Name: Elektrophysiologische Aufnahme im Gehirn von erwachsenen Zebrafisch Intact (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-19T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 42 s
Description: Lernen Sie die elektrophysiologische Aufnahme neuronaler Aktivität im Gehirn intakter erwachsener Zebrafische. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Hirnfunktionen und neuronalen Schaltkreisen in vivo.

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Diese Arbeit wurde vom NIH / NINDS Zuschuss R01NS070159 (TMD, JDL und ATS) unterstützt.

Alle Experimente wurden in strikter Übereinstimmung mit den National Institutes of Health Guide für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt und folgte Protokoll # A2011 09-003, die überprüft wurde, genehmigt und von der Universität von Georgia Institutional Animal Care und Verwenden überwacht Ausschusses. 1. Geräte-Setup <ol><li> Perfusion System zur Kraniotomie Immobilisierung des Erwachsenen erfordert eine Intubation System gelösten Sauerstoff, um die Fische zu liefern. Eine Vielzahl von Systemen verwendet werden können, aber eine einfache Schwerkraftsystem, bestehend aus einer 60 ml Spritze verwendet. Erhöhen Sie die Druckhöhe bis zu einer Höhe, die konsequent eine Durchflussrate von ca. 1 ml / min liefert. Diese Spritze kann in Reihe mit den Spritzen, die dann für die elektro Perfusionssystem verwendet, angeordnet werden. <ol><li> Besorgen Sie sich eine einzelne 60 ml Luer-Lock-Spritze Rohr entfernen und den Kolben. </li><li> Hängen Sie die Spritze in ca. 8 &amp;# 160; oberhalb der Basis einer Ringständer mit einer Schelle. </li><li> Verbinden eines Ein-Wege-Hahn an das Ende der Spritze. Zum gegenüberliegenden Ende des Absperrventils, schließen ein Stück Schlauch, 2 mm im Durchmesser, die lang genug ist, um zu der Basis erstrecken Intubation ist. </li></ol></li><li> Perfusion System für die Elektrophysiologie Für elektrophysiologischen Experimenten ist es oft notwendig, eine Vielzahl von Verbindungen im Verlauf eines Experiments vor. Eine Vielzahl von Systemen zur Verfügung, aber ein Schwerkraftsystem, bestehend aus 60 ml Spritzen in Reihe verwendet werden. Dieser Aufbau ermöglicht eine einfache, Serien Einführung von Lösungen, um durch Öffnen des entsprechenden Hahn durchgeführt werden. <ol><li> Erhalten zwei oder mehr 60 ml Luer-Lock-Spritzen und entfernen Sie die Kolben von jedem. Eine Spritze erforderlich ist, um Lebensraum Wasser, um die Fische zu verabreichen, während jede nachfolgende Rohr kann eine Vielzahl von pharmakologischen Verbindungen, die dem Fisch zu verabreichen. </li><li> Schließen Sie jede Spritze zu einer 3 -Wege-Hahn mit einem Luer-Anschluss. </li><li> Verwenden ⅛ Außendurchmesser (OD) Schlauch, um die Spritzen in Reihe mit einem männlichen Luer-Lock an einem Ende zu verbinden. </li><li> Die Fixierung des Gerätes, so daß die Druckhöhe auf eine Höhe von 27 oberhalb der Basis oder einer Höhe, die durchweg eine Strömungsrate von ca. 1 ml / min ergibt erhöht. </li></ol></li><li> Intubationskanüle Die Intubationskanüle erleichtert die Einführung von Fluid zu dem Fisch. Dieses Setup bietet sowohl Flexibilität und Festigkeit auf beste Position die Kanüle in das Maul des Tieres. <ol><li> Die Verwendung eines allgemeinen Schere (zB. Fiskars) oder eine Rasierklinge, entfernen Sie einen 1,5 cm Ausschnitt aus dem breiten Ende eines P-200 Pipettenspitze. </li><li> Legen Sie eine 6 cm x 1 mm Schlauchstück in ein Regelventil mit einem weiblichen Luer-Lock-Deckel und Silikonhülse, dh eine Tuohy Borst Adapter, und legen Sie diese Kanüle in die modifizierte Pipettenspitze. Halten Sie die Pipettenspitze in Position mit dem Luer lock mit einem kurzen Abschnitt in ⅛ Rohrdurchmesser. <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51065/51065fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51065/51065fig1.jpg" /> Figur 1 </li></ol></li><li> Intubation Basis Diese Schale wird verwendet, um den immobilisierten Tier in einer stabilen, aufrechten Position zu halten und die Entfernung der Eingabe des Tieres durch Intubation Flüssigkeit zu erleichtern. Wenn dies nicht korrekt eingerichtet ist, kann Pooling auftreten, was zu aufdringlich Schwingungssignale in der elektrophysiologischen Aufzeichnung. <ol><li> Erhalten Sie die Basis Gericht aus einer 100 mm x 15 mm Petrischale aus Kunststoff. </li><li> Verwendung eines Werkzeuges, Schmelz ein Loch mit 6 mm Durchmesser und 7,5 mm unterhalb der Lippe der Felge, an der Seite der Schale. Mit dem gleichen Werkzeug, schmelzen Sie ein Loch, 10 mm Durchmesser und 11 mm unter dem Rand der Schale ~ 74 ° gegen den Uhrzeigersinn von der<html> kleinere Loch. Dieses Loch wird als Drainageloch zu dienen. </li><li> Ein Rohr, 1 cm im Durchmesser, in die Bohrung mit dem Ende angehoben, so dass das Ende nicht blockiert werden. Dann legen Sie eine P-200 pipetteman Spitze in das kleine Loch, das wird als Dummy-Kanüle dienen. </li><li> Mit der Petrischale auf der Seite des größeren Loch leicht erhöht, gießen geschmolzene Konserven Wachs in die Schale, so dass die Kanüle Loch gerade bedeckt ist. Der Bereich wird als ein Anschlag dienen, um die Kanüle bis 3 mm in das Maul des Fisches eingeführt werden. Dieses Set up sollte erstarren werden. </li><li> Mit einem flamm erhitzt Metallkante, schnitzen einen Kanal, um die Fische zu halten, so dass der Kanal beginnt von der Spitze der Kanüle und erstreckt sich etwa 1-2 in. <ol><li> Sorgfalt muß darauf geachtet werden, dass eine kontinuierliche nach unten gerichteten Winkel von dem Kanülenfläche der Drainageöffnung gebildet ist.065fig2.jpg &quot;width =&quot; 400px &quot;/&gt; Figur 2 </li></ol></li></ol></li><li> Perfusion Setup <ol><li> Bevor Sie beginnen, spülen Sie die Perfusion Set-ups mit Lebensraum Wasser, sicherzustellen, dass alle Luftblasen entfernt werden. </li><li> In ~ 30 ml von 0,016% (630 uM) Tricaine Lösung des Schädelblutung vornehmen und ~ 2 ml durch Schläuche laufen, um sicherzustellen, dass Tricaine wird dem Tier auf Perfusion Einleitung geliefert werden. Siehe Schritt 2.2 zur Verdünnung. </li><li> Zur Haupt Perfusion Setups fügen ~ 50 ml des Lebensraums Wasser in die erste Röhre. Füge alle gewünschten experimentellen Verbindungen zu jedem der restlichen Rohre. </li><li> Legen Sie die Setup-Kanüle in das kleine Loch der Intubation Basis. </li><li> Drehen Sie eine 1 in breiten Streifen von 42 cm Kimwipe in einer engen Spirale und legen Sie sie in das Drainagerohr, so dass die Kimwipe erstreckt sich an beiden Enden. Dieses Gewebe wird als Docht dienen dazu, die Flüssigkeit durchströmt zu entfernen und Flüssigkeitsansammlungen innerhalb von t verhinderner Intubation Basis, die mit elektrophysiologischen Aufzeichnung stören könnten. </li><li> Stecken Sie ein Ende des Schlauches in das große Loch der Petrischale, so dass das untere Ende in einem inerten Gericht, das groß genug ist, um alle Perfusion Abfälle sammeln verlängern. Dieses Gericht wird als Abfluss Vorratsbehälter für das Setup zu dienen. Positionieren Sie das Gewebe, so dass ein Ende wird in der Nähe von Bauchbereich des Tieres liegen und die untere Erweiterung kann in die Schüssel tropft. </li><li> Legen Sie diese abgeschlossen Intubation Basis in der Nähe des Binokular. Schließen Sie das Luer-Lock der Kanüle in die Tricaine Infusionsschlauch. </li></ol></li><li> Kapillar-Nadel und Elektroden <ol><li> Besorgen Sie sich eine Primärelektrode bestehend aus 2,5 in von 0,010 in Silberdraht und einer Sekundärelektrode, die sich aus 15 in der gleichen Draht sollte, um das Setup geschliffen werden. Für die Sekundärelektrode, verwenden Sie eine 15 im Schnitt 0,010 in Silberdraht mit einem aufgelöteten Spitze, die es ermöglicht zu passenim Hinterkopf-Bühne. <ol><li> Galvanisieren die Spitzen sowohl der Primär-und Sekundärsilberdrähten mit Chloridionen. </li><li> Mit einer Mikropipette Puller, ziehen eine dünnwandige, Borosilikatglas Kapillarnadel mit einem Widerstand von &lt;15 mOhm. <ol><li> Füllen Sie den Kapillarnadel mit 2-3 ul 2 M Kaliumchlorid, oder genug, um teilweise decken die Chlorid-beschichtete Spitze des Silberdraht. </li><li> Legen Sie die Primärelektrode in die Kapillare Kopf und bringen Sie es in den Elektrodenhalter. </li><li> Montieren Sie die Kopf-Bühne in einen Mikromanipulator und montieren dann die Sekundärelektrode in einen zweiten Mikromanipulator. Mit dem Setup, erste Position jeder Elektrode und passen dann die gelötet Spitze der Sekundärelektrode in die Rückseite der Kopf Bühne. </li></ol></li></ol></li></ol></li></ol> 2. Herstellung von Lösungen, Perfusion-System und Elektrophysiologische Aufnahmegerät <ol><li> Erhalten 1 L Lebensraum Wasservon Aquarium Fische. </li><li> 0,016% T] Tricainmethansulfonat (Tricaine) (50 ml 630 uM) 24. <ol><li> Tauwetter ein Aliquot von 0,4% Tris-gepufferte Tricaine, pH 7,2. </li><li> In 2,1 ml 0,4% Tris-gepufferte Tricaine auf 47,9 ml des Lebensraums Wasser und mischen. </li></ol></li><li> Auftauen Lager Konzentration der gewünschten wasserlöslichen experimentelle Verbindung (zB 300 mM Pentylentetrazol eine gemeinsame chemoconvulsant). </li><li> Tauen Sie eine aliquote Menge von 1 ug / ul Pancuroniumbromid in Ringer-Lösung. </li><li> Füllen Sie sowohl betäubende und experimentellen Intubation Systeme mit Lebensraum Wasser und Abfluss zumindest genug, um alle Luftblasen aus den Rohren zu entfernen. Dies muß getan werden, weil Luftblasen behindern Fluidstrom, was zum Ersticken des Tieres. <ol><li> Vollständig entleeren Sie die Rohre, die Durchblutung Medikamente ohne dass Luft in den Verbindungsschlauch halten wird. </li><li> Füllen Sie die betäubende Rohr mit 0,016% (630 uM) Tricaine-Lösung und stellen Sie keine expermentelle Verbindung (en) in zusätzliche Röhre (n) auf experimentellen Perfusionssystem. <ol><li> Das erste Rohr von Versuchsdurchblutung sollte nur Lebensraum Wasser enthalten. </li></ol></li></ol></li><li> Befeuchten Sie die kleinen Porenschwamm mit Wasser und Lebensraum in einem leeren 60 mm x 15 mm Petrischale. Dieser Teller verwendet werden, um die Fische zu halten, während das Anästhetikum injiziert. </li></ol> 3. Craniotomy <ol><li> Genug von der 630 uM Lösung Tricaine In den 15 x 60 mm Petrischale, um es etwa drei Viertel des Weges zu füllen. Wiegen Sie den gefüllten Teller. Diese werden verwendet, um das Tier zu immobilisieren, so daß weitere Narkose intraperitoneal injiziert werden. </li><li> Tauchen Sie das Tier in der Schale mit Tricaine und wiegen das Gericht wieder. <ol><li> Subtrahieren der Differenz zwischen den Gewichten der Schritte 1 und 2, um das Gewicht des Fisches zu erhalten. </li><li> Lassen Sie das Tier in der Tricaine Lösung, bis Ruhe und die meisten Bewegung aufgehört hat, zu bleiben. </li></ol></li><li> Mit einem Paar von breiten Pinzette, übertragen Sie die Fische auf die vorbefeuchtetes Schwamm und positionieren Sie es seitlich. Übertragen Sie den Fisch am Schwanz funktioniert gut für diesen Prozess. <ol><li> Legen Sie den Schwamm und Fisch unter dem Binokular. </li></ol></li><li> Mit einer Spritze, die Nanofil eine 34-G-Nadel, messen Sie genug Pancuroniumbromid, so dass es 1 ug / g Fischgewicht. </li><li> Mit einem Eis am Stiel-Stick an der dorsalen Seite der Fische, um sie ruhig zu halten, die Verwaltung der Pancuroniumbromid intraperitoneal mit der Nanofil Spritze. </li><li> Mit den feinen Pinzette, schnappen die Fische durch den Unterkiefer und schnell zu übertragen, das Tier an die Intubation Basis. </li><li> Die Position des Tieres, so daß es Rücken-up auf der Wachsform und dass der 1 mm-Kanüle in den Mund eingeführt werden. Mit den feinen Pinzette, um die Fische zu manövrieren und öffnen Sie den Mund um die Kanüle. Aufgrund der Zusammensetzung der Schale Intubation wurde ein Anschlag in den Sockel konstruiert, so dass dieKanüle bis 3 mm in das Maul des Fisches eingeführt werden. <ol><li> Einmal in Position, schalten Sie die Schwerkraft gespeiste Perfusionsschlauch Tricaine enthält. </li></ol></li><li> Schneiden Sie ein 3 cm 2 Abschnitt Kimqipe Gewebe und nass ist es mit Lebensraum Wasser. <ol><li> Legen Sie das Gewebe über das Tier, um ein Austrocknen zu verhindern. Die Kimwipe Abschnitt kann auch angeordnet werden, um das Halten des Tieres Rücken-up helfen. </li></ol></li><li> Unter dem Dissektionsmikroskop verwenden vanna Frühjahr Schere auf ~ 2 mm 2 Abschnitt des Schädels für den Tectum opticum entfernen. Dieser Bereich sieht aus wie ein dunkles, Knochenplatte, die hinter dem Auge sitzt. <img alt="Fig. 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51065/51065fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51065/51065fig3.jpg" width="400px" /> Fig. 3 <ol><li> Legen Sie ein Blatt der vanna Schere am Rand der Platte und schieben mit genug Kraft, um Eindringente die Knochen, ohne Durchstechen des Gehirns. Schließen Sie die Schere, um die Knochen schnippeln. </li><li> Entfernen Sie das Knochenstück. </li><li> Falls Blut vorhanden ist, entfernen Sie mit dem Rand eines Kimwipe. Blutungen in der Regel stoppt kurz nach Durchführung der Kraniotomie. </li></ol></li></ol> 4. Elektrophysiologie <ol><li> Schalten Sie die Intubation Hahn und schnell trennen Sie das Luer-Lock-Anschluss der Basis bis zur Intubation Tricaine Tropf. <ol><li> Bewegen Sie die intakte Intubation Setup auf die Elektrophysiologie Mikroskop und eine Verbindung zu dem Perfusionssystem. </li><li> Schalten Sie den Lebensraum Wasser und durchströmen mit einer Geschwindigkeit von 1 ml / min für ca. 1 Stunde, um zum Auswaschen der Tricaine. </li></ol></li><li> Mit einem Mikromanipulator unter Sichtkontrolle, positionieren Sie den Sekundärelektrode, so dass die Elektrodenspitze kann in das Tier Nasenloch oder in das Tauch hinter dem Oberkiefer eingesetzt werden. </li><li> Legen Sie die Primärelektrode Nadel in die Schädelöffnung. Legen Sie dieNadel in das Gewebe, so dass die Spitze ziemlich oberflächlich innerhalb der optischen Tectum positioniert. <ol><li> Wenn die Elektrode zu tief ist, kann das elektrische Signal klein sein. </li></ol></li><li> Sammeln und zu analysieren, die elektrische Unterschied zwischen der primären und sekundären Referenzelektroden aufgezeichnet. Dieser Prozess wird für extrazelluläre Aufnahmen erzielen lässt. <ol><li> Sammeln der Daten in Gap-freien Modus bei einer Abtastrate von 5 kHz, mit einem Tiefpassfilter von 0,1 kHz und einem Hochpassfilter von 1 Hz ist. </li><li> Sie Aufnahme elektrophysiologische Aktivität, bis Lebensraum Wasser für mindestens 45 min durchströmt nicht beginnen. </li><li> Aufzeichnen einer Grundlinie des nativen Aktivität für mindestens 15 min vor der Zugabe von experimentellen Arzneimitteln. Beginnen Perfusion mit experimentellen Mittel der Wahl und Aufnahme für die gewünschte Menge an Zeit. Bei gesunden Zubereitungen ist es möglich, die neurologische Aktivität 2-3 Stunden aufzuzeichnen. </li></ol></li></ol> 5. Aufräumen </p&gt; <ol><li> Am Ende des Experiments, entfernen Sie die Elektroden aus dem Schädel und Nasenloch und entfernen Sie die Intubation-Setup. <ol><li> Euthanize das Tier durch Drogen-Überdosis mit Tricaine in Übereinstimmung mit den anerkannten Verfahren, wie von der American Veterinary Medical Association (AVMA) Richtlinien für die Euthanasie von Tieren (2013) beschrieben. </li><li> Zebrafisch eingeschläfert werden sollte in einem Tricaine Lösung bei 200-500 mg / L. platziert werden Fische sind in der Lösung für ein Minimum von 10 Minuten nach Beendigung der rhythmischen Aktivität Kiemendeckel, nach der sie an ein physikalisches Mittel der Euthanasie (zervikale Trennung) unterzogen, um sicherzustellen, Tod überlassen werden. </li></ol></li><li> Trennen Sie das Luer-Lock-Anschluss der Intubation Basis, um die Perfusion-Setup. Sammeln Sie die restliche Flüssigkeit im Perfusionssystem zur Entsorgung. <ol><li> Führen DI-Wasser durch alle Rohre und sammeln zur Entsorgung, wenn gefährliche. </li></ol></li><li> Um die Durchblutung System desinfizieren, run 70% Ethanol durch alle Rohre und sammeln zur Entsorgung. <ol><li> Lassen Sie die Absperrhähne für jede Röhre in der offenen Position, um Luft das Trocknen zu erleichtern. </li><li> Weichen Sie die Elektroden, die in 70% Ethanol und an der Luft trocknen. </li></ol></li><li> Entsorgen Sie die Kapillarnadel für die primäre Elektrode in einem Behälter für scharfe Gegenstände verwendet. </li><li> Demontieren Sie die Setup-Intubation und spülen Sie alle Teile mit Wasser. <ol><li> Reinigen Sie jedes Stück mit 70% Ethanol und an der Luft trocknen. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Henze, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+features+predicted+by+extracellular+recordings+in+the+hippocampus+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Intracellular features predicted by extracellular recordings in the hippocampus in vivo.</a> J. Neurophysiol. 84, 390-400 (2000).</li>
<li>Gabriel, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Locomotor+pattern+in+the+adult+zebrafish+spinal+cord+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Locomotor pattern in the adult zebrafish spinal cord in vitro.</a> J.Neurophysiol. 99, 37-48 (2008).</li>
<li>Vargas, R., Johannesdottir, I. T., Sigurgeirsson, B., Thornorsteinsson, H., Karlsson, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+brain+in+research+and+teaching%3A+a+simple+in+vivo+and+in+vitro+model+for+the+study+of+spontaneous+neural+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Physiol+Educ%22%5BJournal%5D)">The zebrafish brain in research and teaching: a simple in vivo and in vitro model for the study of spontaneous neural activity.</a> Adv Physiol Educ. 35, 188-196 (2011).</li>
<li>Makhankov, Y. V., Rinner, O., Neuhauss, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+inexpensive+device+for+non-invasive+electroretinography+in+small+aquatic+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">An inexpensive device for non-invasive electroretinography in small aquatic vertebrates.</a> J. Neurosci. Methods. 135, 205-210 (2004).</li>
<li>Brockerhoff, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+behavioral+screen+for+isolating+zebrafish+mutants+with+visual+system+defects%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A.%22%5BJournal%5D)">A behavioral screen for isolating zebrafish mutants with visual system defects.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.. 92, 10545-10549 (1995).</li>
<li>Baraban, S. C., Taylor, M. R., Castro, P. A., Baier, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pentylenetetrazole+induced+changes+in+zebrafish+behavior%2C+neural+activity+and+c-fos+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Pentylenetetrazole induced changes in zebrafish behavior, neural activity and c-fos expression.</a> Neuroscience. 131, 759-768 (2005).</li>
<li>Baraban, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+large-scale+mutagenesis+screen+to+identify+seizure-resistant+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Epilepsia%22%5BJournal%5D)">A large-scale mutagenesis screen to identify seizure-resistant zebrafish.</a> Epilepsia. 48, 1151-1157 (2007).</li>
<li>Maximino, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMaximino%2C+C+%22Serotonin+and+anxiety%3A+Neuroanatomical%2C+pharmacological+and+functional+aspects%22">Serotonin and anxiety: Neuroanatomical, pharmacological and functional aspects</a>. , Springer. New York. (2012).</li>
<li>Bally-Cuif, L., Vernier, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBally-Cuif%2C+L+%22Fish+Physiology%3A+Zebrafish%22">Fish Physiology: Zebrafish</a>. Perry, S. F., Ekker, M., Farrell, A. P., Brauner, C. J. 29, (2010).</li>
<li>Kaslin, J., Nystedt, J. M., Ostergard, M., Peitsaro, N., Panula, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+orexin%2Fhypocretin+system+in+zebrafish+is+connected+to+the+aminergic+and+cholinergic+systems%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The orexin/hypocretin system in zebrafish is connected to the aminergic and cholinergic systems.</a> J. Neurosci. 24, 2678-2689 (2004).</li>
<li>McLean, D. L., Fetcho, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ontogeny+and+innervation+patterns+of+dopaminergic%2C+noradrenergic%2C+and+serotonergic+neurons+in+larval+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Ontogeny and innervation patterns of dopaminergic, noradrenergic, and serotonergic neurons in larval zebrafish.</a> J. Comp. Neurol. 480, 38-56 (2004).</li>
<li>Mueller, T., Vernier, P., Wullimann, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+adult+central+nervous+cholinergic+system+of+a+neurogenetic+model+animal%2C+the+zebrafish+Danio+rerio%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">The adult central nervous cholinergic system of a neurogenetic model animal, the zebrafish Danio rerio.</a> Brain Res. 1011, 156-169 (2004).</li>
<li>Higashijima, S., Schaefer, M., Fetcho, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotransmitter+properties+of+spinal+interneurons+in+embryonic+and+larval+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Neurotransmitter properties of spinal interneurons in embryonic and larval zebrafish.</a> J. Comp. Neurol. 480, 19-37 (1002).</li>
<li>Tao, L., Lauderdale, J. D., Sornborger, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+Functional+Connectivity+between+Neuronal+Ensembles+with+Larval+Zebrafish+Transgenic+for+a+Ratiometric+Calcium+Indicator%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">Mapping Functional Connectivity between Neuronal Ensembles with Larval Zebrafish Transgenic for a Ratiometric Calcium Indicator.</a> Front Neural Circuits. 5, 2(2011).</li>
<li>Fan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+statistical+methods+enhance+imaging+of+cameleon+fluorescence+resonance+energy+transfer+in+cultured+zebrafish+spinal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Opt%22%5BJournal%5D)">New statistical methods enhance imaging of cameleon fluorescence resonance energy transfer in cultured zebrafish spinal neurons.</a> J Biomed Opt. 12, 034017(2007).</li>
<li>Burgess, H. A., Granato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensorimotor+gating+in+larval+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Sensorimotor gating in larval zebrafish.</a> J. Neurosci. 27, 4984-4994 (2007).</li>
<li>Burgess, H. A., Schoch, H., Granato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+retinal+pathways+drive+spatial+orientation+behaviors+in+zebrafish+navigation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Distinct retinal pathways drive spatial orientation behaviors in zebrafish navigation.</a> Curr. Biol. 20, 381-386 (2010).</li>
<li>Mueller, K. P., Neuhauss, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+neurobiology%3A+how+larval+fish+orient+towards+the+light%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Behavioral neurobiology: how larval fish orient towards the light.</a> Curr. Biol. 20, 159-161 (2010).</li>
<li>Haug, M. F., Biehlmaier, O., Mueller, K. P., Neuhauss, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visual+acuity+in+larval+zebrafish%3A+behavior+and+histology%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Zool%22%5BJournal%5D)">Visual acuity in larval zebrafish: behavior and histology.</a> Front. Zool. 7, 8(2010).</li>
<li>Fetcho, J. R., Higashijima, S., McLean, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+and+motor+control+over+the+last+decade%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res.Rev%22%5BJournal%5D)">Zebrafish and motor control over the last decade.</a> Brain Res.Rev. 57, 86-93 (2008).</li>
<li>Connaughton, V. P., Nelson, R., Bender, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+evidence+of+GABAA+and+GABAC+receptors+on+zebrafish+retinal+bipolar+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Vis.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological evidence of GABAA and GABAC receptors on zebrafish retinal bipolar cells.</a> Vis. Neurosci. 25, 139-153 (2008).</li>
<li>Kim, Y. J., Nam, R. H., Yoo, Y. M., Lee, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+functional+evidence+of+GABAergic+neurons+in+parts+of+the+brain+of+adult+zebrafish+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Lett%22%5BJournal%5D)">Identification and functional evidence of GABAergic neurons in parts of the brain of adult zebrafish (Danio rerio).</a> Neurosci. Lett. 355, 29-32 (2004).</li>
<li>Sato, Y., Miyasaka, N., Yoshihara, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hierarchical+regulation+of+odorant+receptor+gene+choice+and+subsequent+axonal+projection+of+olfactory+sensory+neurons+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Hierarchical regulation of odorant receptor gene choice and subsequent axonal projection of olfactory sensory neurons in zebrafish.</a> J. Neurosci. 27, 1606-1615 (2007).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+zebrafish+book%3A+a+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+%28Brachydanio+rerio%29%22">The zebrafish book: a guide for the laboratory use of zebrafish (Brachydanio rerio)</a>. , (1993).</li>
<li>Lazarova, M., Samanin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potentiation+by+yohimbine+of+pentylenetetrazol-induced+seizures+in+rats%3A+role+of+alpha+2+adrenergic+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Potentiation by yohimbine of pentylenetetrazol-induced seizures in rats: role of alpha 2 adrenergic receptors.</a> Pharmacol. Res. Commun. 15, 419-425 (1983).</li>
<li>Loscher, W., Honack, D., Fassbender, C. P., Nolting, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+technical%2C+biological+and+pharmacological+factors+in+the+laboratory+evaluation+of+anticonvulsant+drugs.+III.+Pentylenetetrazole+seizure+models%5BTitle%5D)+AND+%22Epilepsy+res%22%5BJournal%5D)">The role of technical, biological and pharmacological factors in the laboratory evaluation of anticonvulsant drugs. III. Pentylenetetrazole seizure models.</a> Epilepsy res. 8, 171-189 (1991).</li>
<li>DeMicco, A., Cooper, K. R., Richardson, J. R., White, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+neurotoxicity+of+pyrethroid+insecticides+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Sci%22%5BJournal%5D)">Developmental neurotoxicity of pyrethroid insecticides in zebrafish embryos.</a> Toxicol Sci. 113, 177-186 (2010).</li>
<li>Arnolds, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+effects+of+tricaine+on+the+supramedullary%2Fdorsal+neurons+of+the+cunner%2C+Tautogolabrus+adspersus%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Bull%22%5BJournal%5D)">Physiological effects of tricaine on the supramedullary/dorsal neurons of the cunner, Tautogolabrus adspersus.</a> Biol. Bull. 203, 188-189 (2002).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Dieses Protokoll wurde verwendet, um die neuronale Aktivität von erwachsenen Zebrafisch in vivo zu messen. Mit etwas Übung können neuronale Aktivität konsequent eingehalten werden, obwohl die Eigenschaften (Amplitude und Form der Ereignisse) der aufgezeichneten Aktivität kann zwischen einzelnen Fische variieren. Nutzung der extrazellulären Aufnahmetechnik kann diese Beobachtung erklären. Das Verfahren ermöglicht die gleichzeitige Überwachung einer Vielzahl von Zellen in einem Bereich 1, so dass Varia...

In diesem Artikel wird ein Protokoll für den Erhalt von In-vivo-Aufnahmen von neuronalen Aktivität bei erwachsenen Zebrafischen beschrieben. Extrazelluläre Aufzeichnungsverfahren verwendet werden, wodurch Spannungsmessungen der elektrischen Aktivität in einem kleinen Bereich des Nervengewebes. Diese Untersuchungsmethode beinhaltet die Überwachung einer großen Anzahl von Zellen in einem Tier 1 verhalten. Bisher haben die Scheibe Aufnahmen bei Erwachsenen und Larven durchgeführt wurde, wie Augenmuschel Präparate und Elektroretinogramm Aufnahmen haben. Diese Versuche sind weitgehend zum Detail durchgeführt wurde physiologischen Reaktionen der verschiedenen Sinnessysteme 5.2. Bis vor kurzem haben intakten Zubereitungen erst seit Durchführung der Elektrophysiologie mit Zebrafisch-Larve 3,6,7, wobei Atmung und die Sauerstoffdiffusion durch die Haut auftreten verfügbar. Unsere Vorbereitung ermöglicht die native neurologische Aktivität eines erwachsenen Zebrafisch zu messen, während das Tier noch bei vollem Bewusstsein und bewusst of seine Umgebung. Zebrafisch (Danio rerio) spielen derzeit eine grundlegende Rolle als Modell für genetische, toxikologische, pharmakologische und pathophysiologische Studien 3. Zebrafische haben die Sichtbarkeit auf dem Gebiet der Neurowissenschaften gewonnen, weil sie Aktien weitgehende Homologie Säugetieren an den genetischen, neuronalen und endokrinen Ebenen 8. In den vergangenen zehn Jahren haben sich Standard-neuroanatomische und immunhistochemischen Techniken verwendet, um die detaillierten Kenn Organisation des Zebrafisch-Nervensystem 9-12 und der Verteilung der unterschiedlichen Neurotransmitter 3,8,13 bestimmen. In jüngster Zeit haben Forscher ihren Fokus auf Funktionsstudien 14,15, von denen viele zentrieren Verhaltensprozesse 16-19 und elektrophysiologische Eigenschaften von sensorischen Systemen 2,13,20 verschoben. Eine kleine Anzahl dieser Studien haben sich auf die elektrische Aktivität des speziellen Bereichen des adul engtt Zebrafischgehirn 21-23, wurden aber nicht mit einem in-vivo-Ansatz durchgeführt. Dieses Protokoll kann für elektrophysiologische Studien sowohl spontane und evozierte Aktivität innerhalb des Zebrafisch-Nervensystem, um die Muster der Aktivität in bestimmten Hirnregionen beschreiben angepasst werden. Die Anwendung dieser Technik ermöglicht Vergleiche zwischen der neurologischen Aktivität junge Larvenstadien und Erwachsenen erfolgen. Außerdem ermöglicht unser Protokoll Vergleiche zwischen genetischen oder pharmakologische Veränderungen. Zusammen mit anderen Ansätzen, wie der Gentechnik oder pharmakologischen Tests bietet dieses Verfahren eine neue Möglichkeit für die funktionelle Analyse von neuronalen Kommunikation und Plastizität im intakten adulten Tier als auch für potentielle Anwendungen, wie z. B. das Studium späten Beginn Epilepsie oder neurodegenerativen Prozessen.

<table><tbody><tr><td>70 % Ethanol</td><td>Decon Laboratories</td><td>2750HC</td><td>100 % bis 70 % mit DI-Wasser verdünnen</td></tr><tr><td>2 M Kaliumchlorid</td><td>J.T. Baker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 M Natriumchlorid</td><td>J.T. Baker</td><td>3624-05</td><td></td></tr><tr><td>0,4 % Tris-gepuffertes Tricain</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td>pH 7,2-7,4; gelagert bei -20 oC</td></tr><tr><td>Pancuroniumbromid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1918</td><td>Verdünnt auf 1 μ; g/&mu; l in 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung</td></tr><tr><td>Lebensraumwasser</td><td></td><td></td><td>pH 7,0-7,4, Leitfähigkeit von 400-450 &mu; S; gehalten von Instant Ocean und Natriumbicarbonat</td></tr><tr><td>Pentylentetrazol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6500</td><td>Verdünnt auf 300 mM in 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung</td></tr><tr><td>Nanofil</td><td>Spritze World Precision Instruments, Inc.</td><td>06A</td><td></td></tr><tr><td>34 G Abgeschrägte Nadel</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>NF34BV</td><td></td></tr><tr><td>Schwamm</td><td></td><td></td><td>Kleinporiges und chemikalienfreies</td></tr><tr><td>feines Sandpapier</td><td></td><td></td> mit Schaumstoffrücken<td>, 5 x 5 cm2 ist groß genug</td></tr><tr><td>9 V Batteriekabel</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>mit Krokodilklemmen</td><td></td><td></td><td>Benötigen 2</td></tr><tr><td>37 cm x 42 cm Kimwipe</td><td>Kimberly-Clark Professional</td><td>TW31KEM</td><td></td></tr><tr><td>11 cm x 21 cm Kimwipe</td><td>Kimberly-Clark Professional</td><td>TW31KWP</td><td></td></tr><tr><td>1/8 Zoll Durchmesser Rohr</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td>mit<td>1 cm Durchmesser</td></tr> Rohr <tr><td>mit 1 mm</td> Durchmesser <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Reduzierventil mit weiblicher Luer-Lock-Kappe und Silikonzwinge</td><td>Qosina</td><td>51505</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop (Leica MZ APO)</td><td></td><td></td><td>Ein weiteres Mikroskop kann gebrauchte</td></tr><tr><td>Vanna Schere</td><td>Roboz Surgical Instruments Co., Inc.</td><td>15018-10</td><td></td></tr><tr><td>60 ml Luer-Lock-Spritzenröhrchen</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>309653</td><td></td></tr><tr><td>3-Wege-Absperrhähne mit Luer-Anschlüssen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1-Wege-Absperrhahn mit Luer-Anschluss</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand 100 mm x 15 mm Petrischale Fisher</td><td>Scientific</td><td>NC9299146</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand 60 mm x 15 mm Petrischale</td><td>Fisher Scientific</td><td>S67961</td><td></td></tr><tr><td>4 in Borosilikat-Kapillarrohr</td><td>World Precision Instruments</td><td>TW100F-4</td><td>Kann ein Filament enthalten, um das Befüllen mit Lösung</td></tr><tr><td>zu erleichtern P-97 Flammen/Braune Mikropipette Abzieher</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Digidata 1440</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axon Aloclamp 900A</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axoclamp Software</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HS-9Ax 1U Kopfstufe</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,010 in Silberdraht</td><td>A-M Systems, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Elektrodenhalter der Q-Serie</td><td>Warner</td><td>Instruments QSW-A10P</td><td></td></tr><tr><td>10 ml Luer-Lock-Spritze</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 mm x 15 Zoll Schlauch</td><td></td><td></td><td>Verbinden Sie die Luer-Lock-Spritze mit dem Elektrodenhalter der Q-Serie</td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td><td>Warner Instruments</td><td></td><td>benötigt 2</td></tr><tr><td>Microsoft-basierte PCs</td><td>Dell</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Faraday </td><td></td><td></td><td></td></tr> Käfig-Lufttisch-Präpariermikroskop <tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

elektrophysiologische aufnahme im gehirn von erwachsenen zebrafisch intact

Electrophysiological Recording in the Brain of Intact Adult Zebrafish

Zuvor elektrophysiologische Studien bei erwachsenen Zebrafisch sind begrenzt worden, um die Vorbereitungen oder Augenmuschel Präparate und electrorentinogram Aufnahmen zu schneiden. Dieses Papier beschreibt, wie ein erwachsenen Zebrafisch immobilisiert werden können, intubiert und für in vivo elektrophysiologischen Experimenten verwendet, so dass die Aufnahme der neuronalen Aktivität. Immobilisierung des Erwachsenen erfordert einen Mechanismus, um gelösten Sauerstoff zu den Kiemen statt der Mund-und Kiemendeckel Bewegung zu liefern. Mit unserer Technik werden die Tiere immobilisiert und mit Lebensraum Wasser durchströmt, um diese Anforderung zu erfüllen. Ein Kraniotomie unter Tricainmethansulfonat geführt (MS-222; Tricaine) Anästhesie Zugang zum Gehirn zu liefern. Die Primärelektrode wird dann innerhalb der Kraniotomie Fenster positioniert ist, um extrazelluläre Aktivität des Gehirns erfassen. Durch die Verwendung eines Viel Perfusionssystem kann eine Vielzahl von pharmakologischen Verbindungen, die dem erwachsenen Fisch und jede Änderung in der neuralen Aktivität, verabreicht werdenbeobachtet werden. Die Methodik ermöglicht nicht nur Erklärungen zu den Veränderungen der neurologischen Aktivität gemacht werden, aber es ermöglicht auch Vergleiche zwischen Larven-und erwachsenen Zebrafisch hergestellt werden. Dies gibt Forscher die Möglichkeit, die Veränderungen in der neurologischen Aktivität aufgrund der Einführung der verschiedenen Verbindungen in verschiedenen Lebensstadien zu identifizieren.

Dieses Protokoll wurde verwendet, um die neuronale Aktivität von erwachsenen Zebrafisch in vivo zu messen. Diese elektrophysiologischen Ableitungen sind konsequent und reproduzierbar erhalten. Abbildung 5 zeigt ein repräsentatives Beispiel von nativen und induzierte Veränderungen der neuronalen Aktivität eines erwachsenen Zebrafisch, wenn Pentylentetrazol (PTZ), eine gemeinsame chemoconvulsant 6,7,25,26, ist in der Intubation eingeführt Setup. Die native ...

Dieses Papier beschreibt, wie ein erwachsenen Zebrafisch immobilisiert werden können, intubiert und für in vivo elektrophysiologischen Experimenten verwendet, um Aufnahmen und Manipulation der neuronalen Aktivität in einem intakten Tier zu ermöglichen.

Elektrophysiologische Aufnahme im Gehirn von erwachsenen Zebrafisch Intact

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram ...

Das allgemeine Ziel dieses Verfahrens besteht darin, In-vivo-Aufzeichnungen neuronaler Aktivität im Gehirn intakter erwachsener Zebrafische zu erhalten. Dies wird erreicht, indem zunächst ein erwachsener Zebrafisch durch Badapplikation von Tricainmethansulfonat immobilisiert wird. Der zweite Schritt besteht darin, den immobilisierten Zebrafisch zu intubieren.Anschließend wird unter Trika-Anästhesie eine Kraniotomie durchgeführt, um Zugang zum Gehirn zu erhalten. Der letzte Schritt besteht darin, eine Primärelektrode innerhalb des Kraniotomiefensters zu positionieren, wodurch die Aufzeichnung extrazellulärer Gehirnaktivität ermöglicht wird. Letztendlich in vivo.Die Elektrophysiologie beim adulten Zebrafisch kann verwendet werden, um zu zeigen, wie unterschiedliche pharmakologische Substanzen oder genetische Mutationen zu Veränderungen in der nativen neurologischen Aktivität des Zebrafischs führen können. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen sowohl in der Entwicklungsbiologie als auch in der Neurobiologie zu beantworten, beispielsweise wie Veränderungen in der Gehirnstruktur Auswirkungen auf die neuronale Aktivität haben, sowohl während der normalen Entwicklung als auch im Fall einer genetischen Mutation. Im Allgemeinen haben Personen, die neu in dieser Technik sind, Schwierigkeiten, da besondere Sorgfalt darauf verwendet werden muss, nur einen kleinen Teil der knöchernen Platte, die den Kopf bedeckt, zu entfernen, ohne das Gehirngewebe zu beschädigen.Die Intubationskanüle erleichtert die Einführung von Flüssigkeit in den Fisch. Diese Vorrichtung bietet sowohl Flexibilität als auch Festigkeit, um die Kanüle optimal im Maul des Tieres zu positionieren. Entfernen Sie für diese Vorrichtung einen 1,5 cm langen Abschnitt vom breiten Ende einer P-200-Pipettenspitze mit einer Schere oder einem Rasiermesser. Als Nächstes ein sechs Zentimeter mal einen Millimeter großes Stück Schlauch in ein Reduzierventil einführen. Dann die modifizierte Pipettenspitze in einen kurzen Abschnitt eines Schlauchs mit einem Durchmesser von einem Achtel Zoll einführen. Die Kanüle kann anschließend unter Verwendung des Schlauchs, der die Pipettenspitze in Position mit dem Luer-Lock hält, in die Pipettenspitze eingeführt werden.Vor dem Experiment wurde die Perfusionsanordnung mit Habitatwasser durchgespült, um sicherzustellen, dass alle Luftblasen entfernt wurden. Anschließend fügen Sie 30 Milliliter einer 630 Mikromolar Trica-Lösung der Kraniotomie-Perfusionsanordnung hinzu und lassen zwei Milliliter durch die Schläuche laufen, um sicherzustellen, dass Trica beim Beginn der Perfusion zum Tier gelangt. Für die Hauptperfusion fügen Sie 50 Milliliter Habitatwasser in das erste Gefäß hinzu.Fügen Sie anschließend die gewünschten experimentellen Verbindungen zu jedem der verbleibenden Reaktionsgefäße hinzu. Danach bringen Sie eine Kanülenanordnung in das kleine Loch der Intubationsbasis ein, drehen einen etwa einen Zoll breiten Streifen Kim-Wipe zu einer engen Spirale und führen ihn in das Drainageröhrchen ein, sodass der Kim-Wipe an beiden Enden herausragt. Dieses Gewebe dient als Docht, um die perfundierte Flüssigkeit abzuleiten und eine Flüssigkeitsansammlung innerhalb der Intubationsbasis zu verhindern, die die elektrophysiologische Ableitung stören könnte.Als Nächstes wird ein Ende des Schlauchs in das große Loch der Petrischale eingeführt, wobei das untere Ende in eine inerte Schale hineinragen soll, die groß genug ist, um sämtliche Abflussabfälle aufzufangen. Diese Schale dient als Auslaufreservoir für die Versuchsanordnung. Anschließend wird das Gewebe so positioniert, dass sich ein Ende in der Nähe des Bauchbereichs des Tieres befindet und die untere Fortsetzung in die Schale tropfen kann.Stellen Sie diese fertig montierte Intubationsbasis in die Nähe des Dissektionsmikroskops. Anschließend verbinden Sie den Lu-Verschluss der Kanüle mit dem Trican-Perfusionsrohr. Geben Sie in diesem Verfahren Trica-Lösung mit einer Konzentration von 630 Mikromolar in eine 15 mal 60 Millimeter große Petrischale, bis diese zu drei Vierteln gefüllt ist.Als Nächstes wiegen Sie die Wägepfanne. Diese dient dazu, das Tier zu fixieren, damit eine weitere Anästhesie in das Peritoneum injiziert werden kann. Tauchen Sie das Tier nun in die Wägepfanne, die Trica enthält, und wiegen Sie die Pfanne erneut.Berechnen Sie dann das Gewicht des Fisches, indem Sie das Gewicht der gefüllten Schale vom Gesamtgewicht abziehen. Lassen Sie das Tier so lange in der Trica-Lösung, bis es ruhig ist und die meisten Bewegungen aufgehört haben. Während der Fisch in der Trica-Lösung liegt, entnehmen Sie mit einer NFI-Spritze, die eine Nadel mit 34 Gauge enthält, so viel Pantoniumbromid, dass sich ein Mikrogramm pro Gramm Fischgewicht befindet.Sobald der Fisch beruhigt ist, den Fisch mit einer breiten Pinzette am Schwanz nehmen und auf einen vorfeuchten Schwamm legen, wobei er seitlich positioniert wird. Danach den Schwamm mit dem Fisch unter das Stereomikroskop stellen. Die dorsale Seite des Fisches mit einem Holzstäbchen festhalten.Dann verabreichen Sie das Panacur-Bromid intraperitoneal. Verwenden Sie nun feine Pinzette. Fassen Sie den Fisch am Unterkiefer und übertragen Sie das Tier schnell auf die Intubationsunterlage.Platzieren Sie das Tier mit der dorsalen Seite nach oben auf der Wachsform, sodass die ein Millimeter dicke Kanüle in den Mund eingeführt werden kann. Verwenden Sie danach die feine Pinzette, um den Fisch zu positionieren und den Mund um die Kanüle herum zu öffnen. In unserer Versuchsanordnung.Ein Anschlag wurde in die Basis eingebaut, sodass die Kanüle drei Millimeter weit in den Mund des Fisches eingeführt werden kann. Sobald sie in Position ist, schalten Sie das Schwerkraft-perfundierte Perfusionsrohr, das Trica enthält, ein. Schneiden Sie dann einen drei Quadratzentimeter großen Abschnitt Kim-Wipe-Gewebe ab und befeuchten Sie ihn mit Habitatwasser.Legen Sie das Gewebe über das Tier, um Austrocknung zu verhindern. Unter dem Dissektionsmikroskop ist der Fisch präpariert und wartet darauf, dass die Kraniotomie durchgeführt wird. Dieser Bereich sieht aus wie eine dunkle knöcherne Platte, die hinter dem Auge sitzt.Als Nächstes wird eine Klinge der Schere an der Plattenkante angesetzt und mit ausreichender Kraft vorgerückt, um in den Knochen einzudringen, ohne das Gehirn zu verletzen. Anschließend werden die Scheren geschlossen, um den Knochen zu durchtrennen. Danach wird das Knochenstück zur elektrophysiologischen Ableitung entfernt.Schalten Sie die Intubation ab. Schließen Sie den Hahn und trennen Sie schnell die Luer-Lock-Verbindung zwischen der Intubationsbasis und dem Trica-Tropf. Bringen Sie die intakte Intubationsanordnung zum Elektrophysiologie-Mikroskop und schließen Sie sie an das Perfusionsystem an.Schalten Sie den Habitat ein, lassen Sie Wasser durchlaufen und perfundieren Sie mit einer Rate von einem Milliliter pro Minute für etwa eine Stunde. Um das Trica mit einem Mikromanipulator auszuwaschen, positionieren Sie die sekundäre Elektrode so, dass die Elektrodenpitze in die Nasenöffnung des Tieres oder in die Vertiefung unter dem Oberkiefer eingeführt werden kann. Anschließend führen Sie die Nadel der primären Elektrode in die Kraniotomieöffnung ein.Danach die Nadel so in das Gewebe einführen, dass die Spitze ziemlich oberflächlich im optischen Tumor positioniert ist. Tiefere Positionen der Elektrode können zu einem schwachen elektrischen Signal führen. Für die Datensammlung wird der lückenlose Modus mit einer Abtastrate von 5.000 Hertz verwendet, zusammen mit einem Tiefpassfilter von 0,1 Kilohertz und einem Hochpassfilter von einem Hertz. Beginnen Sie die Aufzeichnung der elektrophysiologischen Aktivität, sobald das Habitatwasser mindestens 45 Minuten lang perfundiert hat.Notieren Sie eine Grundlinie der nativen Aktivität für mindestens 15 Minuten vor der Zugabe experimenteller Wirkstoffe. In diesem Experiment wurde die native neuronale Aktivität des adulten Zebrafisches überwacht; diese Abbildung zeigt die spontane Basislinienaktivität des optischen Tums mit einer geringen Amplitude von etwa zwei bis 10 Millivolt über die gesamte Dauer der Aufzeichnung. Nach der Zugabe von 15 Millimolar PTZ zum System begannen innerhalb von fünf Minuten spontane, epilepsieartige Entladungen zu entstehen.Die kontinuierliche Exposition gegenüber PTZ führte zu einem konsistenten Muster von bis zu 15 Millivolt starken, großamplituden Entladungen, gefolgt von kleineren, häufigeren Aktivitätsschüben. Während des Ablaufs dieses Verfahrens ist es wichtig, geduldig zu sein und sich Zeit zu nehmen, wenn das Tier gehandhabt und die Kraniotomie durchgeführt wird. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie eine gute Vorstellung davon haben, wie man in vivo-Aufzeichnungen neuronaler Aktivität im Gehirn eines intakten erwachsenen Zebrafisches erhält.Dies wird erreicht, indem ein Perfusionsystem verwendet und eine Kraniotomie am fixierten Tier durchgeführt wird.

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Forschung

JoVE Journal

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Neurowissenschaften

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