Name: Analyse von oxidativem Stress in Zebrafischembryonen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 5 s
Description: Erfahren Sie, wie oxidativem Stress in lebenden Zebrafisch-Embryonen qualitativ und quantitativ gemessen wird. Diese Methode nutzt Konfokalmikroskopie und Zytofluorometrie zur ROS-Erfassung in Geweben und Einzelzellen.

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Unterstützung im Labor von Massimo Santoro kommt von HFSP, Marie Curie Action, Telethon und AIRC. Wir danken Dafne Gays und Emiliano Panieri für die kritische Lektüre des Manuskripts.

1. Vorbereitung der Instrumente und Arbeitslösungen <ol><li> Bereiten Sie die Fisch-Wasser-Lösung. Machen Sie eine Stammlösung durch Lösen von 2 g Meersalz &quot;Instant Ocean&quot; in 50 ml destilliertem Wasser. 1,5 ml der Stockfisch Wasser auf 1 L destilliertem Wasser zur Vorbereitung bereit, Fisch Wasser (60 ug / ml Meersalze Endkonzentration) zu verwenden. Autoklavieren bereit, Fisch Wasser vor Gebrauch zu verwenden. Diese Lösung wird als Zebrafischembryo Medium verwendet. </li><li> Bereiten Methylcellulose für die Embryo-Montage. Lösen Sie 1,5 g Methylcellulose in 50 ml sterilem Wasser Fisch. Erleichtern Sie die Auflösung mit Hilfe eines Magneten auf einer Rührplatte. Die vollständige Auflösung des Pulvers benötigt mehrere Stunden. Überprüfen Sie die Lösung für Klarheit und Teilmenge in kleine Röhrchen. Lagerung bei -20 ° C für Monate und auftauen Aliquots bei Gebrauch. Zentrifugieren Sie die Methylcellulose bei 950 xg für 5 min vor der Anwendung. Vermeiden Frost-Tau-Zyklen von Teilmengen. </li><li> Bereiten Sie 50 ml Tricaine / Ethyl-3-m Aminobenzoatethansulfonat Salz (Stammlösung) durch Lösen von 200 mg Tricaine in 100 ml Wasser und pH-Wert auf 7,0 mit Tris-HCl 1 M (pH 9). Bewahren Sie die Lager bei 4 ° C für nicht mehr als 30 Tage. ACHTUNG: Tricaine ist giftig. Verwenden Sie nach geeigneten Verarbeitungsrichtlinien. </li><li> Induktion oxidativen Stress in Zebrafischembryonen <ol><li> Bereiten Sie ein Oxidationsmittel-Lösung für generische oxidativen Stress Induktion: Stellen 50 ml Oxidationslösung durch Zugabe von H 2 O 2-Stammlösung (Wasserstoffperoxid; 100 mM) um Fische zu Wasser. Mit H 2 O 2 zu einer Endkonzentration von 2 mM bzw. 100 uM. Diese Lösung kurz vor Gebrauch. Die Oxidationsmittel-Lösung kann sowohl whole mount ROS-Erkennung und Einzelzellen-ROS-Nachweisverfahren angewendet werden. Sie diese Lösung lagern. ACHTUNG: H 2 O 2 ist gefährlich und gesundheitsschädlich beim Einatmen und Verschlucken. Berührung mit brennbaren Stoffen besteht Feuergefahr. Griff unter einer Abzugshaube und tragen Sie geeignete personal Schutzausrüstung. </li><li> Bereiten Sie ein Oxidationsmittel-Lösung für Mitochondrien-abgeleiteten oxidativen Stress Induktion: Machen Sie eine Oxidationsmittel-Stammlösung (5 mM) durch Auflösen von 3,9 mg Rotenon in 2 ml Dimethylsulfoxid (DMSO). Diese Lösung wird bei Raumtemperatur in der Dunkelheit. <ol><li> Lösen Rotenon Stammlösung zu 10 ml Wasser pro Fisch gebrauchsfertige Lösung zu machen. Verwenden Rotenon in einer Konzentration zwischen 5-50 uM. Verwenden Sie keine Rotenon in Konzentrationen von mehr als 100 uM. In geeigneten Konzentrationen kann dieser Oxidationslösung sowohl whole mount ROS-Erkennung und Einzelzellen-ROS-Nachweisverfahren angewendet werden. ACHTUNG: Rotenon ist giftig und gefährlich. Handhabung entsprechend geeignete Sicherheitshinweise. </li></ol></li><li> Induzieren oxidativen Stress durch Gen-Knock-down: Super-Sonder nrf2a Genexpression im Zebrafisch-Embryonen, die durch Mikroinjektion Morpholino, wie zuvor von Timme-Laragy A. et al, 2012, 38 berichtet.. </li><li> Induzieren oxidAtive Stress nach Gewebeschäden: erzeugen ein Wundrand an der Schwanzflosse von Zebrafischembryonen bei 72 hpf, wie zuvor von Niethammer et al, 2009, 39 beschrieben.. </li></ol></li><li> Bereiten 5 ml ROS-Detection-Lösung für einzelne Zelle ROS-Nachweisverfahren: <ol><li> Lösung für allgemeine ROS-Erkennung: Lösen Sie das generische ROS-sensitive molekulare Sonde in HBSS (Hanks Balanced Salt Solution), um eine funktionierende Lösung (Konzentrationsbereich: 2,5 bis 10 uM) vorzubereiten. Diese Lösung muss kurz vor Gebrauch hergestellt werden. </li><li> Lösung für den spezifischen Nachweis von ROS induzierte Mitochondrien: Kurz vor Gebrauch auflösen eine mitochondriale ROS-empfindliche Sonde mit DMSO, einen 5 mM Stammlösung. Lösen Stammlösung in HBSS, um eine Arbeitslösung (Konzentrationsbereich: 2,5 bis 10 uM) vorzubereiten. HINWEIS: Vermeiden Sie Licht und Sauerstoff Exposition von ROS-Erkennung Arbeitslösungen und ihre jeweiligen Stammlösungen. Schützen Sie den Schlauch von Licht mit Hilfeeine Aluminiumfolie. Bewahren Sie keine oder Wiederverwendung Sonden in HBSS gelöst. Bewahren Sie die Stammlösungen bei -20 ° C für einen Monat. VORSICHT: Gehen molekulare Sonden und DMSO unter einer Abzugshaube in Übereinstimmung mit den entsprechenden Richtlinien. </li></ol></li><li> Bereiten 5 ml ROS-Detection-Lösung für die gesamte Halterung ROS-Nachweismethode: Lösen Sie die generische ROS-empfindliche Sonde Stammlösung (in DMSO stabilisiert) in HBSS, um eine Arbeitslösung (Konzentrationsbereich: 2,5-5 uM) vorzubereiten. Licht-und Sauerstoffeinwirkung vermeiden. Schützen Sie den Schlauch vom Licht. Diese Lösung vor dem Gebrauch. Bewahren Sie keine oder verwenden Sie wieder diese Lösung. VORSICHT: Gehen molekulare Sonden unter einer Abzugshaube in Übereinstimmung mit den entsprechenden Richtlinien. </li><li> Machen 25 ml Stopplösung durch Zugabe von 10 ml fötales Rinderserum und 15 ml 1x PBS. Halten Lösung steril. Bewahren Sie die Lösung bei 4 ° C ROS Nachweisverfahren - nur für einzelne Zelle Diese Lösung benötigt. </li><li> Stellen Sie den Zebrafisch-Luft-Inkubator bei 28 &amp;# 176; C </li><li> Stellen Sie die Zentrifuge bei 4 ° C für die einzelne Zelle ROS-Erfassungsverfahren. </li></ol> 2. Paarung von Adult Fische und Auswahl von Zebrafischembryonen <ol><li> Set-up erwachsenen Zebrafisch Paar kreuzt nach Standardprotokollen 40. Wählen Sie die entsprechende transgene Linie nach bestimmten experimentellen Anforderungen. </li><li> Eier sammeln und sie in einer 90-mm-Schale mit Fisch Wasser / Embryo Medium. Halten Sie Eier bei 28 ° C bis Embryonen entwickeln und wachsen, um die gewünschte Entwicklungsstufe (zB 48 hpf, 72 hpf; hpf: Stunden nach der Befruchtung). </li><li> Bildschirm für die Entwicklung von Embryonen. Ausschließen aller unbefruchtete Eier oder Embryonen unterentwickelt. </li><li> Anesthetize Embryonen, die durch Zugabe von 1 ml Tricaine (Stammlösung) in 50 ml Fischwasser. </li><li> Wählen Tg fluoreszierende Embryonen unter einem Stereomikroskop. </li></ol> 3. Behandlung der Embryonen mit Oxydationsmittel-Agenten <ol><li> Verwenden Sie mindestens 30 Embryonen zwischen 48 hpf und 72 pro HPF unterschiedlichen Zustand. Zweimal waschen Embryonen mit frischem Fisch Wasser, um Tricaine entfernen. </li><li> Split fluoreszierende Embryonen in drei Gerichte. Legen Sie nicht mehr als 30 Embryonen / Schale. </li><li> Entfernen Sie die Waschlösung und 10 ml der Oxidationsmittellösung oder 10 ml Fischwasser als Steuerungslösung. </li><li> Embryonen für 10 min bis 1 h Inkubation bei 28 ° C. Die Inkubationszeit hängt von dem Niveau von oxidativem Stress in spezifischen Geweben induziert werden. Kurze Perioden sind die besten als Zellen durch oxidativen Stress beeinflusst zunehmend Zelltod. </li><li> Transfer-Embryonen in eine neue Schale mit HBSS und Wasch Embryonen durch Verwirbelung. Pre-warmen HBSS bei 28 ° C </li></ol> 4. Ganze Berge ROS Erkennungsmethode <ol><li> Sammeln Embryonen nach Oxidationsbehandlung und setzen nicht mehr als 10 Embryonen in einer kleinen Röhre. Spülen mit HBSS so viel wie möglich. Schützen Sie den Schlauch von Licht mit Aluminiumfolie. </li><li> 1 ml der ROS-Nachweislösung fürjedes Rohr. </li><li> Embryonen im Dunkeln für 15 min Inkubation bei 28 ° C bis Lichtexposition zu vermeiden. </li><li> Während der Inkubationszeit bereiten einen Glasobjektträger für ganze Embryo-Analyse. Setzen Sie 300 ul von Methylcellulose auf einer &quot;Depression&quot; Glasobjektträger und breitete sie auf der Glasoberfläche mit einer Pipettenspitze. Vermeiden Sie Luftblasen beim Loslassen der Methylcellulose. </li><li> Am Ende der Inkubationszeit, sofort den ROS-Detection-Lösung und zweimal waschen mit 2 ml HBSS. Waschen Embryonen durch Umdrehen des Röhrchens mehrmals. Pipettieren, oder Wirbel. </li><li> Saugen Embryonen in eine Glaspasteurpipette. Embryonen Position nahe der Öffnung der Pipette und sanft ausgeworfen sie in die Methylcellulose. Richten Sie die Embryonen entsprechend mit einem feinen Nylon-Linie. </li><li> Vergleichen Sie die Fluoreszenz der Steuer Embryonen mit behandelten Embryonen. Alternativ fixieren Parameter der Fluoreszenz-Stereomikroskop oder konfokalen Mikroskop, so dass alle Embryonen werden unter Verwendung der gleichen abgebildetenBildeinstellungen. </li></ol> 5. Single Cell ROS-Nachweisverfahren <ol><li> Beginnen Sie ab Schritt: 3.5. Achten Sie darauf, mindestens 35 Embryonen für jede Bedingung. </li><li> Übertragen Embryonen in eine neue Schüssel. Entfernen Fisch Wasser so weit wie möglich. 10 ml eiskaltem PBS und 1x 400 ul von Protease-Inhibitoren-Cocktail. Manuelles dechorionate Embryonen mit einer Pinzette und entfernen Sie den Dottersack mit einer feinen Nadel. Hinweis: Das Entfernen Dottersack sorgt für saubere Proben für die folgenden FACS-Analyse. Dieser Schritt kann nach FACS-Gerät vermieden werden. </li><li> Über de-yolked Embryonen in eine 24-Well-Multiwell-Platte (15 Embryonen / well) und entfernen Sie alle Fische Wasser. </li><li> In 300 ul HBSS, 30 ul Collagenase P, 50 ul Trypsin-EDTA in jedem gut. </li><li> Homogenisieren Embryonen durch leichtes Auf-und Abpipettieren mit einem engen Pipettenspitze (1.000 ul). </li><li> Inkubieren bei 28 ° C für 20 min und homogenisieren Proben durch Pipettieren alle 5 min. </li><li> Überprüfen Gewebe disruption durch die Beobachtung eines aliquoten Homogenat bei der Verbindung Mikroskop. Erleichterung Einzelzellsuspension pipettiert. Embryonen inkubiert Sie nicht mehr als 30 min. </li><li> Stoppen der Reaktion durch Zugabe von 200 ul Stopplösung. Mischen durch Pipettieren vorsichtig. </li><li> Übertragen Zellsuspension in eine vorgekühlte Röhrchen mit dichten Boden. Halten Röhrchen auf Eis und vermeiden Belichtung. </li><li> Zentrifugieren für 5 min bei 250 × g bei 4 ° C. </li><li> Entfernen Sie die obere Phase und wieder aussetzen Zellen mit eiskaltem HBSS durch vorsichtiges Pipettieren. </li><li> Zählen von Zellen und stellen Sie sicher, dass Sie die gleiche Anzahl von Zellen in der alle Ihre Proben. Verwenden Sie nicht weniger als 2 x 10 6 Zellen. </li><li> Zentrifuge Zellen 5 min bei 250 × g bei 4 ° C. </li><li> Überstand entfernen und die Aussetzung der Pellet mit 1 ml HBSS Eis gekühlt, das die ROS-empfindliche Sonde. </li><li> Das Röhrchen bei Raumtemperatur für 3 min in der Dunkelheit. Inkubationszeit variieren entsprechend dem Niveau von oxidativem Stress und ter Empfindlichkeit der Sonde. </li><li> Übertragungszellen zu einer FACS-Röhrchen. Halten Röhrchen auf Eis und vermeiden Belichtung vor der FACS-Analyse. </li><li> Sortieren Zellen mit einem Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierer (FACS). Satz Wellenlängen in Übereinstimmung mit Tg Gewebefluoreszenz (z. B. GFP) und der Erreger / Emissionsspektren der molekularen Sonde für ROS Erkennung (z. B. spezifische mitochondriale ROS-empfindlichen Sonden, generische ROS empfindlichen Sonden) verwendet. </li><li> Für jede Bedingung messen alle Proben in der gleichen Versuchs Sitzung durch die Anwendung der gleichen FACS-Einstellungen. Der prozentuale Anteil der fluoreszierenden Zellen als Mittelwert der unterschiedlichen biologischen Replikaten. Analysieren Sie mindestens zwei Wiederholungen für jede Bedingung. </li></ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Kritische Schritte Das Verfahren für die Erkennung von oxidativem Stress in Zebrafischembryonen hier beschriebenen zwei verschiedenen Methoden. Der ganze Berg ROS-Nachweismethode ist vor allem ein qualitativer Test zur ROS-Erkennung, während die einzelne Zelle ROS-Detektionsverfahren ermöglicht eine spezifische quantitative Messungen (Abbildung 1). Beide Methoden bieten eine schnelle und einfache Möglichkeit, in vivo ROS-Erkennung auf Zebrafischembryonen zu beurteilen...

Oxidativer Stress ist speziell als eine Bedingung, die aus einem unsymmetrischen zellulären Redox-Zustand ergibt definiert. Die komplexen Redox-Reaktionen, die routinemäßig in den Zellen auftreten, bestimmen die zellulären Redox-Zustand. Redox-Reaktionen umfassen alle chemischen Reaktionen, die in der Übertragung von Elektronen zwischen den Atomen von biologischen Molekülen Herstellung Reduktion und Oxidation von Molekülen (dh Redoxreaktionen) bestehen. Diese Reaktionen werden durch elektronisch aktivierten Spezies (dh pro-oxidativen Spezies), die durch eine extreme strukturelle Instabilität und spontane Aktivierung von unsymmetrischen Elektronen, die mit den Nachbar Biomolekülen auszutauschen gekennzeichnet katalysiert. Diese Reaktionen führen in unregelmäßigen DNA-Schäden, Protein Carboxylierung und Lipidoxidation, und schließlich zum Zelltod führen 1. Erhöhten oxidativen Stress mit dem Altern und dem Fortschreiten von verschiedenen pathologischen Zuständen 2 verbunden. Oxidativer Stress hatberichtet für Gefäßveränderungen bei Diabetes und Herzkreislauferkrankungen 3,4 verantwortlich zu sein. Es spielt auch eine kritische Rolle bei der neuronalen Degeneration bei Alzheimer-Krankheit und Parkinson-Krankheit 5. Außerdem hat oxidativen Stress als kritischer Faktor bei der Steuerung der Tumorprogression und metastatischen Ereignisse 6,7 nachgewiesen. Darüber hinaus können Entzündungen und Immunreaktionen auslösen und weitere Unterstützung oxidativen Stress 8. Oder Stickstoff (RNS; reaktive Stickstoffspezies) in lebenden Zellen sind pro-oxidativen Spezies von Sauerstoff (reaktiver Sauerstoffspezies, ROS) abgeleitet. ROS sind das Hydroxyl-Radikal, das Superoxid-Anion (OH.) (O 2 -) und Wasserstoffperoxid (H 2 O 2). Der primäre RNS ist Stickoxid (NO).. Eine Reihe von sekundären reaktiven Spezies können durch spontane Wechselwirkung zwische erzeugt werdenn ROS und RNS oder freien Metallen Ionen 9. Beispielsweise reagiert das Superoxid-Anion mit Lachgas zu Peroxynitrat (ONOO -) zu bilden, während H 2 O 2-Reaktion mit Fe 2 + Hydroxylradikale erzeugt. ROS und RNS, die aufgrund ihrer Fähigkeit, mit verschiedenen Biomolekülen reagieren, werden als gefährliche Bedrohung für die Aufrechterhaltung der physiologischen Redox-Zustand 10. Zur Aufrechterhaltung der Redox-Zustand-Zellen werden mit einer Reihe von entgiftende Anti-Oxidationsmittel-Molekülen und Enzymen ausgestattet. Die Superoxid-Dismutase (SOD), Katalase, Glutathion-Peroxidase und Peroxiredoxine bilden im Wesentlichen die Anti-Oxidationsmittel enzymatisch-Arsenal, das Zellschutz bietet von pro-oxidative Arten, darunter H 2 O 2, OH und OONO -. 11. Auch Anti-Oxidationsmittel-Moleküle wie Vitamin C und E, Polyphenole und CoenzymeQ10 (CoQ10) sind von entscheidender Bedeutung für ROS und ihre gefährlichen de löschenDerivate 12,13. Verschiebt sich jedoch eine übermäßige Produktion von ROS und RNS oder einer Funktionsstörung in dem Antioxidationsmittel-System, das zelluläre Redox-Zustand zu oxidativem Stress 14. Neben ihren negativen Beigeschmack, können ROS verschiedenen physiologischen Rollen in Zellen verschiedener Herkunft zu spielen. Die Zellen produzieren normalerweise ROS als Signalmoleküle in den normalen biologischen Ereignisse wie der Wirtsabwehr und Wundheilung 15-17 vermitteln. Reaktiven Spezies werden normalerweise in Zellen durch intrazelluläre Enzyme, wie NOX (NADPH Oxidase) und XO (Xanthin-Oxidase) in Reaktion auf Signalfaktoren, Wachstumsfaktoren und intrazelluläre Calciumspiegel Schwankungen 18,19 hergestellt. Es wurde berichtet, dass ROS differentiell moduliert die Aktivität wichtig Kernfaktoren wie p53 oder zellulären Komponenten, wie das ATM-Kinase, ein Hauptregulator der Antwort auf DNA-Schädigung 20. Analog ROS stark beeinflussen zelluläre Signal durch Vermittlung thE-Oxidation und Inaktivierung von Protein-Tyrosin-Phosphatasen (PTPs), die als kritische Regulatoren der Signaltransduktion 21 etabliert sind. Außerdem zeigen Proteom Methodik, dass RNS auch für spezifische Protein Modifikationen und Änderungen der molekularen Signal verantwortlich. RNS reagieren mit den Cystein-Thiolgruppen modifiziert sie in S-nitrothiols (SNO) und Trigger molekularen Signalwege gleichzeitig mit pathologischen Zuständen, wie entzündliche und Autoimmunerkrankungen 22,23. Da Zellkulturexperimenten die Vielzahl der in-vivo-wirkende Faktoren nur teilweise zu reproduzieren, von großem Interesse ist es Redox-Studien in Tiermodellen 24,25 durchzuführen. Um dies zu erreichen, hat der Zebrafisch wurde als geeignete Wirbeltiermodell für oxidativen Stress Dynamik 26 studieren. Der Zebrafisch ist ein neues Modell, das System mehrere Vorteile, zellulären und genetischen Ereignisse während Wirbel dev Stipendienelopment und Krankheit. Große Cluster von Embryonen erzeugt und verfügbar werden wöchentlich für experimentellen Anforderungen. Darüber hinaus ist die außergewöhnliche optische Klarheit der Zebrafisch-Embryonen sowie ihrer geringen Größe ermöglicht die Einzelzell-Imaging und dynamische Tracking in einem ganzen Organismen 27. In den letzten zehn Jahren eine beträchtliche Anzahl von Zebrafisch-Mutanten wurden erzeugt, um menschlichen Krankheitszuständen wie Krebs und genetischen Krankheiten 28-31 modellieren. Am wichtigsten ist, eine Vielzahl von transgenen Linien wurde erstellt, um umfangreiche Möglichkeiten der genetischen und biologischen Manipulationen 32 zu ermöglichen. Zum Beispiel sind transgene Zebrafisch gewebespezifische Leitungen regelmäßig auf in-vivo-Studien verwendet. Diese Linien exprimieren ein Fluoreszenzprotein unter der Kontrolle eines ausgewählten Promotors und bietet die Möglichkeit, Einzelzellen in vivo zu identifizieren, sowie die anatomische Struktur, die sie umfassen. Mehrere toxikologischen Studien haben bereits verwendet ter Zebrafisch, um die in vivo Wirkung von Chemikalien auf Redox-Homöostase zu bewerten, was die Eignung dieser Wirbel als Tiermodell für den Bereich der Arzneimittelforschung und oxidativen Stress 33-35. Auch wenn einige fluoreszierende Sonden wurden getestet, um oxidativen Stress in Zebrafisch-Larven 36,37 zu überwachen, gibt es keine eindeutigen Tests zu erkennen und zu messen, die Niveaus von oxidativem Stress in Zebrafisch-Gewebe und lebenden Zellen. Hier beschreiben wir ein Verfahren zur in vivo Quantifizierung von oxidativem Stress in lebenden Zellen von Zebrafischembryonen. Imaging-Tools, FACS-Sortierung, fluoreszierende Sonden und pro-oxidative Bedingungen kombiniert, um eine einfache Test für den Nachweis und die Quantifizierung von oxidativen Spezies in Zebrafischembryos und Geweben zu erzeugen.

<table><tbody><tr><td>Wasserstoffperoxid-Lösung</td><td>SIGMA</td><td>516813</td><td>DILUITATIONS NICHT LAGERN</td></tr><tr><td>Hank's Balanced Salt Solution 1x</td><td>GIBCO</td><td>14025</td><td></td></tr><tr><td>Methylcellulose</td><td>SIGMA</td><td>M0387</td><td></td></tr><tr><td>Instant Ocean Aquarium Meersalzmischung</td><td>INSTANT OCEAN</td><td>SS15-10</td><td></td></tr><tr><td>Tricain</td><td>SIGMA</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>Cgenerische ROS-empfindliche Sonde: CellROX Deep Red Reagenz</td><td>INVITROGEN</td><td>C10422</td><td></td></tr><tr><td>Mitochondrien-spezifische ROS-empfindliche Sonde: MitoSOX</td><td>INVITROGEN</td><td>M36008</td><td>löst eine Durchstechflasche mit 13 μm auf; l DMSO</td></tr><tr><td>Hydroethidin</td><td>INVITROGEN</td><td>D23107</td><td></td></tr><tr><td>Rotenon</td><td>SIGMA</td><td>R8875</td><td>5 mM Stammlösung in DMSO herstellen.</td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid</td><td>SIGMA</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>VAS2870; 3-Benzyl-7-(2-benzoxazolyl)thio-1,2,3-triazolo(4,5-d)pyrimidin</td><td>EnzoLifeScience</td><td>BML-EI395</td><td>lösen das Pulver in DMSO; Diluit in Fischwasser</td></tr><tr><td>Propidium iodid&nbsp;</td><td>Molekulare Sonden (Life Technologies)</td><td>P3566</td><td></td></tr><tr><td>7-Aminoactinomycin D (7-AAD)&nbsp;</td><td>Molecular probes (Life Technologies)</td><td>A1310</td><td></td></tr><tr><td>Nrf2a Morpholino</td><td>GeneTools</td><td>5'-CATTTCAATCTCCAT CATGTCTCAG-3'Ref</td><td>: Timme-Laragy et al.; 2012 (PMID: 22174413); Kobayashi et al.; 2002 (PMID:12167159)</td></tr><tr><td>Kollagenase P</td><td>ROCHE</td><td>11213857001</td><td>Das Pulver wird bei 100 mg/ml in sterilem HBSS gelöst. Lagern Sie Aliquots bei -20 > C</td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>GIBCO</td><td>10010-056</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum&nbsp;</td><td>GIBCO</td><td>10082-147</td><td></td></tr><tr><td>Complete Protease Inhibitor Cocktail Tabletten</td><td>ROCHE</td><td></td><td>Eine Tablette in 1 ml Wasser auflösen</td></tr><tr><td>0,5% Trypsin-EDTA (10x), kein Phenolrot</td><td>GIBCO</td><td>15400-054</td><td>1x Arbeitslösung vor Gebrauch herstellen</td></tr><tr><td>Verbundmikroskop&nbsp;</td><td>ZEISS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stereomikroskop mit Fluoreszenzbeleuchtung</td><td>Nikon</td><td>AZ100</td><td></td></tr><tr><td>Kamera</td><td>ZEISS</td><td>AxioCamMRm</td><td></td></tr><tr><td>Software für die Fluoreszenzbildaufnahme</td><td>ZEISS</td><td>ZEN 2011</td><td></td></tr><tr><td>Fluoreszenzaktivierter Zellsortierer</td><td>BD FACSCalibur</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5417R</td><td></td></tr><tr><td>FACS Röhren&nbsp;</td><td>BD</td><td>342065</td><td></td></tr><tr><td>Multiwell-Platte&nbsp;</td><td>BD Falcon</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>Sterilisierte, unbehandelte Petrischalen 90 mm</td><td>VWR</td><td>391-1915</td><td></td></tr><tr><td>Konfokalmikroskop</td><td>Leica</td><td>Leica SP5</td><td></td></tr></tbody></table>

analyse von oxidativem stress in zebrafischembryonen

Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos

Hohe Konzentrationen von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS), kann eine Änderung des zellulären Redox-Status zu oxidativem Stress Zustand führen. Diese Situation führt zu Oxidation von Molekülen (Lipid, DNA, Protein) und führt zum Zelltod. Oxidativer Stress beeinflusst auch das Fortschreiten von verschiedenen pathologischen Zuständen, wie Diabetes, Retinopathie, Neurodegeneration und Krebs. Somit ist es wichtig, dass Werkzeuge definieren oxidative Stressbedingungen nicht nur auf der Ebene einzelner Zellen, sondern auch im Zusammenhang mit ganzen Organismen zu untersuchen. Hier betrachten wir die Zebrafisch-Embryos als nützliches in vivo-System, solche Studien durchführen und präsentieren ein Protokoll zur in vivo oxidativen Stress messen. Unter Ausnutzung der Fluoreszenzsonden ROS und Zebrafisch transgenen fluoreszierende Linien entwickeln wir zwei verschiedene Methoden zur oxidativen Stress in vivo zu messen: i) eine &quot;ganze Embryo ROS-Nachweisverfahren&quot; für die qualitative Messung von oxidativem Stress und ii) ein &quot;Einzelzell ROS Nachweisverfahren &quot;für quantitative Messungen von oxidativem Stress. Hier zeigen wir die Wirksamkeit dieser Verfahren durch Erhöhung von oxidativem Stress in Geweben von Oxidationsmittel und physiologische oder genetische Methoden. Dieses Protokoll ist zugänglich für zukunfts genetischen Bildschirme, und es wird in Tiermodellen der oxidative Stress-Erkrankungen wie neurologische Störungen und Krebs helfen Adresse Ursache-Wirkungsbeziehungen von ROS.

Durch die Anwendung der hier beschriebenen Verfahren können wir leicht erkennen, messen und oxidativen Stress (und ROS) im Zebrafisch embryonalen Geweben. Nach der Überquerung erwachsenen Zebrafisch, werden die Eier gesammelt und bei 28 ° C bis 72 Stunden nach der Befruchtung (hpf) zu entwickeln. Um oxidativen Stress zu induzieren, schlagen wir zwei verschiedene Ansätze: 1) die Behandlung der Embryonen mit starken pro-oxidative Reagenzien oder 2) Förderung der ROS-Bildung nach Gewebeverletzung. <p class="jove_conten...

Hier berichten wir über ein Protokoll zur Messung von oxidativem Stress in lebenden Zebrafischembryonen. Dieses Verfahren ermöglicht den Nachweis von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) sowohl in ganzen Embryogeweben als auch in Einzelzellpopulationen. Mit diesem Protokoll werden sowohl qualitative als auch quantitative Analysen durchgeführt.

Analyse von oxidativem Stress in Zebrafischembryonen

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, oxidativen Stress in lebenden Zebrafischembryonen qualitativ und quantitativ zu messen. Dies wird erreicht, indem eine oxidative Lösung zu vorbereiteten Embryonen hinzugefügt wird, um oxidativen Stress auszulösen, oder indem ein Wundrand am Schwanzflossenende des Embryos erzeugt wird. Anschließend werden die Embryonen entweder mit einer Einzelzellmethode oder einer Ganzpräparat-Methode zur Detektion des oxidativen Stresses verarbeitet.Anschließend werden die Präparationen mit einer ROS-Detektionssonde inkubiert. Die Ergebnisse können die Menge an oxidativem Stress und den ROS-Spiegel basierend auf der konfokalen Mikroskopie von Vollpräparaten oder der zytofluorometrischen Analyse einzelner Zellen zeigen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Immunfluoreszenz für Marker des oxidativen Stresses liegt darin, dass sie die direkte Detektion im Kontext eines lebenden Organismus sowie die Quantifizierung auf Ebene einzelner Gewebe ermöglicht.Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen in der Grundlagenforschung zu beantworten, beispielsweise die Untersuchung von oxidativem Stress unter pathologischen Bedingungen. Personen, die neu in diesem Bereich sind, können Schwierigkeiten haben, da unbeabsichtigte Gewebeschäden auftreten können, weil die rohen, empfindlichen molekularen Sonden eine unerwartete Quelle von Säure sein können. Außerdem müssen hohe Konzentrationen an oxidativem Stress zum Zelltod führen, während zu geringe Konzentrationen nur schwer nachweisbar sind, was mit Übung und Experimentieren verbunden ist. Diese Probleme stellen sich erst ein, wenn die Lösung zur Induktion von oxidativem Stress in den Mitochondrien, die aus Rotenon in DMSO besteht, hergestellt wird. Dabei sollte die Lösung aus einer Rotenon-Stammlösung mit einer Konzentration zwischen fünf und 50 Mikromolar hergestellt werden und niemals über 100 Mikromolar liegen, da Rotenon toxisch und gefährlich ist.Achten Sie auf die angegebenen Vorsichtsmaßnahmen. Die Probelösung für die Loch-Mount-Ross-Detektion darf während ihrer Herstellung keiner Licht- oder Sauerstoffeinwirkung ausgesetzt werden und muss frisch für die Einzelzell-Ross-Detektionsmethode zubereitet werden. Eine Stopplösung aus FBS in PBS muss hergestellt und bei vier Grad Celsius aufbewahrt werden.Weitere Vorbereitungen umfassen das Einstellen des Zebrafisch-Luftinkubators auf 28 Grad Celsius und das Kühlen des Zentrifugens auf vier Grad Celsius für die Einzelzellmethode. Die Paarung von Zebrafischen, die Sammlung der Embryonen sowie die Anästhesie werden durchgeführt. Sammeln Sie mit standardisierten Methoden die gewünschten Embryonen zwischen 48 und 72 Stunden nach der Befruchtung.Nach der Betäubung der Embryonen das Anästhetikum zweimal ausspülen und anschließend die Embryonen auf drei Schalen verteilen, wobei nicht mehr als 30 pro Schale für die rohe Einzelzell-Detektion verwendet werden. Pro Bedingung mindestens 35 Embryonen in mehreren Schalen sammeln. Danach 10 Milliliter Oxidationslösung oder als Negativkontrolle entsprechend anwenden.Geben Sie 10 Milliliter Wasser hinzu und warten Sie dann 10 bis 60 Minuten, während die Embryonen bei 28 Grad Celsius inkubieren. Erwärmen Sie außerdem HBSS zum Waschen auf 28 Grad Celsius vor. Nach der Inkubation überführen Sie die Embryonen in eine neue Schale mit warmem HBSS und schwenken diese. Danach entweder mit der Ganzpräparat- oder Einzelzell-Ross-Detektion fortfahren. Eine physiologischere Option besteht darin, Stress nach Gewebeschädigung durch die von NI Tomer und Kollegen beschriebene Schwanzflossenverletzungstechnik zu erzeugen. Nach der Behandlung mit Oxidationsmittel überführen Sie Gruppen von bis zu 10 Embryonen in kleine Röhrchen.Spülen Sie sie gründlich mit HBSS und schützen Sie sie mit Folie vor Licht. Fügen Sie anschließend einen Milliliter der ungefilterten Detektionslösung jedem Röhrchen hinzu und inkubieren Sie die Röhrchen 15 Minuten bei 28 Grad Celsius, während sie inkubieren. Bereiten Sie einen Objektträger vor, der sowohl die Kontroll- als auch die experimentelle Bedingung enthält.Bedecken Sie eine Vertiefungsobjektträger mit 300 Mikroliter Methylcellulose. Erzeugen Sie keine Blasen, wenn Sie die Methylcellulose auftragen. Ersetzen Sie nach der Embryoinkubation schnell die Lösung in den Röhrchen durch zwei Milliliter HBSS und invertieren Sie die Röhrchen mehrmals, um die Embryonen zu waschen.Anschließend saugen Sie die Embryonen in die Spitze einer Mikropipette und geben Sie sie vorsichtig auf den behandelten Objektträger ab. Richten Sie die Embryonen mit einem feinen Nylonfaden aus und führen Sie die Analyse mit einem fluoreszierenden oder konfokalen Scanning-Mikroskop durch. Stellen Sie sicher, dass alle Embryonen unter denselben Einstellungen analysiert werden.Überführen Sie die Embryonen aus der HBSS-Waschung in eine neue Schale und entfernen Sie so viel wie möglich von der Lösung. Entfernen Sie nun manuell die Zona pellucida der Embryonen. Dies ist unbedingt erforderlich, um die Embryonen in Einzelzellen zu dissoziieren.Als Nächstes überführen Sie die Embryonen in eine 24-Loch-Platte und geben jeweils 15 Embryonen in jedes Loch. Befüllen Sie idealerweise drei Löcher pro Bedingung. Entfernen Sie anschließend die gesamte Lösung und ersetzen Sie sie durch 300 µL HBSS, 30 µL Kollagenase P und 50 µL Trypsin-EDTA.Homogenisieren Sie die Embryonen mit einem Ein-Milliliter-Pipettenspitze und einem Trier. Sobald alle Vertiefungen vorbereitet sind, überführen Sie die Platte für mindestens 20 Minuten auf 28 Grad Celsius und tritrieren Sie die Proben alle fünf Minuten, um eine gute Homogenisierung sicherzustellen. Stellen Sie außerdem einige Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis, um das Gewebe aufzufangen, sobald es bereit ist.Nach 20 Minuten eine Probe entnehmen und unter dem Mikroskop überprüfen, ob das Gewebe in eine Einzelzell-Suspension zerlegt ist. Andernfalls die Inkubation insgesamt bis zu 30 Minuten fortsetzen. Wenn das Gewebe fertig ist, die Reaktion mit weiteren 200 Mikrolitern Stopplösung beenden.Mischen Sie dies mit TRI unter Verwendung einer Ein-Milliliter-Pipettenspitze. Überführen Sie danach den Inhalt jedes Wells in ein vorab gekühltes Mikrozentrifugenröhrchen und bewahren Sie diese Röhrchen im Dunkeln auf Eis auf. Zentrifugieren Sie anschließend die Proben fünf Minuten lang bei 250 ×g und vier Grad Celsius.Und dann den Überstand durch Absaugen entfernen. Den Zellpellet in eiskaltem HBSS mit sanftem Aufrühren resuspendieren und prüfen, ob die Suspension mindestens 2 Millionen Zellen enthält. Anschließend die Zellen in einem Milliliter der rohen empfindlichen Sondentlösung resuspendieren.Inkubieren Sie sie bei Raumtemperatur und im Dunkeln für etwa drei Minuten. Passen Sie diese Inkubationszeit empirisch an. Überführen Sie anschließend die Zellen in Licht geschützte FACS-Röhrchen.Fahren Sie mit den Fax-Analysen fort, um den transgenen Marker nachzuweisen. Fluoreszenz und Ross-Sonden-Fluoreszenz während Ihrer Analyse. Berechnen Sie den Verlust stets als Faltungsanstieg im Vergleich zu Kontrollproben, um die Hintergrundfluoreszenz zu normalisieren.Die gesamte Mount-Ross-Detektion wurde verwendet, um die Ansammlung von Wasserstoffperoxid an einer Wundstelle zu untersuchen. Intakte und verletzte Schwänze wurden nach 20 Minuten der Oxidantbehandlung verglichen. Ein unspezifisches Signal wurde unter beiden Bedingungen nachgewiesen.Das gleiche Experiment mit der Vorbehandlung der Embryonen zur Verringerung der Wasserstoffperoxidkonzentration. Die Verwendung des OX-Inhibitors VAs 28 70 zeigte, dass die nachgewiesenen Signale tatsächlich von der Rot-Ross-Akkumulation abhängig waren. Bekanntermaßen behandelte Embryonen wurden ebenfalls im Ganzpräparat untersucht.Bei hoher Vergrößerung konnten anatomische Regionen identifiziert werden. Die Analyse von Ross, wie durch Fluoreszenzzählung von Ross-positiven Zellen mittels Fax angegeben, wurde zur Einzelzell-Detektion von Ross durchgeführt. Diese Analyse erfolgte ohne Einbeziehung toter Zellen. Kontrolle.Zellen ohne Behandlung wurden ebenfalls analysiert. Der Vergleich dieser Ergebnisse machte die Quantifizierung der Ross-Akkumulation sehr einfach. Der Assay erweist sich als hervorragend geeignet, um eine beliebige Anzahl experimenteller Manipulationen zu testen.Wenn man dies einmal beherrscht, kann die Technik in 90 Minuten durchgeführt werden, sofern sie ordnungsgemäß durchgeführt wird. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit molekularen Sonden äußerst gefährlich sein könnte und die Vorstufe. Der Gebrauch von Handschuhen sollte stets beachtet werden, wenn dieses Verfahren durchgeführt wird.

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Forschung

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Biologie

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