Name: In vitro Coculture Assay zur Bewertung pathogeninduzierter Neutrophiler Transepithelmigration (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-06T15:45:00.000+00:00
Duration: 14 min 14 s
Description: Lernen Sie die In-vitro-Coculture-Assay-Methode zur Quantifizierung neutrophiler Transepithelmigration bei bakterieller Infektion. Dieses Modell ermöglicht die Untersuchung immunologischer Mechanismen in der Zellbiologie.

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Diese Arbeit wurde von NIH (1 R01 AI095338-01A1) finanziell unterstützt.

<ol><li>Burns, A. R., Smith, C. W., Walker, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+structural+features+that+influence+neutrophil+emigration+into+the+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Unique structural features that influence neutrophil emigration into the lung.</a> Physiol. Rev. 83, 309-336 (2003).</li>
<li>Hurley, B. P., McCormick, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+epithelial+defense+systems+protect+against+bacterial+threats%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Gastroenterol.+Rep%22%5BJournal%5D)">Intestinal epithelial defense systems protect against bacterial threats.</a> Curr. Gastroenterol. Rep. 6, 355-361 (2004).</li>
<li>McCormick, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial-induced+hepoxilin+A3+secretion+as+a+pro-inflammatory+mediator%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">Bacterial-induced hepoxilin A3 secretion as a pro-inflammatory mediator.</a> FEBS J. 274, 3513-3518 (2007).</li>
<li>Mumy, K. L., McCormick, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+neutrophils+in+the+event+of+intestinal+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">The role of neutrophils in the event of intestinal inflammation.</a> Curr. Opin. Pharmacol. 9, 697-701 (2009).</li>
<li>Chin, A. C., Parkos, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathobiology+of+neutrophil+transepithelial+migration%3A+implications+in+mediating+epithelial+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Pathobiology of neutrophil transepithelial migration: implications in mediating epithelial injury.</a> Annu. Rev. Pathol. 2, 111-143 (2007).</li>
<li>Segel, G. B., Halterman, M. W., Lichtman, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+paradox+of+the+neutrophil%27s+role+in+tissue+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Leukoc.+Biol%22%5BJournal%5D)">The paradox of the neutrophil's role in tissue injury.</a> J. Leukoc. Biol. 89, 359-372 (2011).</li>
<li>Weiss, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+destruction+by+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Tissue destruction by neutrophils.</a> N. Engl. J. Med. 320, 365-376 (1989).</li>
<li>Hurley, B. P., Thorpe, C. M., Acheson, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shiga+toxin+translocation+across+intestinal+epithelial+cells+is+enhanced+by+neutrophil+transmigration%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Shiga toxin translocation across intestinal epithelial cells is enhanced by neutrophil transmigration.</a> Infect. Immun. 69, 6148-6155 (2001).</li>
<li>Kohler, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salmonella+enterica+serovar+Typhimurium+regulates+intercellular+junction+proteins+and+facilitates+transepithelial+neutrophil+and+bacterial+passage%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Gastrointest.+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Salmonella enterica serovar Typhimurium regulates intercellular junction proteins and facilitates transepithelial neutrophil and bacterial passage.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 293, 178-187 (2007).</li>
<li>Gane, J., Stockley, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+neutrophil+transmigration+across+the+vascular+endothelium+in+COPD%5BTitle%5D)+AND+%22Thorax%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of neutrophil transmigration across the vascular endothelium in COPD.</a> Thorax. 67, 553-561 (2012).</li>
<li>Grommes, J., Soehnlein, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+neutrophils+to+acute+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Contribution of neutrophils to acute lung injury.</a> Mol. Med. 17, 293-307 (2011).</li>
<li>Nakagome, K., Matsushita, S., Nagata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophilic+inflammation+in+severe+asthma%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+Arch.+Allergy+Immunol.%22%5BJournal%5D)">Neutrophilic inflammation in severe asthma.</a> Int. Arch. Allergy Immunol.. 158 Suppl 1, 96-102 (2012).</li>
<li>Choi, E. Y., Santoso, S., Chavakis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+neutrophil+transendothelial+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Biosci%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of neutrophil transendothelial migration.</a> Front. Biosci. 14, 1596-1605 (2009).</li>
<li>Louis, N. A., Campbell, E., Colgan, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model+systems+to+investigate+neutrophil+adhesion+and+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Model systems to investigate neutrophil adhesion and chemotaxis.</a> Methods Mol. Biol. 412, 257-270 (2007).</li>
<li>Craig, A., Mai, J., Cai, S., Jeyaseelan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+recruitment+to+the+lungs+during+bacterial+pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Neutrophil recruitment to the lungs during bacterial pneumonia.</a> Infect. Immun. 77, 568-575 (2009).</li>
<li>Hurley, B. P., McCormick, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+tissue+culture+results+into+animal+models%3A+the+case+of+Salmonella+typhimurium%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Translating tissue culture results into animal models: the case of Salmonella typhimurium.</a> Trends Microbiol. 11, 562-569 (2003).</li>
<li>Lee, W. Y., Chin, A. C., Voss, S., Parkos, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+neutrophil+transepithelial+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">In vitro neutrophil transepithelial migration.</a> Methods Mol. Biol. 341, 205-215 (2006).</li>
<li>Hurley, B. P., Siccardi, D., Mrsny, R. J., McCormick, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymorphonuclear+cell+transmigration+induced+by+Pseudomonas+aeruginosa+requires+the+eicosanoid+hepoxilin+A3%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Polymorphonuclear cell transmigration induced by Pseudomonas aeruginosa requires the eicosanoid hepoxilin A3.</a> J. Immunol. 173, 5712-5720 (2004).</li>
<li>McCormick, B. A., Colgan, S. P., Delp-Archer, C., Miller, S. I., Madara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salmonella+typhimurium+attachment+to+human+intestinal+epithelial+monolayers%3A+transcellular+signalling+to+subepithelial+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Salmonella typhimurium attachment to human intestinal epithelial monolayers: transcellular signalling to subepithelial neutrophils.</a> J. Cell Biol. 123, 895-907 (1993).</li>
<li>McCormick, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+attachment+of+Salmonella+typhimurium+to+intestinal+epithelia+imprints+the+subepithelial+matrix+with+gradients+chemotactic+for+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Surface attachment of Salmonella typhimurium to intestinal epithelia imprints the subepithelial matrix with gradients chemotactic for neutrophils.</a> J. Cell Biol. 131, 1599-1608 (1995).</li>
<li>Mrsny, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+hepoxilin+A3+in+inflammatory+events%3A+a+required+role+in+neutrophil+migration+across+intestinal+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Identification of hepoxilin A3 in inflammatory events: a required role in neutrophil migration across intestinal epithelia.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 7421-7426 (2004).</li>
<li>Tamang, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepoxilin+A%283%29+facilitates+neutrophilic+breach+of+lipoxygenase-expressing+airway+epithelial+barriers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Hepoxilin A(3) facilitates neutrophilic breach of lipoxygenase-expressing airway epithelial barriers.</a> J. Immunol. 189, 4960-4969 (2012).</li>
<li>McCormick, B. A., Parkos, C. A., Colgan, S. P., Carnes, D. K., Madara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apical+secretion+of+a+pathogen-elicited+epithelial+chemoattractant+activity+in+response+to+surface+colonization+of+intestinal+epithelia+by+Salmonella+typhimurium%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Apical secretion of a pathogen-elicited epithelial chemoattractant activity in response to surface colonization of intestinal epithelia by Salmonella typhimurium.</a> J. Immunol. 160, 455-466 (1998).</li>
<li>Boll, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enteroaggregative+Escherichia+coli+promotes+transepithelial+migration+of+neutrophils+through+a+conserved+12-lipoxygenase+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Enteroaggregative Escherichia coli promotes transepithelial migration of neutrophils through a conserved 12-lipoxygenase pathway.</a> Cell Microbiol. 14, 120-132 (2012).</li>
<li>Hurley, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+two-component+sensor+response+regulator+RoxS%2FRoxR+plays+a+role+in+Pseudomonas+aeruginosa+interactions+with+airway+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+Infect%22%5BJournal%5D)">The two-component sensor response regulator RoxS/RoxR plays a role in Pseudomonas aeruginosa interactions with airway epithelial cells.</a> Microbes Infect. 12, 190-198 (2010).</li>
<li>Hurley, B. P., Williams, N. L., McCormick, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+phospholipase+A2+in+Pseudomonas+aeruginosa-mediated+PMN+transepithelial+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Lung+Cell+Mol.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Involvement of phospholipase A2 in Pseudomonas aeruginosa-mediated PMN transepithelial migration.</a> Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 290, L703-L709 (2006).</li>
<li>McCormick, B. A., Siber, A. M., Maurelli, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+of+the+Shigella+flexneri+virulence+plasmid+in+the+ability+to+induce+trafficking+of+neutrophils+across+polarized+monolayers+of+the+intestinal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Requirement of the Shigella flexneri virulence plasmid in the ability to induce trafficking of neutrophils across polarized monolayers of the intestinal epithelium.</a> Infect. Immun. 66, 4237-4243 (1998).</li>
<li>Savkovic, S. D., Koutsouris, A., Hecht, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attachment+of+a+noninvasive+enteric+pathogen%2C+enteropathogenic+Escherichia+coli%2C+to+cultured+human+intestinal+epithelial+monolayers+induces+transmigration+of+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Attachment of a noninvasive enteric pathogen, enteropathogenic Escherichia coli, to cultured human intestinal epithelial monolayers induces transmigration of neutrophils.</a> Infect. Immun. 64, 4480-4487 (1996).</li>
<li>Agbor, T. A., Demma, Z. C., Mumy, K. L., Bien, J. D., McCormick, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ERM+protein%2C+ezrin%2C+regulates+neutrophil+transmigration+by+modulating+the+apical+localization+of+MRP2+in+response+to+the+SipA+effector+protein+during+Salmonella+typhimurium+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The ERM protein, ezrin, regulates neutrophil transmigration by modulating the apical localization of MRP2 in response to the SipA effector protein during Salmonella typhimurium infection.</a> Cell Microbiol. 13, 2007-2021 (2011).</li>
<li>Pazos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multidrug+resistance-associated+transporter+2+regulates+mucosal+inflammation+by+facilitating+the+synthesis+of+hepoxilin+A3%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Multidrug resistance-associated transporter 2 regulates mucosal inflammation by facilitating the synthesis of hepoxilin A3.</a> J. Immunol. 181, 8044-8052 (2008).</li>
<li>Agace, W. W., Patarroyo, M., Svensson, M., Carlemalm, E., Svanborg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escherichia+coli+induces+transuroepithelial+neutrophil+migration+by+an+intercellular+adhesion+molecule-1-dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Escherichia coli induces transuroepithelial neutrophil migration by an intercellular adhesion molecule-1-dependent mechanism.</a> Infect. Immun. 63, 4054-4062 (1995).</li>
<li>Bhowmick, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+Disease+during+Streptococcus+pneumoniae+Acute+Lung+Infection+Requires+12-Lipoxygenase-Dependent+Inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Systemic Disease during Streptococcus pneumoniae Acute Lung Infection Requires 12-Lipoxygenase-Dependent Inflammation.</a> J. Immunol. , (2013).</li>
<li>Hurley, B. P., Pirzai, W., Mumy, K. L., Gronert, K., McCormick, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+eicosanoid-generating+capacity+of+cytoplasmic+phospholipase+A2+in+Pseudomonas+aeruginosa-infected+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Lung+Cell+Mol.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Selective eicosanoid-generating capacity of cytoplasmic phospholipase A2 in Pseudomonas aeruginosa-infected epithelial cells.</a> Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 300, 286-294 (2011).</li>
<li>Hurley, B. P., Sin, A., McCormick, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesion+molecules+involved+in+hepoxilin+A3-mediated+neutrophil+transepithelial+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Exp.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Adhesion molecules involved in hepoxilin A3-mediated neutrophil transepithelial migration.</a> Clin. Exp. Immunol. 151, 297-305 (2008).</li>
<li>Frank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Research+Topic+on+Pseudomonas+aeruginosa%2C+Biology%2C+Genetics%2C+and+Host-Pathogen+Interactions.%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Research Topic on Pseudomonas aeruginosa, Biology, Genetics, and Host-Pathogen Interactions.</a> Front. Microbiol. 3, 20 (2012).</li>
<li>Lyczak, J. B., Cannon, C. L., Pier, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+infections+associated+with+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Lung infections associated with cystic fibrosis.</a> Clin. Microbiol. Rev. 15, 194-222 (2002).</li>
<li>Bucior, I., Mostov, K., Engel, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa-mediated+damage+requires+distinct+receptors+at+the+apical+and+basolateral+surfaces+of+the+polarized+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa-mediated damage requires distinct receptors at the apical and basolateral surfaces of the polarized epithelium.</a> Infect. Immun. 78, 939-953 (2010).</li>
<li>Kierbel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+exploits+a+PIP3-dependent+pathway+to+transform+apical+into+basolateral+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa exploits a PIP3-dependent pathway to transform apical into basolateral membrane.</a> J. Cell Biol. 177, 21-27 (2007).</li>
<li>Lee, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+secreted+Salmonella+protein+induces+a+proinflammatory+response+in+epithelial+cells%2C+which+promotes+neutrophil+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A secreted Salmonella protein induces a proinflammatory response in epithelial cells, which promotes neutrophil migration.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 12283-12288 (2000).</li>
<li>Zurawski, D. V., Mumy, K. L., Faherty, C. S., McCormick, B. A., Maurelli, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shigella+flexneri+type+III+secretion+system+effectors+OspB+and+OspF+target+the+nucleus+to+downregulate+the+host+inflammatory+response+via+interactions+with+retinoblastoma+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Shigella flexneri type III secretion system effectors OspB and OspF target the nucleus to downregulate the host inflammatory response via interactions with retinoblastoma protein.</a> Mol. Microbiol. 71, 350-368 (2009).</li>
<li>Brazil, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+migration+across+intestinal+epithelium%3A+evidence+for+a+role+of+CD44+in+regulating+detachment+of+migrating+cells+from+the+luminal+surface%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Neutrophil migration across intestinal epithelium: evidence for a role of CD44 in regulating detachment of migrating cells from the luminal surface.</a> J. Immunol. 185, 7026-7036 (2010).</li>
<li>Lawrence, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antiadhesive+role+of+apical+decay-accelerating+factor+%28CD55%29+in+human+neutrophil+transmigration+across+mucosal+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Antiadhesive role of apical decay-accelerating factor (CD55) in human neutrophil transmigration across mucosal epithelia.</a> J. Exp. Med. 198, 999-1010 (2003).</li>
<li>Hodges, K., Hecht, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interspecies+communication+in+the+gut%2C+from+bacterial+delivery+to+host-cell+response%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Interspecies communication in the gut, from bacterial delivery to host-cell response.</a> J. Physiol. 590, 433-440 (2012).</li>
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Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Neutrophile Migration über Schleimhautepitheloberflächen ist ein häufiges Merkmal in der Krankheitspathologie nach einer Infektion mit bakteriellen Krankheitserregern3. Die hier beschriebene Methode bietet einen schnellen, einfachen Ansatz, um dieses diskrete Ereignis experimentell zu isolieren, indem ein menschliches In-vitro-Kokultur-Assay-System verwendet wird, das ein Merkmal des entzündlichen Prozesses modelliert, der durch bakterielle Infektionen ausgelöst wird. Dieses System wurde ursprünglich...

Schleimhautoberflächen dienen als physikalische und immunologische Barrieren, die Schutz vor äußeren Bedrohungen bieten, die in der Umwelt allgegenwärtig sind1,2. Diese schützende Epithelbarriere kann beeinträchtigt werden, wenn pathogene Organismen in2eindringen. Im Falle eines bakteriellen Erregers löst diese Begegnung oft einen entzündlichen Prozess aus, indem sie das angeborene Immunsystem aktiviert und eine schnelle Mobilisierung von First Responder-Granulozyten, bekannt als Neutrophile2-4,auslöst. Chemotaktische Wirkstoffe, die die Neutrophilenrekrutierung erleichtern, werden zum Teil von den Mukosalepithelzellen produziert, die versuchen, den Wirt von dem beleidigenden Erreger2-4zu befreien. Übermäßige oder ungelöste neutrophile Infiltration der Schleimhautepitheloberfläche kann eine signifikante Pathologie verursachen1,5. Dies ist eine Folge von unspezifischen Gewebeschäden, die durch das antibakterielle Neutrophilenarsenal5-7verursacht werden. In solchen Fällen wird die bakterielle Clearance-Kapazität von Neutrophilen durch die Zerstörung des Wirtsgewebes während einer infektiösen Beleidigung überschattet.  Eine Störung der funktionalen Epithelbarriere kann zu einer verstärkten Exposition des darunter liegenden Gewebes gegenüber Mikroorganismen und/oder Toxinen führen und die Krankheitspathologie weiter verschlimmeren8,9. Diese Folgen können in mehreren Organsystemen einschließlich der Lunge und des Verdauungstraktes beobachtet werden1,5. Darüber hinaus sind nichtinfektiöse entzündliche Erkrankungen wie schwere Asthmaanfälle, chronisch obstruktive Lungenerkrankung (COPD), akutes Atemnotsyndrom (ARDS) und entzündliche Darmerkrankungen (IBD) durch den pathologischen Bruch der Schleimhautepithelbarriere durch eine übermäßige neutrophile Reaktion4,5,10-12gekennzeichnet.
Der komplexe Prozess der Neutrophilenrekrutierung nach einer Schleimhautinfektion umfasst mehrere abgeschottete Schritte1,5,13,14. Zunächst müssen Neutrophile über eine Reihe von Zell-zu-Zell-Wechselwirkungen, die die transendotheliale Migration erleichtern, aus dem Kreislauf abweichen1,13. Neutrophile navigieren als nächstes durch den vorhandenen interstitiellen Raum, der die extrazelluläre Matrix1,14enthält. Um das Lumen der infizierten Schleimhaut zu erreichen, müssen Neutrophile dann über die Epithelbarriere1,4,5wandern. Dieses komplizierte multistep Phänomen wird oft aggregiert mit in vivo Tiermodelle der Infektion15untersucht. Solche Modelle sind nützlich, um die Notwendigkeit spezifischer Faktoren wie Chemokine, Adhäsionsmoleküle oder Signalwege zu ermitteln, die am Gesamtprozess beteiligt sind, aber weitgehend unzureichend sind, um molekulare Beiträge zu lösen, die für jeden einzelnen unterteilten Schritt kritisch sind16. Cokultivierte In-vitro-Systeme, die trans-endotheliale, transmatrix- oder transepitheliale Migration von Neutrophilen modellieren, waren in dieser Hinsicht besonders nützlich1,14,16,17.
Ein robustes Cokultur-Assay-System wurde entwickelt, um Mechanismen zu entschlüsseln, die für die neutrophile transepitheliale Migration als Reaktion auf pathogene Infektionen verantwortlich sind18-22. Dieses Modell beinhaltet die Infektion der apikalen Oberfläche polarisierter menschlicher Epithelzellschichten mit einem bakteriellen Erreger, gefolgt von der Anwendung frisch isolierter menschlicher Neutrophile auf die basolaterale Oberfläche18-22. Neutrophile wandern über die Epithelbarriere als Reaktion auf epitheliale chemotaktische Produkte, die nach pathogener Infektion18,21-23sezerniert wurden. Dieses Modellsystem wurde mit Darm- und Lungenepithelkulturen eingesetzt, die geeigneten gewebespezifischen bakteriellen Krankheitserregern ausgesetzt sind, und hat neuartige molekulare Mechanismen enthüllt, die für den Neutrophilenrekrutierungsprozess während einer Schleimhautinfektion wichtig sind3,8,19,24-28. Die Stärke dieses In-vitro-Kokulturmodells besteht darin, dass ein reduktionistischer Ansatz es dem Forscher ermöglicht, den Erreger, die Epithelbarriere und/oder neutrophile in einem gut kontrollierten, hochreproduzierbaren, ziemlich preiswerten System experimentell zu manipulieren. Die aus diesem Ansatz gewonnenen Erkenntnisse können effektiv genutzt werden, um eine fokussierte Analyse von kompartumlierten Ereignissen während der Neutrophilenrekrutierung mit In-vivo-Infektionsmodellen 22,29,30durchzuführen.
Dieser Artikel zeigt die verschiedenen Schritte, die für die erfolgreiche Etablierung dieses reproduzierbaren Modells erforderlich sind, um pathogene induzierte neutrophile transepitheliale Migration zu erforschen. Lungenepithelbarrieren, die mit dem Erreger Pseudomonas aeruginosa infiziert sind, sind in diesem Artikel enthalten; andere Gewebeepithelien und Krankheitserreger können jedoch durch geringfügige Modifikationen ersetzt werden. Die Aussaat und Kultivierung polarisierter Lungenepithelzellschichten auf invertierten kollagenbeschichteten durchlässigen Transwellfiltern wird hierin detailliert beschrieben, ebenso wie das Wachstum der pathogenen P. aeruginosa und die Isolierung von Neutrophilen aus Vollblut. Wie diese Komponenten kombiniert werden, um pathogeninduzierte neutrophile transepitheliale Migration zu beobachten, wird zusammen mit geeigneten positiven und negativen Kontrollen vorgestellt, um einen reproduzierbaren Assay zu etablieren. Die Vielseitigkeit dieses Ansatzes zur Untersuchung verschiedener Aspekte der pathogenen induzierten neutrophilen transepitheliale Migration wird unter Bezugnahme auf spezifische Studien in der Literatur diskutiert.

<table><tbody><tr><td>NCl-H292 Zellen</td><td>ATCC</td><td>CRL-1848</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 Medium</td><td>ATCC</td><td>30-2001</td><td></td></tr><tr><td>Pseudomonas aeruginosa PAO1</td><td>ATCC</td><td>#47085</td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli MC1000</td><td>ATCC</td><td>#39531</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS (1x) flüssig</td><td>Invitrogen</td><td>14190-144</td><td>ohne Calcium und Magnesium</td></tr><tr><td>Hitze Inaktiviertes fötales Rinderserum</td><td>Invitrogen</td><td>10082-147</td><td>10% dem Kulturmedium zugesetzt</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td>100x: 10.000 Einheiten Penicillin und 10.000 &; Mikro; g Streptomycin pro ml.</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0,05%)</td><td>Invitrogen</td><td>25300-062</td><td>50 ml Aliquots werden gefroren bei -20 °C gelagert.&nbsp; Aliquot in Gebrauch kann bei 4 &ordm; C kurzfristig.&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Hank's Balanced Salt Solution - HBSS(-)</td><td>Invitrogen</td><td>14175-079</td><td>Steril, ohne Calcium und Magnesium</td></tr><tr><td>Trypanblaue Lösung</td><td>Invitrogen</td><td>15250-061.</td><td>Aktie = 0,4 %</td></tr><tr><td>Kollagen, Rattenschwanz</td><td>Invitrogen</td><td>A10483-01</td><td>Kann auch im Labor direkt aus den Schwänzen von Ratten unter Verwendung von Standardprotokollen isoliert werden</td></tr><tr><td>Zitronensäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1909-500G</td><td>Bestandteil von 1 M Citratpuffer und saurer Citrat Dextrose (ACD) Lösung</td></tr><tr><td>Natriumcitrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4641-500G</td><td>Bestandteil von 1 M Citratpuffer</td></tr><tr><td>Dextrose wasserfrei</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8066-250G</td><td>Bestandteil der Lösung von saurer Citratdextrose (ACD)</td></tr><tr><td>Ammoniumchlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>213330-500G</td><td>Bestandteil des Lysepuffers der roten Blutkörperchen (RBC)</td></tr><tr><td>Natriumbicarbonat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6014-500G</td><td>Bestandteil des Lysepuffers der roten Blutkörperchen (RBC)</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>ED-100G</td><td>Bestandteil des Lysepuffers der roten Blutkörperchen (RBC)</td></tr><tr><td>HBSS(+)-Pulver</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1387-10L</td><td>Schlüsselkomponente von HBSS+</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375-500G</td><td>Komponente von HBSS+</td></tr><tr><td>Sigmacote</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SL2-25ML</td><td>Befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers, um Pipettenspitzen aus Glas zu beschichten</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-9284</td><td></td></tr><tr><td>2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonsäure) Diammoniumsalz (ABTS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9941-50TAB</td><td>Schlüsselkomponente der ABTS-Substratlösung</td></tr><tr><td>30%ige Wasserstoffperoxidlösung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1009-100ML</td><td>Bestandteil der ABTS-Substratlösung</td></tr><tr><td>N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLP oder fMLF)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F-3506</td><td>Es sollte eine Stammlösung von 10 mM in DMSO hergestellt und die Aliquote bei -20 μC gelagert werden.</td></tr><tr><td>Gelatine Typ B</td><td>Fisher Scientific</td><td>M-12026</td><td></td></tr><tr><td>Pseudomonas-Isolationsagar</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0927-17-1</td><td>Hersteller folgen Anleitung zur Herstellung von PIA-Platten</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>45-001-749</td><td>Optional, kann die Reinheit von Neutrophilen verbessern</td></tr><tr><td>24-Well-Migrationsplatte Corning</td><td>Incorporated</td><td>#3524</td><td></td></tr><tr><td>24-Well-Waschplatte</td><td>Falcon</td><td>35-1147</td><td>Kann wiederverwendet werden, wenn sie in 70% Ethanol eingeweicht und vor der Wiederverwendung gründlich gewaschen</td></tr> wird <tr><td>96-Well-Platte</td><td>Fisher Scientific</td><td>#12565501</td><td></td></tr><tr><td>Transwell Permeable Supports&nbsp;</td><td>Corning Incorporated</td><td>#3415</td><td>Polycarbonat; Durchmesser: 6,5 mm; Wuchsfläche: 0,33 cm2; Gericht: 24-Well-Platte; Porengröße: 3,0 & Mikro; m</td></tr><tr><td>Petrischale</td><td>Falcon</td><td>35-1013</td><td>Jede Petrischale fasst 24 umgedrehte 0,33 cm2 Transwells.&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>500 ml 0,2 &mu; m Filter / Kolben</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-740-25A</td><td>Zur Sterilisation von saurer Citrat-Dextrose-Lösung (ACD)</td></tr><tr><td>5-3/4 in Glas Pasteur-Pipette</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20A</td><td>Spitzen vor dem Gebrauch mit Sigmacote beschichten</td></tr><tr><td>Hämostat</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-812-14</td><td>Gebogenes, gezacktes</td></tr><tr><td>Invertoskop Inverses Mikroskop</td><td>Zeiss</td><td>#342222</td><td></td></tr><tr><td>Versa-Max Mikroplatten-Reader</td><td>für molekulare Geräte</td><td>#432789</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro coculture assay zur bewertung pathogeninduzierter neutrophiler transepithelmigration

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

Schleimhautoberflächen dienen als Schutzbarrieren gegen pathogene Organismen. Angeborene Immunantworten werden bei der Erfassung von Krankheitserregern aktiviert, die zur Infiltration von Geweben mit wandernden Entzündungszellen führen, in erster Linie Neutrophilen. Dieser Prozess hat das Potenzial, gewebezerstörend zu sein, wenn er übermäßig ist oder in einem ungelösten Zustand gehalten wird.  Cokultivierte In-vitro-Modelle können verwendet werden, um die einzigartigen molekularen Mechanismen zu untersuchen, die an pathogenerinduzierter neutrophiler transepitheliale Migration beteiligt sind. Diese Art von Modell bietet Vielseitigkeit im experimentellen Design mit der Möglichkeit für die kontrollierte Manipulation des Erregers, Epithelbarriere, oder Neutrophil. Die pathogene Infektion der apikalen Oberfläche polarisierter Epithelmonolayer, die auf durchlässigen Transwellfiltern angebaut werden, löst physiologisch relevante basolaterale zu apikale transepitheliale Migration von Neutrophilen aus, die auf die basolaterale Oberfläche aufgetragen werden. Das hier beschriebene In-vitro-Modell zeigt die verschiedenen Schritte, die zum Nachweis der neutrophilen Migration über eine polarisierte Lungenepithelmonoschicht erforderlich sind, die mit der pathogenen P. aeruginosa (PAO1) infiziert ist. Die Aussaat und Kultivierung durchlässiger Transwells mit menschlichen Lungenepithelzellen wird beschrieben, zusammen mit der Isolierung von Neutrophilen aus ganzem menschlichen Blut und der Kultivierung von PAO1 und nichtpathogenem K12 E. coli (MC1000).  Der Emigrationsprozess und die quantitative Analyse erfolgreich migrierter Neutrophilen, die als Reaktion auf pathogene Infektionen mobilisiert wurden, werden mit repräsentativen Daten, einschließlich positiver und negativer Kontrollen, dargestellt. Dieses In-vitro-Modellsystem kann manipuliert und auf andere Schleimhautoberflächen aufgebracht werden. Entzündungsreaktionen, die eine übermäßige neutrophile Infiltration beinhalten, können zerstörerisch für Wirtsgewebe sein und können ohne pathogene Infektionen auftreten. Ein besseres Verständnis der molekularen Mechanismen, die die neutrophile transepitheliale Migration durch experimentelle Manipulation des hier beschriebenen In-vitro-Kokultur-Assay-Systems fördern, hat ein erhebliches Potenzial, neue therapeutische Ziele für eine Reihe von mukosalen infektiösen sowie entzündlichen Erkrankungen zu identifizieren.

Mehrere Studien haben gezeigt, dass pathogeninfizierte Epithelschichten die neutrophile transepitheliale Migration erleichtern3,8,19,24-28,31,32. Dies geschieht über eine pathogen-spezifische Induktion eines epitheliaalzellabgeleiteten neutrophilen chemotaktischen Gradienten3,23. Zum Beispiel bewirkt die pathogene P. aeruginosa, die mit der apikalen Oberfläche von Lungenepithelzellen interagiert, dass eine beträchtliche Anzahl von Neutrophilen über die Epithelschicht18,22,25,26,33,34</...

Neutrophile transepitheliale Migration als Reaktion auf eine mukosasale bakterielle Infektion trägt zu Epithelverletzungen und klinischen Erkrankungen bei. Es wurde ein In-vitro-Modell entwickelt, das Erreger, menschliche Neutrophile und polarisierte menschliche Epithelzellschichten kombiniert, die auf Transwell-Filtern angebaut werden, um Untersuchungen zur Entwirrung der molekularen Mechanismen zu erleichtern, die dieses Phänomen orchestrieren.

In vitro Coculture Assay zur Bewertung pathogeninduzierter Neutrophiler Transepithelmigration

Mucosal surfaces serve as protective barriers against pathogenic organisms.&#160;Innate immune responses are activated upon sensing pathogen leading to ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, die Anzahl der Neutrophilen zu bestimmen, die als Reaktion auf eine Infektion eine Epithelzell-Monoschicht durchquert haben. Dies wird erreicht, indem transwells kollagenkodierend werden, bevor epitheliale Zellmonoschichten mit dem invertierten Transwell-Filtermanöver sorgfältig kultiviert werden. In einem zweiten Schritt wird ein bakterieller Krankheitserreger kultiviert, um die apikale Oberfläche der auf den Transwell-Filtern gewachsenen Epithelmonoschicht zu infizieren, wodurch die Epithelzellen endogene neutrophile Chemolockstoffe produzieren.Als nächstes werden aus Vollblut isolierte Neutrophile auf die basolaterale Seite der infizierten epithelialen Monoschichten gegeben, die auf Transwell-Filtern gezüchtet wurden, um die Migration von Neutrophilen von der basolateralen zur apikalen Seite zu testen. Es werden Ergebnisse erzielt, die einen signifikanten Anstieg der Anzahl von transepithelial migrierenden Neutrophilen zeigen, die als Reaktion auf infizierte epitheliale Monoschichten beobachtet wurden, basierend auf der Quantifizierung der Myeloperoxidase aus migrierten Neutrophilen. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da das invertierte Transwell-Filter-Manöver zur Züchtung und Infektion von Epithelbarrieren unkonventionell ist und daher für unbekannte Forschungsgruppen in ihrem Labor weniger zugänglich sein kann.Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die Therapie von entzündlichen Erkrankungen der Atemwege mit Infektionen wie Lungenentzündung oder Mukoviszidose, da neuartige Behandlungen entwickelt und getestet werden können, um die Menge der neutrophilen trans-epithelialen Migration zu verringern, was die schädlichen Auswirkungen einer übereifrigen neutrophilen Verletzung der Schleimhautbarrieren abschwächen kann. Neben Mark, der als klinischer Mitarbeiter in meinem Labor tätig ist, werden der leitende Techniker Wahi Preza und der Postdoktorand Michael Pesos das Verfahren demonstrieren. Um mit der Entnahme einer Wachstumsfläche von 0,33 Quadratzentimetern zu beginnen, wird eine Transwells mit einer Porengröße von drei Mikrometern aus der Verpackung genommen und die 24-Well-Platte mit 12 Transwells kopfüber in die Haube gelegt.Heben Sie die Bodenplatte ab und legen Sie sie beiseite. Transwells stehen nun auf dem Kopf. Auf dem Deckel der 24-Well-Plattenflamme ruht ein Hämostatikum für Sterilität und lässt es abkühlen.Unter Verwendung des sterilen Hämostatentransfers werden in eine 150 x 25 Millimeter große Petrischale verlagert und in der umgekehrten Position 70 Mikroliter einer vorbereiteten Kollagenlösung von 30 Mikrogramm pro Milliliter in Ethanol auf die Filtermembran jeder invertierten Transwell-Oberfläche pipettiert. Die Spannung sollte dieses Lösungsvolumen an Ort und Stelle halten, da sich beim Zugang zur Oberfläche der Unterseite keine Wände um die Filtermembran herum befinden. Achten Sie darauf, dass die Kollagenlösung nicht an der Seite des Transwells heruntertropft, und vermeiden Sie es, die Transwells während des Beschichtungsvorgangs zu bewegen. Lassen Sie den Deckel der Petrischale mindestens vier Stunden lang abgenommen, damit das Ethanol verdampfen kann. Um die Sterilität während dieses Prozesses zu erhalten.Lassen Sie den Haubenlüfter und das ultraviolette Licht nach dem Verpacken der Epithelzellen eingeschaltet, wie im Textprotokoll beschrieben. Geben Sie 70 Mikroliter der Resus-Schwebzellenlösung aus einem 15-Milliliter-Röhrchen in jedes mit invertiertem Kollagen beschichtete Transwell. Mischen Sie die Zellsuspension, indem Sie das Röhrchen regelmäßig vorsichtig umdrehen, um zu verhindern, dass sich Zellen während der Aussaat der Transwells am Boden des 15-Milliliter-Röhrchens absetzen.Sobald alle umgedrehten Transwells mit Epithelzellen besiedelt sind, setzen Sie den Deckel der Petrischale wieder auf und legen Sie die Zellen am nächsten Tag vorsichtig in den Gewebekultur-Inkubator. Geben Sie einen Milliliter Medium in jede Vertiefung der ursprünglichen sterilen 24-Well-Platte und verwenden Sie einen sterilisierten Hämostaten, um jede invertierte Trans-Vertiefung in jede Vertiefung zu stecken, die einen Milliliter Medium enthält. 0,2 Milliliter des Mediums werden in die obere Kammer jeder Trans-Vertiefung gegeben und in den Gewebekultur-Inkubator zurückgeführt.Entfernen Sie die 24-Well-Platte, die Epithelschichten stützt und mindestens acht Tage lang auf der Unterseite der Transwell-Filtermembranen kultiviert wurde, aus dem Inkubator. Fassen Sie den Rand jedes Trans-Wells mit einem Hämostaten an und heben Sie es aus der 24-Well-Platte. Drehen Sie den Transwell über einen Abfalleimer, um Nährmedien aus der Innenkammer des Transwells zu entsorgen.Tauchen Sie jeden Transwell in ein Waschbecherglas, das Hank's ausgewogene Salzlösung mit Calcium und Magnesium oder Hank's Plus enthält, um die Innenkammer des Transwells zu füllen. Entsorgen Sie dann die Flüssigkeit aus der Innenkammer in einen Abfalleimer. Wiederholen Sie diesen Schritt für eine Sekunde.Nach zwei Wäschen in Hank's plus waschen. Legen Sie die Transwells in eine neue 24-Well-Platte, die einen Milliliter Hank's Plus enthält. Beobachten Sie in jeder Vertiefung die obere Kammer jedes Transwells, um die Integrität der Epithelzellschicht zu beurteilen.Hank's Plus sollte nicht in die obere Kammer des Transwells auslaufen und diese füllen, wenn es in die Vertiefung einer 24-Well-Platte mit einem Milliliter Hank's Plus gelegt wird. Nachdem Sie jeden Transwell sorgfältig beobachtet haben, geben Sie 0,2 Milliliter Hanks Plus in die obere Kammer. Legen Sie die Platte für 30 bis 60 Minuten in den Inkubator, um die Epithelzellschichten zu äquilibrieren und den transepithelialen Migrationsassay für Neutrophile durchzuführen.Fassen Sie jedes Transwell mit einem Blutstillungsmittel aus der 24-Well-Platte der Wash Transwells, die in Hank's Plus äquilibriert sind, und entsorgen Sie die Flüssigkeit in der oberen Vertiefung in einen Abfalleimer. Platzieren Sie jeden Transwell kopfüber in einer 150 x 25 Millimeter großen Petrischale zu sechs der umgedrehten Transwells. Fügen Sie 25 Mikroliter Hanks plus zu drei der umgedrehten Transwells hinzu.Infizieren Sie die Zellen mit 25 Mikrolitern Pseudomonas, Arosa oder Pao, die in Hanks plus verdünnt sind, wie im Textprotokoll beschrieben, um die letzten drei invertierten Transwells zu infizieren, infizieren Sie die Zellen mit 25 Mikrolitern e Coli, K 12 oder mc 1000, verdünnt in Hanks Plus, ebenfalls wie im Textprotokoll beschrieben, nach Inkubation bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid in einer befeuchteten Kammer für 60 Minuten. Waschen Sie die Transwells, indem Sie sie mit einem Blutstiller greifen und wieder in eine 24-Well-Waschplatte drehen, die einen Milliliter Hank's Plus enthält. In den unteren Kammern.Geben Sie 0,2 Milliliter Hank's Plus in die oberen Kammern. Fassen Sie den Transwell mit einem Blutstiller an und nehmen Sie ihn von der ersten Waschplatte. Entsorgen Sie die Flüssigkeit aus der oberen Kammer in einen Abfalleimer.Bevor Sie die Transwells in eine zweite 24-Well-Waschplatte mit einem Milliliter Hanks plus legen, geben Sie 0,2 Milliliter Hanks plus in die obere Kammer. Wiederholen Sie diesen Schritt noch einmal für insgesamt drei Wäschen. Nach dem dritten Waschen wird die Flüssigkeit aus den oberen Kammern der Trans-Vertiefungen mit einem Hämostat in einen Abfalleimer gegeben. Drei der nicht infizierten Trans-Vertiefungen werden in drei Vertiefungen der 24-Well-Migrationsplatte mit einem Milliliter Hanks Plus platziert, die die Negativkontrollpipette darstellt. 10 Mikroliter einer 10-mikromolaren Lösung von FMLP in jede der drei Vertiefungen der 24-Well-Migrationsplatte mit einem Milliliter Hanks Platzieren Sie außerdem drei der nicht infizierten trans-Wells in drei Vertiefungen der 24-Well-Migrationsplatte, die 100 Nanomolare FMLP enthält, was eine positive Kontrolle für die Fähigkeit isolierter Neutrophilen zur Migration darstellt.Platzieren Sie dann die drei mit PAO infizierten Trans-Wells eins und die drei mit mc 1000 infizierten Trans-Wells in drei entsprechende Vertiefungen der 24-Well-Migrationsplatte, die einen Milliliter Hanks enthalten, plus fügen Sie 0,1 Milliliter Hanks plus in die obere Kammer jeder Trans-Vertiefung auf die 0,1 Milliliter Hanks plus in jeder trans hinzu. Nun, fügen Sie vorsichtig 20 Mikroliter der neutrophilen Suspension hinzu, die wie im Textprotokoll beschrieben hergestellt wurde. Zwei Stunden inkubieren, um die transepitheliale Migration der Neutrophilen zu ermöglichen.Heben Sie nach zwei Stunden Migration die Transwells an, indem Sie sie mit einem Blutstiller greifen und vorsichtig gegen die Innenwände der 24-Well-Migrationsplatte klopfen. Bevor Sie die Trans-Vertiefungen verwerfen, beurteilen Sie die Migration von Neutrophilen in den Vertiefungen grob, indem Sie die Vertiefungen der 24-Well-Migrationsplatte unter einem inversen Mikroskop mit dem 10-fach-Objektiv betrachten. Fügen Sie dann 50 Mikroliter 10 % Triton X 100 zu jeder Vertiefung hinzu, die in der 24-Well-Migrationsplatte, jedem Standard und dem Rohling verwendet wird.Drehen Sie die 24-Well-Migrationsplattenstandards und blanken Sie 20 Minuten lang bei niedriger Geschwindigkeit. Bei vier Grad Celsius. Fügen Sie 50 Mikroliter Citratpuffer hinzu.Jeweils zwei Vertiefungen, die in der 24-Well-Migrationsplatte zu jedem Standard und zum Rohling gründlich verwendet werden. Mischen Sie den Inhalt in jeder Probenvertiefung, indem Sie die Lösung mindestens fünfmal auf und ab pipettieren. Übertragen Sie dann 100 Mikroliter jeder Probenvertiefung in doppelter Ausführung auf eine 96-Well-Platte, 100 Mikroliter jedes Standards und den Rohling auf die 96-Well-Platte.Nach dem Mischen 50 Mikroliter 30%iges Wasserstoffperoxid zur A BTS-Lösung geben und vortexen. Geben Sie dann 100 Mikroliter A BTS-Substratlösung zu jeder Probe. Lassen Sie die Platte auf der 96-Well-Platte fünf bis 10 Minuten im Dunkeln entwickeln.Beobachten Sie die Entwicklung der grünen Farbe in den Vertiefungen der Platte, die Lyse-Neutrophile enthalten, bevor Sie bei einer Wellenlänge von 405 Nanometern ablesen. Mit einem Mikroplatten-Reader zur Beurteilung der transepithelialen Migration von Neutrophilen können Neutrophile, die vollständig über die Epithelschicht in die apikale Kammer gewandert sind, in der unteren Vertiefung der 24-Well-Migrationsplatte betrachtet werden, wie hier mit einem inversen Lichtmikroskop dargestellt. Es wurde beobachtet, dass nur sehr wenige Neutrophile durch eine nicht infizierte Epithelschicht ohne auferlegten chemotaktischen Gradienten wandern und Hintergrundwerte im Assay darstellen.Im Gegensatz dazu zeigte sich eine Häufigkeit von transmi-Neutrophilen, wenn ein FMLP-Gradient bereitgestellt wurde. Die Infektion des Epithels mit nicht-pathogenen e coli mc 1000 führte zu wenigen sichtbaren transmigrierten Neutrophilen, während viele transmigrierte Neutrophile bei einer Infektion der Epithelschichten mit dem lungenpathogenen Pseudomonas aerogen zu beobachten waren. Die Neutrophilen, die im Experiment migriert sind, werden durch Messung ihrer Myeloperoxidase-Aktivität quantifiziert.Die Anzahl der Neutrophilen korreliert positiv mit der Menge der Peroxidaseaktivität, die nach der Lyse von Neutrophilen gemessen wird, wobei die Werte eine lineare Beziehung in dem für die Standardkurve ausgewählten Bereich der Neutrophilenzahlen aufweisen. Eine signifikante Anzahl von Neutrophilen wandert durch Epithelschichten als Reaktion auf den von A bereitgestellten FMLP-Gradienten oder als Reaktion auf eine mit PAO one infizierte Epithelschicht. Die Anzahl der Neutrophilen, die ohne Stimuli oder nach apikaler Epithelinfektion mit nicht-pathogenen e e coli mc 1000 migrieren, liegt unter der Nachweisgrenze für den Assay.Sobald diese Technik gemeistert ist, kann sie in fünf Stunden für die Kollagenbeschichtung und Aussaat der Epithelzellen auf den Transwell-Filtern durchgeführt werden, gefolgt von mindestens einer Woche, damit die Epithelzellen wachsen können. Sobald die epithelialen Monoschichten fertig sind. Der Migrationsassay kann in fünf Stunden durchgeführt werden, einschließlich der Isolierung von Neutrophilen und der Aufbereitung von Bakterien, wenn er ordnungsgemäß durchgeführt wird.Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, die Transwell-Filter unter sterilen Bedingungen vorzubereiten, um eine Kontamination zu vermeiden. Dieses Verfahren kann angepasst werden, um zusätzliche Fragen im Zusammenhang mit diesem Entzündungsprozess zu beantworten. Es kann eine Analyse der migrierten Zellen, des Epithels, des Rückenbodens oder auch des Erregers durchgeführt werden.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

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