Erkennung von Live- Escherichia coli O157: H7-Zellen durch PMA-qPCR

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist die Entwicklung eines A-Q-P-C-R-Assays, der für den selektiven Nachweis von lebenden e coli oh 1 57 H sieben Zellen verwendet werden kann. Der offene Leserahmen Z 32 76 wurde als einzigartiger genetischer Marker identifiziert, der in einem Q PCR R-Assay verwendet werden kann, der sensitiv und spezifisch für e coli oh 1 57 H sieben nach der Präparation von lebenden und toten Zellgemischen ist. Sie werden mit Propidiummonosäure oder PMA-Bewegung inkubiert, wodurch PMA in die toten Zellen gelangen kann, aber nicht in die lebenden Zellen.

Als nächstes wird die DNA extrahiert und die QPCR an den behandelten und unbehandelten lebenden und toten Zellen durchgeführt. Es werden Ergebnisse erhalten, die zeigen, dass die PMA-Behandlung DNA effizient aus toten Zellen entfernt und im Wesentlichen die Amplifikation von DNA aus lebenden Zellen nicht beeinflusst, was zum spezifischen Nachweis von lebenden e coli oh 1 5 7 H sieben Zellen führt. Der Hauptvorteil dieser Technik, unserer bestehenden Methoden, wie z.B. der verfügbare QPCR-Assay zum Nachweis von e coli oh 1 5 7 H seven, besteht darin, dass dieses Protokoll für den selektiven Nachweis von lebenden e coli oh one seven H seven Zellen verwendet werden kann. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich des Nachweises von Food-Boy-Krankheitserregern zu beantworten, wie z. B. die Überschätzung der DNA lebender Zellen in Proben.

Die Implikationen dieser Technik können sich auf den Nachweis anderer Krankheitserreger und die Verwendung von Z 32 76 als eindeutigem genetischen Marker für e coli, O 1 57, erstrecken. H seven verleiht dem Assay eine hohe Sensitivität und Spezifität und das Potenzial für Multiplex-Assays. Züchten Sie 10 Milliliter e coli oh 1 5 7 H sieben bei 37 Grad Celsius bis zur mittleren exponentiellen Phase und teilen Sie die Kultur in zwei Aliquots auf.

Kochen Sie ein Aliquot der Zellen 10 Minuten lang in einem Wasserbad für tote Zellen und lassen Sie das andere Aliquot für lebende Zellen. Stellen Sie sicher, dass keine lebenden Zellen aus dem durch Hitze abgetöteten Aliquot vorhanden sind, indem Sie die Zellen auf LB-APLs plattieren und über Nacht bei 37 Grad Celsius inkubieren. Nehmen Sie in der Zwischenzeit zwei Milliliter der Lebend- und Wärmekiltzellen und stellen Sie die Konzentration auf 8 Millionen KBE pro Milliliter mit LB-Medium ein. Erstellen Sie vier Sätze lebender Zellverdünnung im Bereich von acht KBE pro Milliliter bis 8 Millionen KBE pro Milliliter für die ersten beiden Sätze der Zellverdünnungsmarkierung.

Eine als lebende Zellen, die mit PMA behandelt wurde, und die andere als unbehandelte lebende Kontrollprobe für den dritten und vierten Satz von Zelldilu. Fügen Sie jeder Zellverdünnung 8 Millionen tote Zellen hinzu, um Mischungen aus lebenden und toten Zellen herzustellen. Der dritte Satz Dilu wird mit PMA behandelt, und der vierte Satz Dilu dient als unbehandelte Mischungskontrolle bei aliquot 400 Mikrolitern der lebenden Zellen, der toten Zellen und der Mischung aus lebenden und toten Zellen.

In drei getrennten Mikroröhrchen werden in jeder Zelle zwei Mikroliter einer 10 μmolaren Stammlösung PMA zugegeben, aliquotiert auf eine Endkonzentration von 50 μmolaren Molekülen. Inkubieren Sie die Proben während der Inkubation fünf Minuten lang bei Umgebungstemperatur im Dunkeln. Schütteln Sie jede Tube ein paar Mal vorsichtig, jeweils drei Sekunden.

Geben Sie anschließend 100 Mikroliter der Proben in eine 96-Well-Platte, versiegeln Sie die Platte mit einer optischen Folie und legen Sie die Platte auf Eis. Setzen Sie die Platte 20 Zentimeter von einer 650 Watt starken Halogenlichtquelle entfernt auf und setzen Sie die Platte zwei Minuten lang dem Licht aus. Zentrifugieren Sie dann die Platte nach dem Zentrifugieren 10 Minuten lang bei 2.500 Käsesorten, entsorgen Sie die Schlinge vorsichtig und lassen Sie die Platte vorsichtig auf einem Blatt absorbierendem Papier abtropfen.

Suspendieren Sie die Zellpellets wieder in 50 Mikrolitern DNA-Extraktionslösung, indem Sie 20 Mal mit einem Mehrkanal-Pipettierer auf und ab pipettieren, die Platte mit einem Film versiegeln und 10 Minuten lang in einem Wasserbad kochen, bevor Sie zwei Minuten lang bei 2.500 g zentrifourieren. Der Überstand in der Platte ist die DNA von Zellen, die mit PMA behandelt wurden und für die QPCR bereit sind. Bereiten Sie die QPCR-Reaktionsgemische vor, indem Sie zwei x real-time PCR-Master kombinieren.

Mischen Sie den Vorwärtsprimer und den Rückwärtsprimer und die Sonde. Weitere Informationen zum Design von Primer und Sonde finden Sie im Textprotokoll. Übertragen Sie dann das QPCR-Reaktionsgemisch in einzelne Wells einer neuen 96-Well-Platte.

Für jede der behandelten und unbehandelten lebenden und toten Zellen werden fünf Mikroliter Proben-DNA und ein entsprechendes Volumen Wasser hinzugefügt, um ein Endvolumen von 50 Mikrolitern zu erreichen. Verwenden Sie für die Nicht-Template-Kontrolle fünf Mikroliter Wasser, um die DNA-Probe zu ersetzen. Stellen Sie als Nächstes die QPCR-Bedingungen auf 95 Grad Celsius für 10 Minuten für die Aktivierung des TAC-Mannes ein, gefolgt von 40 Zyklen mit 95 Grad Celsius für 10 Sekunden für die Denaturierung und 60 Grad Celsius.

Führen Sie eine Minute lang eine kniende Streckung mit der QPCR an den behandelten und unbehandelten lebenden und toten Zellen fort. Die Auswirkungen der PMA-vermittelten Hemmung der Amplifikation von DNA aus toten Zellen auf diesen QPCR-Assay werden hier anhand von DNA gezeigt, die aus lebenden oder toten Zellverdünnungen gewonnen wurde. Die Ergebnisse zeigten, dass die Kurven, die aus den lebenden Zellen erzeugt wurden, die mit und ohne PMA behandelt wurden, linear und nahezu identisch miteinander schienen.

Es zeigten sich geringfügige Unterschiede im Schwellenzyklus oder CT-Wert zwischen den lebenden Zellen, die mit PMA und ohne PMA behandelt wurden, was darauf hindeutet, dass die PMA-Behandlung nur einen geringen Einfluss auf die Amplifikation der DNA der lebenden Zellen in der QPCR hatte. Umgekehrt zeigte sich ein Unterschied von 15 CT-Werten zwischen den toten Zellen, die mit PMA und ohne PMA behandelt wurden, was zeigt, dass die PMA-Behandlung die DNA-Amplifikation aus den toten Zellen effizient unterdrückte. Zwei Sätze von lebenden Zellverdünnungen wurden mit PMA oder ohne PMA behandelt, um lebende Zellen aus lebenden toten Zellmischungen nachzuweisen.

Die QPCR-Ergebnisse zeigten einen parallelen inversen progressiven Trend der CT-Werte in Bezug auf die Anzahl der behandelten lebenden Zellen im Vergleich zu den unbehandelten Proben. Die behandelten lebenden Zellen zeigten etwas höhere CT-Werte als die unbehandelten lebenden Zellen. Ein ähnlicher umgekehrter progressiver Trend bei den CT-Werten wurde bei der tatsächlichen Anzahl lebender Zellen in den mit PMA behandelten lebenden toten Zellmischungen beobachtet.

Darüber hinaus wurde dieser Abwärtstrend der CT-Werte bei der Anzahl der lebenden Zellen in den Mischungen trotz des Vorhandenseins von einer Million toter Zellen beobachtet. Diese Ergebnisse zeigten, dass die CT-Werte der lebenden toten Zellmischungen nur die DNA der lebenden Zellen darstellten und dass die DNA-Amplifikation aus den toten Zellen durch die PMA-Behandlung nach der Beherrschung effizient unterdrückt wurde. Diese Technik kann in zwei Stunden durchgeführt werden, wenn sie sehr gut ausgeführt wird.

Bei diesem Verfahren ist es wichtig, eine gute Lichteinstrahlung für die mit PM behandelten Proben zu gewährleisten, um sicherzustellen, dass die PME-Behandlung gründlich ist und gleichzeitig die lebende Zelle in den Proben nach diesem Verfahren geschützt wird. Andere Methoden, wie z. B. QPCR-Assays, können als regulärer Real-Time-PCR-Assay durchgeführt werden.