MALDI-Imaging-Massenspektrometrie zur Untersuchung von Metaboliten in Medicago truncatula Wurzelknöllchen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine zuverlässige, multimassenspektrometrische Bildgebung von kleinen Molekülen im pflanzlichen Wurzelgewebe durchzuführen. Dies wird erreicht, indem zunächst die Gewebeproben auf die entsprechende Größe vorbereitet werden. Der zweite Schritt besteht darin, die maldi-Matrix zu optimieren und auf die Gewebeprobe aufzubringen.

Als nächstes wird die Probe Maldi unterzogen, MSI und Spectra werden über das Gewebe gesammelt. Der letzte Schritt ist die Datenverarbeitung, bei der biologisch wichtige Analyten identifiziert werden können. Letztendlich wird MALDI MSI verwendet, um endogene Metaboliten nachzuweisen, die in Wurzelknöllchen von Hülsenfrüchten vorhanden sind.

Diese Methode kann Einblicke in die im Wurzelgewebe von Pflanzen vorhandenen Metaboliten geben, aber auch auf die Untersuchung kleiner Moleküle und Gewebe aus anderen Modellsystemen angewendet werden, darunter Säugetiere, Krebstiere und mehr. Entnehmen Sie zunächst zuvor vorbereitete Pflanzengewebeproben aus dem minus 80 Grad Celsius warmen Gefrierschrank. Schneiden Sie dann den Kryostatenbecher aus Kunststoff ab und schneiden Sie die überschüssige Gelatine ab, montieren Sie das eingebettete Gewebe mit einer Cent-großen Menge optimaler Schneidtemperatur oder OCT-Medium auf ein Kryostat-Futter, ohne dass das OCT das Gewebe berührt.

Stellen Sie das Kryostatfutter in eine Kryostatbox, die auf minus 20 Grad Celsius eingestellt ist, bis das OCT erstarrt. Nachdem Sie das Spannfutter und die Gelatine etwa 15 Minuten lang in der Kryostat-Box ausgleichen ließen, verwenden Sie den Kryostaten, um das Gewebe auf etwa die Dicke einer Zelle zu schneiden. Montieren Sie dann mit dem Daumen jede Scheibe auf dem vorgekühlten Objektträger, indem Sie die unbeschichtete Seite des Objektträgers auf dem Handrücken erwärmen.

Legen Sie dann die ITO-beschichtete Seite des warmen Objektträgers in die Nähe der gefrorenen Gewebescheibe und lassen Sie die Scheibe auf dem Objektträger kleben, um die MALDI-Matrix mit Airbrush aufzutragen. Reinigen Sie den Airbrush-Lösungsbehälter und die Düse gründlich mit Methanol und füllen Sie den Lösungsbehälter mit DHB-Matrixlösung. Halten Sie die Airbrush etwa 35 Zentimeter von der Probe entfernt und tragen Sie 10 bis 15 Schichten Matrix auf die Oberfläche des Objektträgers auf, wobei Sie zwischen jeder Schicht 10 Sekunden sprühen und 30 Sekunden trocknen müssen.

Wenn Sie fertig sind, reinigen Sie die Airbrush gründlich mit Methanol, um Verstopfungen zu vermeiden. Aufgrund der Matrixlösung ist es wichtig zu beachten, dass Airbrushes zwar leichter verfügbar sind, automatische Matrixsprühsysteme jedoch oft eine gleichmäßigere und reproduzierbare Matrixabdeckung für den Sublimationsauftrag der maldi Matrixx erzeugen, die 300 Milligramm DHB in den Boden der Sublimationskammer einwiegen. Kleben Sie den Objektträger mit den Gewebeabschnitten nach unten mit doppelseitigem leitfähigem Klebeband an den kalten Finger. Schneiden Sie die Folie ab, wenn sie zu groß ist.

Für die Sublimationskammerklemme Sie die obere und untere Hälfte der Sublimationskammer zusammen mit der C-Klemme. Stellen Sie dann die Sublimationskammer in eine Heizhaube, die Raumtemperatur hat. Schließen Sie das Vakuum an und geben Sie Eis in kaltem Wasser in den oberen Behälter.

Warten Sie nach dem Einschalten der Vakuumpumpe 15 Minuten und schalten Sie die Heizhaube ein. Schalten Sie nach 10 Minuten die Hitze aus, schließen Sie das Ventil für das Vakuum und schalten Sie die Vakuumpumpe aus. Sobald die Kammer auf Raumtemperatur abgekühlt ist, öffnen Sie das Ventil, lassen Sie den Vakuumdruck ab und entnehmen Sie die Probe.

Markieren Sie als Nächstes mit dem Korrekturflüssigkeitsstift ein Plusmuster an jeder Ecke der Probe, das als Teach-Punkte verwendet werden soll. Legen Sie den Objektträger in die Maldi Objektträger-Adapterplatte und machen Sie mit einem Scanner ein optisches Bild der Probe. Überprüfen Sie das Bild auf dem Computer und drehen Sie das Bild, sodass es auf dem Bildschirm angezeigt wird.

In der gleichen Ausrichtung wird die Probe in das Gerät gelegt. Richten Sie mit der vom Gerätehersteller bereitgestellten Software eine Bildaufnahmedatei mit einer Rasterschrittweite von 50 Mikrometern und einem Laserdurchmesser ein, der gleich oder kleiner als die Rasterschrittweite der Augen ist. Laden Sie an dieser Stelle das optische Bild in die Software und richten Sie die Platte an dem optischen Bild aus.

Geben Sie nach der Kalibrierung des Instruments die Gewebebereiche an, die mit MSI analysiert werden sollen, einschließlich eines Flecks reiner Matrix auf dem Objektträger, der als Blindwert verwendet werden soll. Beginnen Sie anschließend mit der Erfassung nach der Datenerfassung, öffnen Sie die Bildgebungsdatei in der vom Hersteller bereitgestellten Software und extrahieren Sie die Ionenbilder, indem Sie ein bestimmtes Masse-Ladungs-Verhältnis aus dem Massenspektrum auswählen. Erstellen Sie mit der Software eine Liste spezifischer Analyten, die für die weitere Identifizierung von Interesse sind.

Führen Sie eine genaue Massendatenbanksuche durch, um mutmaßliche Identifikationen für die Zielanalyten zu ermitteln. Um die mutmaßlichen Identifizierungen aus einer genauen Massendatenbanksuche zu bestätigen, stimmt die MS aus den Zielanalyten mit den msms-Spektren von Standards, Literatur und/oder Fragmentierungsvorhersagesoftware überein

Hier ist ein optisches Bildbeispiel für die Matrixabdeckung und die Kristallgrößen mit Airbrush, automatischem Sprühgerät bzw. Sublimation. Bei der Airbrush-Anwendung werden große und kleine Kristalle erzeugt. Während bei der automatischen Sprühmethode kleine, gleichmäßig große Kristalle erzeugt werden, entsteht bei der Sublimation eine gleichmäßige Matrixschicht.

Herkömmliche Matrizen wie DHB erzeugen viele Ionen im unteren Massenbereich unter 500 Dalton. Diese Matrixionen können den Nachweis von Metaboliten in diesem Bereich beeinträchtigen. Hier sind die MS-Spektren nur der DHB-Matrix im Vergleich zu Wurzelknötchengewebe, das mit der DHB-Matrix beschichtet ist, dargestellt.

Matrix-Peaks können anhand der MS-Bilder von echten Metaboliten unterschieden werden. Wenn ein Peak angeklickt wird, wird das Ionenbild extrahiert und mit dem optischen Bild überlagert angezeigt. Diejenigen Peaks, die Bilder mit eindeutiger Lokalisation zum Gewebe erzeugen und nicht in der Matrix vorhanden sind, werden als Metaboliten betrachtet: Hier sind einige repräsentative Ionenbilder von Metaboliten, die im Wurzelknötchengewebe gefunden wurden.

Während Beispiele von MS-Bildern, die matrixbezogenen Peaks entsprechen, hier abgebildet sind, zeigt dieses Bild eine deutliche Lokalisation im Wurzelknötchengewebe und einen Signalmangel im einzigen Matrixbereich, der abgebildet wurde. Dieses Signal ist wenig lokalisiert und über das gesamte Gewebe vorhanden. Das Signal ist auch nur in dem Matrixbereich zu sehen, der abgebildet wurde.

Das Endziel von ungezielten Metabolomik-Experimenten besteht darin, biologisch wichtige Analyten zu erkennen und zu bestimmen und die interessierenden Verbindungen zu identifizieren. Ein Beispiel für einen der Metaboliten, die mit MSI und LCMS nachgewiesen wurden, ist hier dargestellt. Dieser Metabolit wurde auf der Grundlage der genauen Masse, die mit hochauflösendem LCMS und dem MSM-MSS-Spektrum erfasst wurde, als Häm identifiziert.

Diese MSMS-Daten wurden mit den zuvor von Shima und Sato veröffentlichten MSM S-Spektren verglichen, wobei die beiden MSM S-Spektren übereinstimmen. Daher wurde die Identität des Masse-zu-Ladungs-Verhältnisses von 6 1 6 0,2 auf der Grundlage der genauen Massendatenbanksuche und der Ms.MS von Daten im Vergleich zu Literatur Ms.MS Daten sicher als Häm zugeordnet. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie maldi, die massenspektrometrische Bildgebung, einsetzen können, um die räumliche Verteilung biologisch relevanter Metaboliten mit einer Methode zu erkennen und zu kartieren, die auf die Untersuchung kleiner Moleküle in einer Vielzahl von Gewebetypen und Modellsystemen angewendet werden kann.