Transwell über einen Abfalleimer, um Nährmedien aus der Innenkammer des Transwells zu entsorgen.

Tauchen Sie jeden Transwell in ein Waschbecherglas, das Hank's ausgewogene Salzlösung mit Calcium und Magnesium oder Hank's Plus enthält, um die Innenkammer des Transwells zu füllen. Entsorgen Sie dann die Flüssigkeit aus der Innenkammer in einen Abfalleimer. Wiederholen Sie diesen Schritt für eine Sekunde.

Nach zwei Wäschen in Hank's plus waschen. Legen Sie die Transwells in eine neue 24-Well-Platte, die einen Milliliter Hank's Plus enthält. Beobachten Sie in jeder Vertiefung die obere Kammer jedes Transwells, um die Integrität der Epithelzellschicht zu beurteilen.

Hank's Plus sollte nicht in die obere Kammer des Transwells auslaufen und diese füllen, wenn es in die Vertiefung einer 24-Well-Platte mit einem Milliliter Hank's Plus gelegt wird. Nachdem Sie jeden Transwell sorgfältig beobachtet haben, geben Sie 0,2 Milliliter Hanks Plus in die obere Kammer. Legen Sie die Platte für 30 bis 60 Minuten in den Inkubator, um die Epithelzellschichten zu äquilibrieren und den transepithelialen Migrationsassay für Neutrophile durchzuführen.

Fassen Sie jedes Transwell mit einem Blutstillungsmittel aus der 24-Well-Platte der Wash Transwells, die in Hank's Plus äquilibriert sind, und entsorgen Sie die Flüssigkeit in der oberen Vertiefung in einen Abfalleimer. Platzieren Sie jeden Transwell kopfüber in einer 150 x 25 Millimeter großen Petrischale zu sechs der umgedrehten Transwells. Fügen Sie 25 Mikroliter Hanks plus zu drei der umgedrehten Transwells hinzu.

Infizieren Sie die Zellen mit 25 Mikrolitern Pseudomonas, Arosa oder Pao, die in Hanks plus verdünnt sind, wie im Textprotokoll beschrieben, um die letzten drei invertierten Transwells zu infizieren, infizieren Sie die Zellen mit 25 Mikrolitern e Coli, K 12 oder mc 1000, verdünnt in Hanks Plus, ebenfalls wie im Textprotokoll beschrieben, nach Inkubation bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid in einer befeuchteten Kammer für 60 Minuten. Waschen Sie die Transwells, indem Sie sie mit einem Blutstiller greifen und wieder in eine 24-Well-Waschplatte drehen, die einen Milliliter Hank's Plus enthält. In den unteren Kammern.

Geben Sie 0,2 Milliliter Hank's Plus in die oberen Kammern. Fassen Sie den Transwell mit einem Blutstiller an und nehmen Sie ihn von der ersten Waschplatte. Entsorgen Sie die Flüssigkeit aus der oberen Kammer in einen Abfalleimer.

Bevor Sie die Transwells in eine zweite 24-Well-Waschplatte mit einem Milliliter Hanks plus legen, geben Sie 0,2 Milliliter Hanks plus in die obere Kammer. Wiederholen Sie diesen Schritt noch einmal für insgesamt drei Wäschen. Nach dem dritten Waschen wird die Flüssigkeit aus den oberen Kammern der Trans-Vertiefungen mit einem Hämostat in einen Abfalleimer gegeben. Drei der nicht infizierten Trans-Vertiefungen werden in drei Vertiefungen der 24-Well-Migrationsplatte mit einem Milliliter Hanks Plus platziert, die die Negativkontrollpipette darstellt. 10 Mikroliter einer 10-mikromolaren Lösung von FMLP in jede der drei Vertiefungen der 24-Well-Migrationsplatte mit einem Milliliter Hanks Platzieren Sie außerdem drei der nicht infizierten trans-Wells in drei Vertiefungen der 24-Well-Migrationsplatte, die 100 Nanomolare FMLP enthält, was eine positive Kontrolle für die Fähigkeit isolierter Neutrophilen zur Migration darstellt.

Platzieren Sie dann die drei mit PAO infizierten Trans-Wells eins und die drei mit mc 1000 infizierten Trans-Wells in drei entsprechende Vertiefungen der 24-Well-Migrationsplatte, die einen Milliliter Hanks enthalten, plus fügen Sie 0,1 Milliliter Hanks plus in die obere Kammer jeder Trans-Vertiefung auf die 0,1 Milliliter Hanks plus in jeder trans hinzu. Nun, fügen Sie vorsichtig 20 Mikroliter der neutrophilen Suspension hinzu, die wie im Textprotokoll beschrieben hergestellt wurde. Zwei Stunden inkubieren, um die transepitheliale Migration der Neutrophilen zu ermöglichen.

Heben Sie nach zwei Stunden Migration die Transwells an, indem Sie sie mit einem Blutstiller greifen und vorsichtig gegen die Innenwände der 24-Well-Migrationsplatte klopfen. Bevor Sie die Trans-Vertiefungen verwerfen, beurteilen Sie die Migration von Neutrophilen in den Vertiefungen grob, indem Sie die Vertiefungen der 24-Well-Migrationsplatte unter einem inversen Mikroskop mit dem 10-fach-Objektiv betrachten. Fügen Sie dann 50 Mikroliter 10 % Triton X 100 zu jeder Vertiefung hinzu, die in der 24-Well-Migrationsplatte, jedem Standard und dem Rohling verwendet wird.

Drehen Sie die 24-Well-Migrationsplattenstandards und blanken Sie 20 Minuten lang bei niedriger Geschwindigkeit. Bei vier Grad Celsius. Fügen Sie 50 Mikroliter Citratpuffer hinzu.

Jeweils zwei Vertiefungen, die in der 24-Well-Migrationsplatte zu jedem Standard und zum Rohling gründlich verwendet werden. Mischen Sie den Inhalt in jeder Probenvertiefung, indem Sie die Lösung mindestens fünfmal auf und ab pipettieren. Übertragen Sie dann 100 Mikroliter jeder Probenvertiefung in doppelter Ausführung auf eine 96-Well-Platte, 100 Mikroliter jedes Standards und den Rohling auf die 96-Well-Platte.

Nach dem Mischen 50 Mikroliter 30%iges Wasserstoffperoxid zur A BTS-Lösung geben und vortexen. Geben Sie dann 100 Mikroliter A BTS-Substratlösung zu jeder Probe. Lassen Sie die Platte auf der 96-Well-Platte fünf bis 10 Minuten im Dunkeln entwickeln.

Beobachten Sie die Entwicklung der grünen Farbe in den Vertiefungen der Platte, die Lyse-Neutrophile enthalten, bevor Sie bei einer Wellenlänge von 405 Nanometern ablesen. Mit einem Mikroplatten-Reader zur Beurteilung der transepithelialen Migration von Neutrophilen können Neutrophile, die vollständig über die Epithelschicht in die apikale Kammer gewandert sind, in der unteren Vertiefung der 24-Well-Migrationsplatte betrachtet werden, wie hier mit einem inversen Lichtmikroskop dargestellt. Es wurde beobachtet, dass nur sehr wenige Neutrophile durch eine nicht infizierte Epithelschicht ohne auferlegten chemotaktischen Gradienten wandern und Hintergrundwerte im Assay darstellen.

Im Gegensatz dazu zeigte sich eine Häufigkeit von transmi-Neutrophilen, wenn ein FMLP-Gradient bereitgestellt wurde. Die Infektion des Epithels mit nicht-pathogenen e coli mc 1000 führte zu wenigen sichtbaren transmigrierten Neutrophilen, während viele transmigrierte Neutrophile bei einer Infektion der Epithelschichten mit dem lungenpathogenen Pseudomonas aerogen zu beobachten waren. Die Neutrophilen, die im Experiment migriert sind, werden durch Messung ihrer Myeloperoxidase-Aktivität quantifiziert.

Die Anzahl der Neutrophilen korreliert positiv mit der Menge der Peroxidaseaktivität, die nach der Lyse von Neutrophilen gemessen wird, wobei die Werte eine lineare Beziehung in dem für die Standardkurve ausgewählten Bereich der Neutrophilenzahlen aufweisen. Eine signifikante Anzahl von Neutrophilen wandert durch Epithelschichten als Reaktion auf den von A bereitgestellten FMLP-Gradienten oder als Reaktion auf eine mit PAO one infizierte Epithelschicht. Die Anzahl der Neutrophilen, die ohne Stimuli oder nach apikaler Epithelinfektion mit nicht-pathogenen e e coli mc 1000 migrieren, liegt unter der Nachweisgrenze für den Assay.

Sobald diese Technik gemeistert ist, kann sie in fünf Stunden für die Kollagenbeschichtung und Aussaat der Epithelzellen auf den Transwell-Filtern durchgeführt werden, gefolgt von mindestens einer Woche, damit die Epithelzellen wachsen können. Sobald die epithelialen Monoschichten fertig sind. Der Migrationsassay kann in fünf Stunden durchgeführt werden, einschließlich der Isolierung von Neutrophilen und der Aufbereitung von Bakterien, wenn er ordnungsgemäß durchgeführt wird.

Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, die Transwell-Filter unter sterilen Bedingungen vorzubereiten, um eine Kontamination zu vermeiden. Dieses Verfahren kann angepasst werden, um zusätzliche Fragen im Zusammenhang mit diesem Entzündungsprozess zu beantworten. Es kann eine Analyse der migrierten Zellen, des Epithels, des Rückenbodens oder auch des Erregers durchgeführt werden.