Name: Laser-Nanochirurgie der Kleinhirn-Axone In Vivo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: Lernen Sie die Laser-Nanochirurgie von Kleinhirn-Axonen in vivo mit Zwei-Photonen-Bildgebung. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung degenerativer und regenerativer Prozesse im ZNS.

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Wir möchten uns bei Erica Lorenzetti für die technische Unterstützung bei den Injektionen und bei Irene Costantini für die Erstellung von Abbildung 1 bedanken. Die Forschung, die zu diesen Ergebnissen führt, wurde von LASERLABEUROPE finanziert (Grant 284464, das Siebte Rahmenprogramm der Europäischen Kommission). Dieses Forschungsprojekt wurde auch vom italienischen Ministerium für Bildung, Universität und Forschung im Rahmen des Flaggschiff-Projekts NANOMAX und vom italienischen Gesundheitsministerium im Rahmen der "Stem Cells Call for Proposals" unterstützt. Diese Arbeit ist Teil der Forschungsaktivitäten des europäischen Flaggschiff-Projekts Human Brain und wurde im Rahmen der Stiftung International Center of Computational Neurophotonics durchgeführt, die unterstützt wird von "Ente Cassa di Risparmio di Firenze".

1. Axonal Labeling <ol><li> Kletterfasern können durch Injektion, entweder organische Farbstoffe mit hohem Molekulargewicht Dextran oder ein Plasmid / Viren, die die Expression von fluoreszierenden Proteinen induzieren 26-29 konjugiert bezeichnet werden. In diesem Protokoll wird der organische Farbstoff Dextran Alexa Fluor 488 in den unteren Olive injiziert Kletter Fasern kennzeichnen und zu visualisieren in der Kleinhirnrinde (Abbildung 1). Alle hier beschriebenen Verfahren von der italienischen Gesundheitsministerium genehmigt worden. </li><li> Bereiten Sie die Glaskapillare, indem Sie es auf eine Mikropipette Puller. Schneiden Sie die Spitze der Glaskapillare mit der Schere bis der Außendurchmesser beträgt etwa 30 um. </li><li> Laden Sie die Kapillare mit 1-2 ul der Dextran-konjugierten Farbstoff. </li><li> Bevor Sie beginnen, sterilisieren alle chirurgischen Instrumente im Autoklaven. Während des Verfahrens reduzieren Risiken der Kontamination durch die Verwendung eines Glasperlen Sterilisator. </li><li> Anesthetize der Maus (9-12Wochen) durch intraperitoneale Injektion von Ketamin (90 mg / kg) und Xylazin (9 mg / kg). Stellen Sie sicher, das Tier ist komplett mit Schwanz und / oder Zehen drückt sediert. Verwenden Tierarzt Salbe auf die Augen zu Trockenheit während der Narkose zu vermeiden. </li><li> Rasieren Sie die Haare über dem Nacken entweder mit einer Rasierklinge oder Enthaarungscreme. Wischen Sie die Operationsstelle zweimal mit betadine, mit Ethanol 70% wechselten. </li><li> Platzieren Sie die Maus auf einem stereotaktischen Halter. Halten Sie das Tier warm mit einem Heizkissen. </li><li> Drücken Sie vorsichtig die earbars auf den Knochen neben den Ohren, so dass der Kopf fest gehalten. Drehen Sie den Kopf, um eine 140 °-Winkel mit dem Körper zu bilden. Die gewünschte Orientierung kann durch leichtes Verändern der Höhe der Nase Haltestange auf der stereotaktischen Halter erhalten werden. </li><li> Einige Tropfen von Lidocain auf die Haut zwischen den Ohren. Verwenden einer Pinzette oder einer Rasierklinge, um einen vertikalen Schnitt von etwa 1 cm auf der Haut unter dem Hinterhauptbein durchzuführen. </li><li> Trennen Sie vorsichtig das subkutane Gewebe und Muskeln durch stumpfe Pinzettes unter der Dissektionsmikroskop. Drücken Sie den horizontalen Muskelbündel und halten neben den beiden vertikalen Muskeln Faszikel um die Dura über das Foramen magnum aus. </li><li> Mit äußerster Vorsicht, sezieren die Dura mit einer Spritze oder Nadel sehr scharfe Zange, um den Hirnstamm aus. Eine kleine Menge von Rückenmarksflüssigkeit kann austreten, wenn die Dura geschnitten wurde. </li><li> Auf der stereotaktischen Mikromanipulator, drehen Sie den Halter der Kapillare 45 ° aus der Senkrechten. Platzieren Sie die Kapillare an der Mittellinie in der Mitte zwischen der kaudalen Rand der Kleinhirnrinde und dem ersten Halswirbel. Legen Sie die Pipette in einer Tiefe von 2 mm von der Oberfläche. </li><li> Liefern Sie eine 0,5-1,5 ul Volumen der Farbstoff über 10-15 min. Eine Mikroinjektion Abgabesystem ermöglicht gesteuerte Druck Abgabe der Flüssigkeit in der Kapillare (Pulsdruck = 20 psi; Impulsdauer = 3-4 ms, Frequenz der Impulsabgabe = 12 Hz). </li><li> Verlassen Sie die Kapillare in Platz für 15 min, dann slowly (2-3 min) entfernen. Zart neu ausrichten, die Muskeln und die Haut zu nähen oben. Halten Sie die Muskeln und durch die Anwendung einiger Kochsalzlösung während des gesamten Verfahrens mit Feuchtigkeit versorgt. </li><li> Um Austrocknung zu vermeiden, subkutan injizieren 0,5 ml 0,9% NaCl. Halten Sie das Tier in einem Käfig erhitzt bis zur vollständigen Erholung von der Narkose. </li><li> Subkutan zu verabreichen Carprofen (5 mg / kg) täglich für 2-3 Tage nach der Operation. </li></ol> 2. Optische Fenster auf der Kleinhirnrinde HINWEIS: Der Farbstoff wird in 2 Wochen von der unteren olivary Kern bis zu der Kleinhirnrinde zu den CF-Terminals transportiert (siehe Abbildung 1). Die spärlich beschriftet CF kann unter der ständigen Schädelfenster, das wie folgt durchgeführt werden kann visualisiert werden: <ol><li> Sterilisieren Sie alle chirurgischen Instrumenten. </li><li> Betäuben die Maus wie oben beschrieben. Verwenden Zeh drückt, um das Tier zu überprüfen ist komplett sediert. </li><li> Rasieren Sie die Haare über den Kopf, wischen Sie die skMit alternierenden Seitenhiebe von 70% Alkohol und betadine und Augensalbe anwenden. Legen Sie die Maus in einem stereotaktischen Rahmen und die Position der Ohr Bars, um fest zu halten den Kopf. </li><li> Subkutan verabreichen Dexamethason (0,2 mg / kg) und Carprofen (5 mg / kg), um das Quellen des Gehirns und mögliche Entzündungen am kranialen Fenster Stelle zu verhindern. </li><li> Geben Sie einen Tropfen von Lidocain auf die Haut über dem Schädel und schneiden eine Klappe, zwischen den Ohren über den Augen. Bewerben Lidocain-Lösung wieder auf die Knochenhaut vor Kratzen mit einem Skalpell. </li><li> Verwenden Sie den Zahnbohrer dünne einem halbkreisförmigen Bereich von Schädel über dem Kleinhirn. Das Fenster ist in der Regel zentral angeordnet und in Richtung der Rückseite Naht, so daß die Schädel Tiefe über den Umfang des Halbkreises fast konstant ist. Positionieren des Fensters, zu nahe an der Lambdanaht und Serienbohrungen über diese sehr dick Region kann zu einer Überhitzung des Gehirns und Bildung von Ödemen führen. </li><li> Bewerben blutstillSchwamm auf den Schädel im Falle von Blutungen. </li><li> Schnitt ein Deckglas in zwei Hälften mit Hilfe einer Rasierklinge und einer Pinzette. Überprüfen Sie, dass die Deckglas ist etwas größer als die Insel von Knochen und hat eine ähnliche Form, bevor Sie die Klappe der Knochen mit der Pinzette; wenn nicht, Umgestaltung der Deckglas oder wählen Sie einen anderen. Die Dura mater Berühren Sie nicht mit der Pinzette beim Zeichnen der Knochen. Vorsichtig legen die Deckglas auf die Dura. HINWEIS: Die Haftung der gesamten Oberfläche des Glases auf der Dura foretelling langlebige cranial Fenster. </li><li> Luftblasen unter dem Glas durch mehrmaliges Spülen mit Kochsalzlösung und Trocknen mit Wattestäbchen. Dies wird auch dazu beitragen, das Entfernen einige restliche Blut, das aus kleinen Kapillaren nach der Positionierung der Glas verschüttet werden könnte. Verschließen Sie die Fenster mit einer Mischung aus Acrylkleber und Zahnzement 30. </li><li> Halten Sie das Tier auf einem Heizkissen in einer Rückgewinnungskammer, bis es vollständig von der Narkose erholt. Nicht wiederdrehen Mäuse im Käfig, bis vollständig erholt; Lassen Sie sie nicht unbeaufsichtigt, bis sie das Bewusstsein wiedererlangt, um ausreichende Brustlage zu halten. </li><li> Subkutan zu verabreichen Carprofen (5 mg / kg) täglich für 2-3 Tage nach der Operation. </li></ol> 3. In Vivo Multi-Photonen-Laser-Axotomie <ol><li> Warten Sie 2-7 Tage von der Operation vor der Durchführung der ersten Bildgebungssitzung. Saphir-Laserquelle (120 fs Breite Impulse, 90 MHz Repetitionsrate), die durch ein Paar von Galvanometerspiegel zuerst gescannt und fokussiert auf die Probe durch ein Eintauchen in Wasser 20X dann: Die speziell angefertigten Zwei-Photonen-Mikroskop verwendet, hier wird mit einem Ti bereitgestellt Ziel (NA 0,95, WD 2 mm). Ein Closed-Loop-Piezotisch führt axialen Verschiebungen bis zu 400 um von dem Ziel. Photomultiplier sammeln das Fluoreszenzsignal. </li><li> Anesthetize das Tier, dann positionieren Sie den Kopf in den stereotaktischen Halter, dass die Schädelfenster legt parallel zur Objektivierungve Brennebene. </li><li> Erkunden Sie mit TPF Abbildung der Hirnrinde unter der Schädelfenster. Wählen Sie das Axon bis zu den hellsten beschädigt werden. </li><li> Erwerben eine Z-Stapel (in der Regel das Sichtfeld 100 × 100 &amp;mgr; m 2 bei 512 x 512 Pixel, 2 um z-Achse Schritt), um eine 3D-Rekonstruktion der Ziel Axon erhalten. Innerhalb des abgebildeten Volumens, wählen die Läsion auf einem Zweig, der axonalen meist parallel zu der Brennebene liegt. Diese Ausrichtung ermöglicht es, schnell punkten morphologische Veränderungen, die prädiktiv für eine erfolgreiche Präparation sind. </li><li> Bestrahlung mit einer hohen Energiedosis ausgewählten Punkt auf einem distalen Abschnitt einer CF. Dies wird durch die Labview-Software durchgeführt: Erhöhung der Laserleistung 5-10x mehr als die Leistung für die Bildgebung (≈ 300 mW, nach dem Objektiv gemessen wird) verwendet wird, stellen Sie die Position der galvanometrische Spiegel, eine Zeilen tun (~ 4 - 10 um) am Ort der Läsion, und öffnen Sie den Laser Shutter für 400 bis 600 ms. Richten Sie die Zeilensenkrecht auf der CF-Ebene komplett durchschneiden das Axon. Bestrahlung heller Flecken (z. B.., Krampfadern) hilft in der Regel zerlegt das Axon. Die Wellenlänge der Laser Axotomie ist der gleiche für die Bildgebung (920 nm) verwendet. </li><li> Gewöhnlich vorübergehend die Fluoreszenz des Axons im bestrahlten Bereich nimmt aufgrund Bleichen. Erwerben einen Stapel der Region paar Minuten nach der Bestrahlung, um sicherzustellen, dass die Ablation erfolgreich durchgeführt worden. Wenn die Region begonnen Schwellung und das Axon gebildet wulstartige Strukturen hat die Neuronen erfolgreich seziert. In diesem Fall wird in einigen Stunden (von einigen zehn Minuten bis 24 h), der distale Abschnitt des Axon degeneriert und verschwinden vollständig. </li><li> Leider ist die Energiedosis erforderlich, um eine vollständige Axotomie zu produzieren, ist nicht immer vorhersehbar. Wenn das einzige Ergebnis der Bestrahlung Photobleichen, sollte die Fluoreszenz schnell durch Diffusion Farbstoff gewonnen werden, und die Bestrahlung soll nochmals wiederholt werden, um wirksamely sezieren die Axon. Auch in dem Fall Anzeichen von Schwellung nicht innerhalb von 5 erscheinen - 20 min, oder die Schwellung wird durch Erholung folgt (. Analog zu dem, was für die Laser dendrotomy beschrieben, siehe Allegra Mascaro et al 23), versuchen Sie es mit neuen Scans die Erhöhung der Verweilzeit und / oder der Laserleistung. </li><li> Überwachen Sie den eventuellen Umbau des Axons in den Laser-Axotomie, die die mit Zwei-Photonen-in-vivo-Bildgebung folgenden Tagen (Abbildungen 2 und 3). Das Gefäßmuster als Referenzmuster verwendet, um die seziert Axon in den folgenden Tagen abzurufen. </li><li> Subkutan zu verabreichen Carprofen (5 mg / kg) jeder Bildgebungssitzung für die gesamte Dauer des Experiments. </li></ol>

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Wir haben nichts offenzulegen.

Dieses Protokoll zeigt, wie Neuronen der unteren Olive mit einem Fluoreszenzfarbstoff zu markieren. Anschließend wird das Verfahren zur Herstellung eines Schädel Fenster auf der Kleinhirnrinde zuführen beschrieben. Diese Technik stellt einen optischen Zugang zu dem Anschlussabschnitt der olivocerebellar Neuronen, die Kletterfasern. Leider ist das Ergebnis sowohl der Kennzeichnung und Schädelchirurgie auch in den Händen von Facharbeitern recht niedrig (in der Regel 1 von 3 Mäusen markiert ist, und 1 von 3 Schädelfenster ...

Axonalen Durchtrennung von mechanischen Verletzungen toxischen Insult oder neurodegenerativen Erkrankungen resultiert, wird gewöhnlich durch die Degeneration des distalen Teils des Axons, die von dem Zellkörper 10-13 gelöst wird, gefolgt. Mit wenigen Ausnahmen 2,7,14,15 sind getrennt Axone im ZNS von erwachsenen Tieren in der Regel nicht in der Lage, ein Nachwachsen Programm 16 zu aktivieren. Wenig ist über die Echtzeit-Dynamik von degenerativen Ereignisse auf zellulärer und subzellulärer Ebene bekannt. Die Entwicklung neuer Strategien zur Begrenzung neuronalen Schäden und Förderung der neuronalen Nachwachsen erfordert, als einen ersten Schritt, die Klärung der Mechanismus, mit dem einzigartig verletzten Nervenzellen degenerieren und zu regenerieren. Diese Studie wird am direktesten durch die Überwachung der Dynamik eines einzelnen Neurons in vivo gerichtet. Beim Ein-Photonen-Fluoreszenz-Imaging-Techniken durch intensive Streuung des sichtbaren Lichts beschränkt, tief kortikalen Schichten in li erreicht Zweiphotonenanregungve Mäuse mit subzellulärer Auflösung 3,4,17. Unter Ausnutzung von transgenen Mäusen, bei denen fluoreszierende Proteine ​​werden selektiv in Subpopulationen von Neuronen 18-20 ausgedrückt hat TPF-Mikroskopie zur Erforschung der synaptischen Plastizität und axonalen Dehnung während der Entwicklung in vivo 21,22 angewandt. T er Fähigkeit der geschädigten Neuronen einzeln zu nachwachsen nach Verletzung kann durch Kopplung in-vivo-Überwachung von Zwei-Photonen-Bildgebung mit einem Modell der Schädigung spezifisch an das Axon von Interesse gezielt untersucht werden. Multi-Photonen-Absorption von Femtosekundenpulsen verwendet wurde, um einzelne Dendriten oder auch Einzel Stacheln 5,23 stören. Darüber hinaus ermöglicht diese Verletzung Paradigma Schneiden Einzel axonalen Verzweigungen, ohne dass der Kontakt mit Dendriten-6. Im Rahmen der sezieren die Funktionen, die spezifischen neuronalen Population zu ermöglichen, ihre Axone zu regenerieren einmal beschädigt, Kleinhirnkletterfasern (CF) sind ein nützliches Modell since sie bemerkenswerte Kunststoffeigenschaften nach der Verletzung auch bei erwachsenen Tieren 24,25 zu behalten. Kürzlich, langfristige Darstellung von CF zeigten, dass diese Axone sind in der Lage, die in den nachwachsenden Laser-Axotomie 6 Tagen folgen. Dieses Protokoll beschreibt, wie olivocerebellar Neuronen und ihre axonalen Dehnung durch anterograde Tracing zu beschriften. Sobald die Neuronen von Interesse fluoreszierend markiert sind, können sie wiederholt an beliebigen Zeitpunkten für Wochen oder Monate nach einer Schädelfenster überwacht werden. Das Verfahren, um einzelne axonalen Verzweigungen durch Laser-Axotomie in vivo sezieren wird dann dargestellt werden. Die hier vorgestellten Techniken bieten neue Einblicke in den Mechanismus der axonalen Umbau in vivo und können die Entwicklung von therapeutischen Strategien helfen, neuronale Degeneration zu begrenzen und zu fördern axonale Nachwachsen.

<table><tbody><tr><td>Laborstandard stereotaktisch, Ratte und Maus</td><td>Stoelting&nbsp;</td><td>51670</td><td></td></tr><tr><td>Borosilikatglas mit Filament</td><td>Sutter Instrument Inc</td><td>BF100-50-10</td><td></td></tr><tr><td>Germinator 500 (Glasperlensterilisator)</td><td>Roboz</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microinjection Dispense System</td><td>Picospritzer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rundes Deckglas mit kleinem Durchmesser, #1 Dicke, 3 mm, 100er Pack (CS-3R)</td><td>Warner Instruments&nbsp;</td><td>64-0720</td><td></td></tr><tr><td>Ti:Saphir-Laser, 120 fsec breite Pulse, 90 MHz Wiederholrate</td><td>Kohärentes</td><td>Chamäleon&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Spongostan, hämostatischer Schwamm</td><td>Ferrosan</td><td>MS0005</td><td></td></tr><tr><td>Galvanometrische Spiegel&nbsp;</td><td>GSI Lumonics</td><td>VM500+</td><td></td></tr><tr><td>Objektiv</td><td>Olympus</td><td>XLUMPLFLN 20XW</td><td></td></tr><tr><td>Piezoelektrischer Tisch&nbsp;</td><td>Physik Instrumente</td><td>P-721</td><td></td></tr><tr><td>Photomultiplier Module&nbsp;</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td>H7710-13</td><td></td></tr><tr><td>LabVIEW Systemdesign-Software</td><td>National Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Voren, 1 mg/ml (Dexamethason-21-isonicotinat)</td><td>Boheringer Ingelheim</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rymadil (Carprofen)&nbsp;</td><td>Pfizer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lidocain Clorohydrat 2%ATI</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Alexa488 Dextran</td><td>Life Technologies</td><td>D22910</td><td></td></tr></tbody></table>

laser-nanochirurgie der kleinhirn-axone<em&gt; in vivo</em

Laser Nanosurgery of Cerebellar Axons In Vivo

Nur wenige neuronale Populationen im zentralen Nervensystem (ZNS) erwachsener Säugetiere zeigen ein lokales Nachwachsen nach der Dissektion ihres Axons. Um den Mechanismus zu verstehen, der die neuronale Regeneration fördert, ist eine eingehende Analyse der neuronalen Typen erforderlich, die sich nach einer Verletzung umgestalten können. Mehrere Studien zeigten, dass geschädigte Kletterfasern auch bei erwachsenen Tieren nachwachsen können1,2. Die Untersuchung der Zeitrafferdynamik der Degeneration und Regeneration dieser Axone in ihrer komplexen Umgebung kann durch Zeitraffer-Zwei-Photonen-Fluoreszenz-Bildgebung (TPF) in vivo durchgeführt werden 3,4. Diese Technik wird hier mit der Laserchirurgie kombiniert, die sich als hochselektives Werkzeug erwies, um fluoreszierende Strukturen im intakten Mauskortex5-9 zu stören.
Dieses Protokoll beschreibt, wie TPF-Zeitraffer-Bildgebung und Laser-Nanochirurgie einzelner axonaler Äste im Kleinhirn in vivo durchgeführt werden. Olivozerebelläre Neuronen werden durch anterograde Verfolgung mit einem dextran-konjugierten Farbstoff markiert und dann durch TPF-Bildgebung durch ein Schädelfenster überwacht. Der terminale Teil ihrer Axone wird dann durch Bestrahlung mit einem Ti:Saphir-Laser bei hoher Leistung präpariert. Die Degeneration und das mögliche Nachwachsen des geschädigten Neurons werden in den Tagen nach der Verletzung durch TPF-In-vivo-Bildgebung überwacht.

Dieses Protokoll beschrieben, wie axonalen Etikettierung, in-vivo-Imaging und Laser-Axotomie an einzelnen Nervenzellen durchzuführen. Die Zeitachse des Experiments ist in Fig. 1 gezeigt. Ein Beispiel für CF mit Alexa Fluor 488 Dextran markiert und unter der Schädelfenster in vivo Zweiphotonenmikroskopie sichtbar ist in Abbildung 2 dargestellt. Wie bereits berichtet 6,27, zeigen die aufsteigenden Äste eine hohe Stabilität in der g...

Zwei-Photonen-Imaging, Laser Nanodissektions gekoppelt ist, sind nützliche Tools, degenerativen und regenerativen Prozessen im zentralen Nervensystem mit subzellulärer Auflösung zu studieren. Dieses Protokoll zeigt, wie beschriften, Bild-und sezieren einzigen Kletterfasern in der Kleinhirnrinde in vivo.

Laser-Nanochirurgie der Kleinhirn-Axone<em&gt; In Vivo</em

Only a few neuronal populations in the central nervous system (CNS) of adult mammals show local regrowth upon dissection of their axon. In order to ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, den Mechanismus zu untersuchen, durch den einzelne verletzte Nervenzellen degenerieren und regenerieren, indem die Dynamik eines einzelnen dissezierten Neurons in vivo überwacht wird. Dies wird erreicht, indem zunächst eine Untermenge von inferioren Aryneuronen und ihre axonalen Verlängerungen durch anterograden Tracer nachgewiesen werden. Der zweite Schritt besteht darin, ein Schädel Fenster am Kleinhirnrinde anzulegen, um die Kletterfasern zu beliebigen Zeitpunkten wiederholt unter dem Schädel Fenster zu beobachten. Nächster Schritt: Einzelne axonale Zweige in vivo durch Laser-Axotomie präparieren. Der letzte Schritt besteht darin, die Degeneration und anschließende Umgestaltung des Axons in den Tagen nach der Laser-Exzision mittels Zwei-Photonen-In-vivo-Bildgebung zu überwachen. Einer der Hauptvorteile der Verwendung der Laser-Zwei-Photonen-Axotomie liegt in ihrer äußerst hohen Spezifität.Sie können sogar einen einzelnen Dorn ablätieren, während ein massiver Schaden vorliegt. Zu diesem Zeitpunkt sind Sie nicht in der Lage, einen präzisen Bereich zu ablätieren. Darüber hinaus können Sie mit der In-vivo-Bildgebung in diesem F

laser-nanosurgery-of-cerebellar-axons-in-vivo

Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Dieses Video beschreibt die Manipulation von kultivierten Neuronen mittels Laser-Pinzette in vitro.

Mit Laser-Pinzette zur Manipulation isolierter Neuronen In Vitro

Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Montage Zebrafischembryonen für langfristige Bildgebung, Zwei-Photonen-Imaging-und Gewebe-Schaden Techniken und Zeitraffer-konfokale Bildgebung.

Zwei-Photonen-Axotomie und Zeitraffer-konfokale Bildgebung in lebenden Zebrafisch-Embryonen

In-vivo-Laser Axotomie in C. elegans

Laser Axotomie gefolgt von Zeitraffer-Imaging ist eine sensible Art und Weise zum Testen der Auswirkungen von Mutationen...

Der Aufbau eines Low-Budget-Laser Axotomie System, um Axon Regeneration in Study C. elegans</em

Dieses Video beschreibt die Methode zur Verletzung von Axonen in Zebrafischembryonen mit Hilfe der Zwei-Photonen-Laser-Axotomie und der Beobachtung der axonalen Erholung von Verletzungen.

Zwei-Photonen-Laser-Axotomie: Eine Methode zur Verletzung von Axonen in Zebrafischembryonen und zur Beobachtung der axonalen Erholung

Wir präsentieren ein Protokoll, das Zwei-Photonen-Anregungs-Zeitraffermikroskopie verwendet, um gleichzeitig die Dynamik von Axon- und Myelinverletzungen in Echtzeit zu visualisieren. Dieses vorgeschlagene Protokoll ermöglicht die Untersuchung sowohl intrinsischer als auch extrinsischer Faktoren, die das Schicksal des zentralen myelinisierten Axons nach einer Verletzung beeinflussen und zu einer dauerhaften klinischen Behinderung beitragen können.

Ein Ex vivo Laser-induzierte Rückenmarksverletzungen Modell zu Mechanismen der axonalen Degeneration Beurteilen Sie in Echtzeit

Wir beschreiben eine Technik, um Neuronen und ihre Prozesse über anterograden oder retro Tracer Injektionen in Hirnkernen unter Verwendung eines in vitro-Präparat zu bezeichnen. Wir modifiziert eine vorhandene Methode der i n vitro Tracer Elektroporation durch die Nutzung von fluoreszenzmarkierte Mausmutanten und grundlegende optische Geräte, um die Kennzeichnung Genauigkeit zu erhöhen.

Lasergelenkte neuronale Tracing in Brain Explantate

Hier präsentieren wir ein Protokoll mit der Drosophila sensorischen Neuron - dendritischen Arborization (da) Verletzungen Modell Neuron, das in Vivo verbindet live imaging, zwei-Photonen-Laser Axotomie/Dendriotomy und die mächtigen fliegen genetische Toolbox, als eine Plattform für das screening potenzieller Projektträger und Inhibitoren der Neuroregeneration.

Eine Drosophila In Vivo Verletzungen Modell für das Studium Neuroregeneration in den peripheren und zentralen Nervensystems

Laserablation ist eine weit verbreitete Technologie zur Untersuchung der Regeneration in biologischen Systemen. Das vorgestellte Protokoll beschreibt den Einsatz eines Standard-Laserscanning-Konfokalmikroskops zur Laserablation und anschließender Zeitraffer-Bildgebung regenerierender Interneuromastzellen in der Zebrafisch-Seitenlinie.

Konfokale Mikroskop-basierte Laserablation und Regenerationstest in Zebrafisch Interneuromastzellen

Dieses Protokoll demonstriert die Laserzellablation einzelner Neuronen in intakten Drosophila-Larven . Die Methode ermöglicht es, die Wirkung der Verringerung der Konkurrenz zwischen Neuronen im sich entwickelnden Nervensystem zu untersuchen.

Laserzellablation in intakten Drosophila-Larven zeigt synaptische Konkurrenz

Um die Regulierung des zerebralen Blutflusses in vivo zu untersuchen, sind traditionelle pharmakologische Methoden invasiv und schädigen oft den Schädel, die Dura und die Leptomeninge. In dieser Arbeit haben wir eine minimal-invasive Technik entwickelt, die die Nanoinjektor-gesteuerte intrazisternale Magna (ICM) Injektion mit Laser-Speckle-Kontrastbildgebung kombiniert, um die Integrität des Schädels und der Leptomeninge zu erhalten.

Gepaarter Cisterna Magna Nanoinjektions- und Laser-Speckle-Kontrastbildgebungs-Assay zur Untersuchung der Regulierung des zerebralen Blutflusses in vivo

Lernen Sie die Laser-Nanochirurgie von Kleinhirn-Axonen in vivo mit Zwei-Photonen-Bildgebung. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung degenerativer und regenerativer Prozesse im ZNS.

Laser-Nanochirurgie der Kleinhirn-Axone

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