Analyse von oxidativem Stress in Zebrafischembryonen

Hier berichten wir über ein Protokoll zur Messung von oxidativem Stress in lebenden Zebrafischembryonen. Dieses Verfahren ermöglicht den Nachweis von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) sowohl in ganzen Embryogeweben als auch in Einzelzellpopulationen. Mit diesem Protokoll werden sowohl qualitative als auch quantitative Analysen durchgeführt.

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, oxidativen Stress in lebenden Zebrafischembryonen qualitativ und quantitativ zu messen. Dies wird erreicht, indem man den vorbereiteten Embryonen eine oxidative Lösung für die Induktion von oxidativem Stress zugibt oder indem ein Wundrand an der Schwanzflosse des Embryos geschaffen wird. Die Embryonen werden dann für den Nachweis von oxidativem Stress entweder mit einer Einzelzellmethode oder mit einer Whole-Mount-Methode aufbereitet.

Anschließend werden die Präparate mit einer Ross-Detektionssonde inkubiert. Die Ergebnisse können das Ausmaß des oxidativen Stresses und den Ross-Spiegel basierend auf der konfokalen Mikroskopie von Lochhalterungen oder der zytometrischen Fluoro-Analyse einzelner Zellen zeigen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie Immunfluor für Oxystressmarker besteht darin, dass sie den Rohnachweis im Kontext eines lebenden Organismus und die Quantifizierung auf der Ebene einzelner Gewebe ermöglicht.

Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen der Grundlagenforschung zu beantworten, wie z.B. die Erforschung oxidativer Stressbedingungen im Rahmen eines pathologischen Zustands. Personen, die neu in der Aufnahme sind, können aufgrund von versehentlichen Gewebeschäden Schwierigkeiten haben, da die rohen empfindlichen molekularen Sonden eine ungeplante Quelle für Säuregehalt sein können. Und da ein hohes Maß an oxidischem Stress zum Zelltod führen muss, während zu wenig mit Praxis und Experimenten schwer zu erkennen sein kann, werden diese Probleme nur von selbst auftreten. Bei der Herstellung der Lösung zur Induktion von oxidativem Stress in Mitochondrien, die aus in DMSO bekannten Fäulnis bestehen, sollte sie mit bekanntem Fäulnisbestand in einer Konzentration zwischen fünf und 50 Mikromolaren hergestellt werden und niemals mehr als 100 Mikromolare Fäulnis, von der bekannt ist, dass sie giftig und gefährlich ist.

Beachten Sie die gekennzeichneten Vorsichtsmaßnahmen. Die Sondenlösung für die Mount-Ross-Detektion in Löchern sollte während ihrer Herstellung keinem Licht oder Sauerstoff ausgesetzt werden und muss frisch für die einzellige Ross-Detektionsmethode vorbereitet werden. Eine Stopplösung von FBS in PBS muss hergestellt und bei vier Grad Celsius aufbewahrt werden.

Zu den weiteren Vorbereitungen gehört das Einstellen des Zebrafisch-Luftinkubators auf 28 Grad Celsius und für die Einzelzellenmethode das Abkühlen der Zentrifuge auf vier Grad Celsius. Zebrafischkreuzungen, Embryonenentnahme und Anästhesie werden durchgeführt. Mit der Standardmethode werden die interessierenden Embryonen zwischen 48 und 72 Stunden nach der Befruchtung entnommen.

Nach der Betäubung der Embryonen waschen Sie das Anästhetikum zweimal aus und laden Sie die Embryonen dann in drei Schalen mit nicht mehr als 30 pro Schale, um den Einzelzell-Rohnachweis zu ermöglichen. Entnehmen Sie mindestens 35 Embryonen pro Zustand in mehreren Schalen. Tragen Sie anschließend 10 Milliliter Oxidationsmittellösung oder als Negativkontrolle auf.

Tragen Sie 10 Milliliter Wasser auf und warten Sie dann 10 bis 60 Minuten, während die Embryonen bei 28 Grad Celsius inkubieren. HBSS für die Wäsche ebenfalls auf 28 Grad Celsius vorwärmen. Nach der Inkubation die Embryonen in eine neue Schale mit warmem HBSS geben und schwenken.

Fahren Sie dann entweder mit der Ross-Erkennung für die gesamte Montierung oder mit einer einzelnen Zelle fort. Eine physiologischere Option besteht darin, nach Gewebeschäden Stress zu erzeugen, indem die von NI Tomer and Company beschriebene Technik der Heckflossenverletzung verwendet wird. Nach der Oxidationsmittelbehandlung werden Gruppen von bis zu 10 Embryonen in kleine Röhrchen übertragen.

Spülen Sie sie stark mit HBSS ab und schützen Sie sie mit Folie vor Licht. Geben Sie anschließend einen Milliliter rohe Nachweislösung in jedes Röhrchen und inkubieren Sie die Röhrchen 15 Minuten lang bei 28 Grad Celsius, während sie inkubieren. Bereiten Sie einen Objektträger vor, der sowohl die Kontroll- als auch die Versuchsbedingung enthält.

Decken Sie einen Objektträger mit 300 Mikrolitern Methylcellulose ab. Machen Sie keine Blasen beim Auswerfen der Methylcellulose. Ersetzen Sie nach der Inkubation des Embryos schnell die Lösung in den Eileitern durch zwei Milliliter HBSS und drehen Sie die Eileiter mehrmals um, um die Embryonen zu waschen.

Aspirieren Sie dann die Embryonen in die Spitze einer Mikropipette und werfen Sie sie vorsichtig in den behandelten Objektträger aus. Richten Sie die Embryonen mit einer feinen Nylonlinie aus und fahren Sie mit der Verwendung eines Fluoreszenz- oder konfokalen Rastermikroskops zur Analyse fort. Stellen Sie sicher, dass Sie alle Embryonen mit den gleichen Einstellungen analysieren.

Übertragen Sie die Embryonen aus der HBSS-Waschung in eine neue Schale und entfernen Sie so viel wie möglich von der Lösung. Entkleiden Sie nun die Embryonen von Hand. Dies ist wirklich notwendig, um Embryonen in einzelne Zellen zu dissoziieren.

Verschieben Sie als Nächstes die Embryonen in eine 24-Well-Platte und laden Sie jeweils 15 Embryonen hinein. Brunnen Füllen Sie optimal drei Vertiefungen für jede Bedingung. Entfernen Sie anschließend die gesamte Lösung und ersetzen Sie sie durch 300 Mikroliter HBSS, 30 Mikroliter Kollagenase p und 50 Mikroliter Trypsin EDTA.

Homogenisieren Sie die Embryonen mit einer Ein-Milliliter-Pipettenspitze mit Trier. Sobald alle Vertiefungen vorbereitet sind, stellen Sie die Platte alle fünf Minuten für mindestens 20 Minuten auf 28 Grad Celsius und tritrieren Sie die Proben, um eine gute Homogenisierung zu gewährleisten. Legen Sie auch einige Mikro-Fuge-Röhrchen auf Eis, um das Gewebe zu sammeln, wenn es fertig ist.

Entnehmen Sie nach 20 Minuten eine Probe und überprüfen Sie unter dem Mikroskop, ob das Gewebe in eine einzellige Suspension aufgebrochen wird. Wenn nicht, setzen Sie die Inkubation insgesamt bis zu 30 Minuten fort. Wenn das Gewebe fertig ist, stoppen Sie die Reaktion mit zusätzlichen 200 Mikrolitern Stopplösung.

Mischen Sie dies mit TRI mit einer Ein-Milliliter-Pipettenspitze. Übertragen Sie als Nächstes den Inhalt jeder Vertiefung in ein vorgekühltes Mikro-Fuge-Röhrchen und halten Sie diese Röhrchen auf Eis vor Licht geschützt. Anschließend zentrifugieren Sie die Proben bei 250 GS für fünf Minuten bei vier Grad Celsius.

Und dann entferne den Überstand durch Aspiration. Suspendieren Sie das Zellpellet in eiskaltem HBSS mit sanftem Tri und überprüfen Sie, ob die Suspension mindestens 2 Millionen Zellen enthält. Als nächstes resuspendieren Sie die Zellen in einem Milliliter der rohen, empfindlichen Sondenlösung.

Inkubieren Sie sie bei Raumtemperatur und im Dunkeln für etwa drei Minuten. Passen Sie diese Inkubationszeit empirisch an. Übertragen Sie anschließend die Zellen auf lichtabgeschirmte Faxröhren.

Fahren Sie mit Faxanalysen fort, um den transgenen Marker zu erkennen. Fluoreszenz und Ross-Sonde Fluoreszenz Während Ihrer Analyse. Berechnen Sie die Verluste immer mit zunehmender Faltung im Vergleich zu Kontrollproben, um die Hintergrundfluoreszenz zu normalisieren.

Alle Mount-Ross-Detektionen wurden verwendet, um die Ansammlung von Wasserstoffperoxid an einer Wundstelle zu untersuchen. Intakte und verletzte Schwänze wurden nach 20-minütiger Behandlung mit dem Oxidationsmittel verglichen. In beiden Fällen wurde ein unspezifisches Signal detektiert.

Das gleiche Experiment mit der Vorbehandlung der Embryonen, um den Wasserstoffperoxidspiegel zu senken. Die Verwendung der OX-Inhibitoren VA 28 70 zeigte, dass die detektierten Signale tatsächlich von der Ross-Akkumulationsfäule abhängig waren. Bekannte behandelte Embryonen wurden ebenfalls mit Ganztieren untersucht.

Unter starker Vergrößerung konnten anatomische Regionen identifiziert werden. Die Ross-Zählung, die durch Fluoreszenzzählung von Ross-positiven Zellen per Fax angezeigt wurde, wurde für die Einzelzell-Ross-Detektion durchgeführt. Diese Analyse wurde ohne Einbeziehung abgestorbener Zellen durchgeführt. Steuerung.

Auch Zellen ohne Behandlung wurden analysiert. Der Vergleich dieser Ergebnisse machte die Quantifizierung der Ross-Akkumulation sehr einfach. Der Assay erweist sich als hervorragend geeignet, um eine beliebige Anzahl von experimentellen Manipulationen zu testen.

Sobald Sie dies beherrschen, kann eine Technik in 90 Minuten ausgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit molekularen Sonden extrem gefährlich sein kann und die Präkursion. Bei der Durchführung dieses Verfahrens sollte immer Handschuhe verwendet werden.