Name: Nanomanipulation von RNA-Einzelmoleküle durch Optische Pinzetten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 59 s
Description: Lernen Sie die Nanomanipulation von RNA-Einzelmolekülen durch optische Pinzetten zur Untersuchung von Faltungsmechanismen. Diese Methode ermöglicht präzise Analysen sekundärer und tertiärer Strukturen.

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Diese Arbeit wurde durch einen NSF-Zuschuss (MCB-1054449) und einen kollaborativen interdisziplinären Pilot Research Program Award vom RNA Institute an der University at Albany an PTXL unterstützt.

1. Vorbereitung von RNA-Molekülen für Einzelmolekül-zupfen <ol><li> Klonieren der Sequenz von Interesse. Klonierung der DNA-Sequenz, die dem RNA-Struktur in einen Vektor. </li><li> Synthese und Reinigung der Transkriptionsvorlage. Synthetisieren eine Transkription Vorlage durch PCR. [Ort Tabelle 1 hier] nächstes reinigen die PCR-Produkte mit Hilfe eines PCR-Reinigungs-Kits, und konzentrieren sich die Probe auf&gt; 200 ng / ul. Weil die gereinigte DNA wird für die Transkription verwendet wird, sollte RNase freies Wasser in den Elution und Konzentration verwendet werden. </li><li> In-vitro-Transkription. Synthese von RNA durch in vitro-Transkription bei 37 ° C über Nacht, um RNA-Ausbeute zu maximieren. [Ort Tabelle 2 hier] Nach der Transkription, fügen 1 ul DNase I, um die DNA-Vorlage für 15 min bei 37 ° C zu verdauen. Reinige den RNA unter Verwendung einer Silica-Spin-Säule. </li><li> Synthese der biotinylierten Griff A. Erste, produzieren die unveränderte Griff A durch PCR unter Verwendung von Primern Af und Ar und konzEntrate die amplifizierte DNA auf&gt; 200 ng / ul. Als nächstes übernehmen Biotin-Modifikationen in den PCR-Produkt mit einer Primer-Extension-Reaktion. [Ort Tabelle 3 hier] HINWEIS: Das biotinylierte Griff A (Biotin-HA) können direkt in der Annealing ohne Reinigung verwendet werden. Wie das Biotin-HA mit RNA geglüht werden, ist es entscheidend, RNase-freiem Wasser in beiden Stufen zu verwenden. </li><li> Synthese der Digoxigenin-modifizierten Griff synthetisieren B. Digoxigenin durch PCR modifiziert Griff B (dig-HB) unter Verwendung von Primer Bf und Digoxigenin-modifizierten Oligo Dig-Br (3). Nächsten, reinigen das PCR-Produkt und konzentrieren sich die Probe auf&gt; 200 ng / ul. </li><li> Annealing-RNA an den Griffen. Glühen die RNA mit Griffen. [Ort Tabellen 4 und 5 hier] </li><li> Reinigen geglüht Probe. Hinzufügen 3 Volumen Ethanol der wärmebehandelten Probe und gut mischen. Speichern der Mischung bei -70 ° C für mindestens 1 Stunde. Spin-Down bei 15.800 xg und Überstand verwerfen. Trocknen Sie die Pellets mit einer Gefriertrocknungsanlage. Das Pellet in100 ul RNase freiem Wasser. ANMERKUNG: Die Probe kann nun verwendet werden kann und bei -20 ° C gelagert werden. </li></ol> 2. Kalibrierung und Betrieb der optischen Pinzette <ol><li> Kalibrieren Pixelgröße von Video-Monitor <ol><li> Verwenden Sie den optischen Falle zu fangen eine Perle mit bekanntem Durchmesser (Größe Standard). </li><li> Machen Sie Bilder der gefangenen Perle mit Imaging-Software (Abbildung 4). </li><li> Bestimmung der Durchmesser der Kugel mit der Bildverarbeitungssoftware auf der Basis der Schwerpunktmethode. </li><li> Wiederholen Sie diesen Vorgang zu einem Durchmesser von Perlen unterschiedlicher Größe zu bestimmen. </li><li> Passen die gemessenen und bekannten Durchmesser der Kügelchen durch eine lineare Regression auf die physikalische Grße eines Pixels zu erhalten. </li></ol></li><li> Stellen Sie sicher, Entfernung Kalibrierung <ol><li> Verwenden Sie den optischen Falle zu fangen eine Perle. </li><li> Bestimmt die Pixelposition seines Schwerpunkts von der Bildaufnahmesoftware und notieren Sie die Position mit den Minitweezers. </li><li> Steuern die Wulst zu DIFFe<html> mieten Positionen und wiederholen Sie die Positionsbestimmung. </li><li> Konvertieren der X und Y-Positionen des Wulstes von Pixeln m Einheit unter Verwendung des kalibrierten Pixelgröße. </li><li> Vergleichen der X und Y zwischen den Positionen von Video-und die Minitweezers gemessen. Die beiden Sätze von Werten sollten übereinstimmen. Als die Bildauflösung&gt; 0,1 um, bewegen Sie den Wulst über 1 um zwischen den Messungen, um die Genauigkeit zu gewährleisten. Wenn der Abstand Kalibrierung ist nicht vergleichbar mit dem in den Minitweezers gespeichert, kalibrieren Sie das Instrument. </li></ol></li><li> Trap Steifigkeit Kalibrierung <ol><li> Nehmen Sie ein Wulst mit der optischen Falle und halten Sie sie immer noch. </li><li> Notieren Sie die Kraft der Falle mit einem Bypass-schnelle Datenerfassung mit einer Geschwindigkeit&gt; 5 kHz für 3 Sekunden. </li><li> Erzeugen ein Leistungsspektrum von der Aufnahme der Wulst Bewegung mit der Software. Passen das Leistungsspektrum zu einer Lorentz (Abbildung 5) 38: 542 / 51542eq1.jpg &quot;width =&quot; 200 &quot;/&gt; (Gl. 1) in dem S (f) ist die Leistung bei der Frequenz f ist, f c die Grenzfrequenz, und S 0 die asymptotische Kraft. Die Eckfrequenz f c ist die Frequenz, bei der die Leistung des Wärmebewegung auf die Hälfte des asymptotischen Wert verringert. Als f c variiert mit Laserleistung und Korngröße, kalibrieren jeden gefangen Perle einzeln. </li><li> Berechnen Sie die Federkonstante der Falle, κ, von f c: <img alt="Gleichung 2" fo:content-width="1in" src="/files/ftp_upload/51542/51542eq2.jpg" width="100" /> (Gl. 2) in dem γ ist der Widerstandskoeffizient des Wulst (Gl. 3). Verwenden Sie die Federkonstante Erweiterung Änderungen eines RNA aus Kraftänderung zu bestimmen. </li></ol></li><li> Law Test-Stokes &#39; <ol><li> Nehmen Sie ein Wulst mit der optischen Falle. Bewegen des Wulstes hin-und Kraft mit unterschiedlicher Geschwindigkeit. </li><li> Notieren Sie sich die Bewegung der Raupe und Kraft mit den Minitweezers. </li><li> Berechnen des Radius des Wulstes. HINWEIS: Die Reibungskraft, F d, die durch die Bewegung eines kugelförmigen Teilchens in einer Flüssigkeit erzeugt wird, durch das Stokessche Gesetz beschrieben werden: <img alt="Gleichung 3" fo:content-width="1.5in" src="/files/ftp_upload/51542/51542eq3.jpg" width="150" /> (Gl. 3) wobei r der Radius der Kugel, v die Geschwindigkeit ist und h die dynamische Viskosität der Flüssigkeit, die in Referenztabellen zu finden ist. Verwendung der gemessenen Kraft F D, kann der Radius des Wulstes mit Gleichung berechnet werden. 3 (Figur 6) und ist mit dem von der Bildaufnahme-Software bestimmt zustimmen. Die Stokes &#39;Gesetz Test effektiv testet die Gesamt Kalibrierungen und die Leistung des Gerätes. </li></ol></li></ol> 3. Nanomanipulation von RNA-Einzelmolekülen <ol><li> Fluidik machen. <ol><li> Bohren sechs Löcher (2 mm Durchmesser) auf einem Deckglas Nr. 2 (7a) und schneiden Sie drei Schlitze (2 mm Breite) in doppelseitigen Klebeband Polyimid (Abbildung 7b) mit einem Laser-Graveur. </li><li> Machen Sie eine Flusskammer durch Zwischen zwei Deckglas mit zwei Schichten von doppelseitigen Klebeband Kapton. Legen Sie eine Mikropipette und zwei Bypassrohre zwischen dem Band (7c). </li><li> Die Flusskammer auf einem Metallrahmen zu montieren durch pass fluidischen Löcher (Abbildung 7d). </li><li> Verbinden der Fluidkanäle der Kammer auf 10 ml Spritzen mit Puffer der Wahl durch Polyethylenschläuche (7e) gefüllt. </li><li> Die gesamte Kammer Halterung auf der optischen Pinzette zwischen den beiden Zielen. Sicherzustellen, dass die Vorderseite der Kammer mit dem Fluidkanäle nach rechts zeigt. Ziehen Sie die richtige Ziel und die Messingstifte des Rahmens (7e) anschließen, um Befestigungslöcher auf Ter Pinzette. Schrauben anziehen, um die Kammer Position zu fixieren. </li></ol></li><li> Mischen der wärmebehandelten Probe und Perlen. Mischen Sie die Probe mit geglüht Anti-Digoxigenin-beschichteten Kügelchen (dig-Kugeln), und lassen Sie die Mischung bei Raumtemperatur für 5-10 min zu bleiben. Typischerweise wird 1 ul der wärmebehandelten Probe mit 5 ul DIG-Kügelchen in 1 ml Puffer gemischt. HINWEIS: Die Menge der Kügelchen in der Strömungskammer geladen werden, sollten so gewählt werden, um sicherzustellen, eine angemessene Menge der Kügelchen von der Umgehungsröhre geliefert werden. Das Verhältnis der wärmebehandelten Probe an die Perlen nicht leicht quantifiziert werden. Im Idealfall haben die meisten Kügelchen keine RNA, so dass nur ein kleiner Anteil der Perlen kann nur ein RNA-Molekül pro Kügelchen haben. Da die Proben geglüht und die Partikelsuspension schwer zu quantifizieren sind, ist die beste und einzige Möglichkeit derzeit, das Mischungsverhältnis variieren und testen Sie die Mischung auf der Pinzette. </li><li> Liefern Kügelchen zu der Reaktionsstelle in der Strömungskammer (dh wenige Mikrometer über der micropipette Spitze, 7c). <ol><li> Laden Sie eine Suspension von Streptavidin-beschichtete Beads (Perlen-Hals) in eine 1-ml-Spritze. </li><li> Verbinden Sie die Spritze mit der fluidischen Gasweg des unteren Kanal der Strömungskammer (Abbildung 7a). </li><li> Schieben Sie die Spritze mit dem Strep-Perlen in die Kammer fließen. </li><li> Bewegen Sie die gesamte Kammer mit Motorsteuersoftware, um die optische Falle in der Nähe der Öffnung des unteren Bypassrohr (7b) zu platzieren. Dann durch einen Trackball betreiben die optische Falle, um eine Streptokokken-Perle zu erfassen. </li><li> Bewegen der Wulst in der Nähe der Spitze der Mikropipette mit der Motorsteuerungssoftware. </li><li> Ziehen Sie die Spritze in die Mikropipette verbunden, um die Perle auf der Mikropipette saugen. </li><li> Gelten Strom sanft, indem Sie die Spritze mit dem Mittelkanal zu spülen, besonders Streptokokken-Perlen. </li><li> Ebenso liefern die Mischung der Probe und die DIG-Perlen (siehe Schritt 3.2) an den oberen Kanal der Kammer. </li><li> Nehmen Sie ein DIG-Wulst und bringen es nah an der Strep-Wulst mit der optischen Falle. </li><li> Reinigen Sie den mittleren Kanal, der durch die Anwendung Fluss. HINWEIS: Der Strep und DIG-Kügelchen werden so ausgewählt, um verschiedene Größen aufweisen, so dass sie optisch unter dem Mikroskopaufnahme unterschieden werden (Abbildung 4). </li></ol></li><li> Fishing &quot;ein Einzelmolekül-Tethering zwischen einem Paar von Perlen. <ol><li> Legen Sie die DIG-Wulst vertikal auf der Oberseite des Strep-Wulst (Abbildung 4). </li><li> Bewegen Sie die DIG-Wulst nach unten in Richtung der Streptokokken-Perle durch die Lenkung der Falle. Öffnen Sie ein Kraft-Weg-Diagramm-Fenster auf Computer, um Kraft Veränderungen sichtbar zu machen. </li><li> Beim Kontakt der beiden Perlen, bewegen Sie den DIG-Wulst senkrecht weg von der Strep-Perle. </li><li> Wenn keine spezifischen Kontakt gemacht wird, bleibt die Kraft, fast Null. Wenn die beiden Wülste von Molekülen verbunden ist, steigt die Kraft beträchtlich, wenn die beiden Wülste trennt. Dieses Verfahren, das allgemein als &quot;fishing&quot; bezeichnet wird, ist oft perfORMED mehrmals auf jedes Paar von Perlen, um eine effektive Einzelmolekül-Halteseil finden. </li></ol></li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

<html> Umbau und Fehlerbehebung in Vorbereitung der Proben Tweezing Wahl des Klonens von Vector. Obwohl die hier beschriebenen allgemeinen Schema (Figur 3) erfordert keine besondere Klonierungsvektor wird der Vektor bevorzugt, keine intrinsische T7 oder T3-Promotor für die Leichtigkeit der Transkription, so dass ein Promotor mittels PCR an den gewünschten Positionen eingebracht werden müssen. Reihenfolge und Länge der...

Die Entwicklung der optischen Pinzette Technik seit langem mit ihrer Anwendung in der biologischen Forschung begleitet. Wenn das optische Falleneffekt zuerst entdeckt wurde, beobachtet Arthur Ashkin, dass Bakterien in verunreinigtem Wasser kann an der Laserfokus 1 gefangen werden. Seitdem, Trapping Bakterien hat sich zu einem unbeabsichtigten, lustiges Experiment für Generationen von Studenten der Biophysik sowie eine ernsthafte Recherche-Tool, um mikrobielle Physiologie 2,3 studieren. Das optische Einfangen Technik verwendet fokussierten Laserstrahls, um einen mikroskopischen Objekt 1 immobilisieren. Praktisch wird ein Laserfalle als ein optischer Feder, die auch Maßnahmen Kraft (F) auf dem eingeklemmten Gegenstand durch die Verschiebung von der Mitte der Falle (AX). Innerhalb kurzer Reichweite, F = κ x AX, in κ die Federkonstante der Falle. Die optische Falle kann verwendet werden, um Kraft in Pikonewton (pN) Präzision, um ein Micros auszuübenkopische Objekt und messen ihre Position mit Nanometer (nm) Genauigkeit. In den vergangenen zwei Jahrzehnten haben optische Pinzette zu einem der am häufigsten verwendeten Einzelmolekültechniken in der Biophysik. Die Technik wurde verwendet, um das Falten und Mechanik der DNA 4-6, 7-9 RNA und Proteine ​​10,11 studieren. Optische Pinzetten wurden auch verwendet, um die DNA-Replikation 12 13 RNA-Transkription und Proteinsynthese 14,15 sowie viele andere biomolekulare Ereignisse 16-18 beobachten. In RNA Strukturforschung sind Einzelmolekül-Ansätze beschäftigt vor allem auf die robuste Klappenergielandschaft von RNA zu erkunden. Eine RNA-Sequenz kann in der Regel in mehrere stabile, sich gegenseitig ausschließende Strukturen falten, aufgrund der einfachen chemischen Zusammensetzung und Basenpaarung Regeln der RNA. Es ist seit langem bekannt, dass RNA strukturellen Polymorphismus, wie er in Riboswitches 19,20 auftritt, spielt eine wichtige Rolle bei der Genregulation. Ein Vor kurzet genomweite Umfrage hat ergeben, dass Temperaturschwankungen so gering wie ein paar Grad Struktur und die Proteinsynthese eines großen Teils des zellulären Transkriptoms 21 stark beeinflussen. Dieses Beispiel deutet an, dass die biologische Rolle von RNA-Faltung Alternative ist vielleicht noch wichtiger und durchdringend, als bisher angenommen. Struktur Polymorphismus jedoch eine Herausforderung für die traditionellen biochemischen und biophysikalischen Ansätzen, die durchschnittlichen Eigenschaften vieler Moleküle zu untersuchen. Zum Beispiel kann die &quot;An&quot; und &quot;Aus&quot;-Konformationen eines RNA-Schalter sich gegenseitig aus. Eine gemittelte Struktur von heterogenen Strukturen abgeleitet ist wahrscheinlich nicht eine der biologisch relevante Konformationen ähneln. Darüber hinaus untranslatierte RNA und mRNA bilden in der Regel Strukturen. Ihre Wechselwirkung mit Proteinen und regulatorischen RNAs häufig benötigt Entfaltung bestehende Struktur als Teil der Interaktion. Daher studieren RNA Entfaltung / Rückfaltung wird eine relevanteAusgabe von RNA Biologie. Um eine solche Herausforderung zu begegnen, hat die Einzelmolekül-Ansatz eingesetzt, um RNA-Struktur Polymorphismus durch das Studium ein Molekül in einer Zeit, 22-27 entwirren. Im Vergleich zu den beliebten Einzelmolekülfluoreszenzverfahren, Pinzette basierend mechanische Entfaltung bietet den Vorteil, dass Konformationen einzelner Moleküle können durch angelegte Kraft manipuliert werden und mit Nanometer-Präzision gemessen werden. Diese Nanomanipulationsfähigkeit kann verwendet werden, um das Aufklappen / Zusammenklappen der einzelnen strukturellen Domänen, so daß die hierarchische Falten eines großen RNA präpariert 28 werden überwacht. Alternativ kann ein einzelner Strang gerichtet, in eine von mehreren Konformere zu falten; oder eine bestehende Struktur mechanisch induziert werden, um in eine andere Konformation 29 falten. Unter biologischen Bedingungen kann eine RNA-Struktur bei Temperaturänderung oder die Ligandenbindung verändert werden. Die Fähigkeit direkt zu bearbeiten Molekular struktur öffnet eine neue Spielstätte der RNA-Struktur Studie. Grundsätzlich andere mechanische Techniken wie Rasterkraftmikroskop und magnetische Pinzette, können auch verwendet werden, um das Falten der einzelnen RNA-Moleküle zu untersuchen. Jedoch sind solche Anwendungen weitgehend aufgrund der relativ niedrigen räumlichen Auflösung 30 begrenzt. Der Einsatz von optischen Pinzetten können RNA-Strukturen, um durch mechanische Kraft entfaltet werden. Der Vorteil der mechanischen Entfaltung ist mehrfach. Kraft kann verwendet werden, um die sekundäre und die tertiäre Strukturen entfalten, wobei Metallionen und Liganden-induzierte Falten sind hauptsächlich tertiäre Strukturen beschränkt. Temperatur und Denaturierungsmittel kann erhebliche Auswirkungen auf die Aktivitäten von Wasser und gelöste Stoffe. Im Gegensatz dazu wird die Kraft lokal auf molekularer Strukturen stören aufgebracht; Die Krafteinwirkung auf die Umgebung vernachlässigbar ist. Darüber hinaus wird die thermische Schmelz besten verwendet, um das Falten der Thermodynamik von kleinen RNA-Strukturen zu untersuchen,wohingegen optische Pinzetten wurden verwendet, um RNA-Strukturen mit verschiedenen Größen zu untersuchen, die von einem Sieben-Basenpaar-Haarnadel Tetraloop 28 zu einem 400-Nukleotid-Ribozym 31. Ferner kann RNA-Strukturen mechanisch mesophilen Temperaturen entfaltet werden. Im Gegensatz zu RNAs in einem thermischen Schmelzexperiment zu entfalten, wird die Temperatur in der Regel deutlich über physiologischen Temperaturen, die deutlich erhöht RNA-Hydrolyse, insbesondere in Gegenwart von Mg 2 +-Ionen erhöht. Es ist wichtig zu beachten, dass die mechanische Wirkung der Kraft abhängig, wie es sich auf eine Struktur angewendet wird. Die aufgebrachte Kraft kippt die Falten Energielandschaft. Zum Beispiel, wenn eine Kraft auf eine Haarnadel aufgebracht wird, die Basenpaare nacheinander gebrochen, eine zu einem Zeitpunkt (Abbildung 1a). Die Rippen Gabel schreitet entlang der Schraubenachse, die senkrecht zu der aufgebrachten Kraft ist. Wenn dagegen eine minimale küssen Komplex ist unter Spannung, die beiden küssenBasenpaare, die parallel zu der aufgebrachten Kraft sind, teilen sich die Kraftbelastung (Abbildung 1b). Die unterschiedlichen Geometrien der Haarnadel und kissing Komplexes relativ zu der aufgebrachten Kraft infolge ihrer unterschiedlichen mechanischen Resonanz, die verwendet werden kann, um sekundäre und tertiäre Faltung 28,32 unterscheiden. Der theoretische Aspekt der mechanischen Entfaltung zuvor überprüft worden 8,9,30. Diese Arbeit werden die grundlegenden Ansätze zur Einrichtung und führen Sie eine Einzelmolekül-mechanische Entfaltung Assay. Versuchsaufbau. In unserem mechanisches Ziehen Experiment wurde die RNA-Probe für Pinzetten aus der RNA von Interesse durch zwei doppelsträngige DNA / RNA flankiert Griffe (2) 7. Das gesamte Molekül kann zwei oberflächenbeschichteten Mikrometergröße Kügelchen (Spherotech) über Streptavidin-Biotin-und Digoxigenin-anti-Digoxigenin-Antikörper-Wechselwirkungen bzw. angebunden werden. Einem Wulst wird durch einen Kraftmess optischen tr gehaltenAP, während die andere an der Spitze einer Mikropipette gehalten. Der relative Abstand zwischen den Kügelchen können entweder durch die Steuerung der Falle oder Bewegen der Mikropipette geändert werden. Mit diesem Ansatz kann ein einzelnes RNA-Molekül Tethering die Perlen gedehnt und entspannt werden. Herstellung der Proben. Die Synthese von RNA-Proben zum Zupfen beinhaltet einige Schritte (Abbildung 3). Zuerst wird die DNA-Sequenz, die dem RNA von Interesse zuerst in einen Plasmidvektor kloniert. Als nächstes werden drei PCR Reaktionen durchgeführt, um die zwei Handgriffe und eine Vorlage für die Transkription zu erzeugen. Die Transkription Vorlage umfasst die Griff Regionen und die eingefügten Sequenzen. Der Volllängen-RNA wird durch in vitro-Transkription synthetisiert. Zuletzt werden die RNA und chemisch modifizierte Griffe zusammen getempert, um die Moleküle zu zupfen erzeugen. Kalibrierung und Betrieb der Pinzette. Das grundlegende Design des Minitweezers Einsatzd in dieser Arbeit folgt, dass der Dual-Beam-optischen Pinzette 33. Mit vielen Verbesserungen, die Minitweezers anzuzeigen außergewöhnliche Stabilität im Vergleich zur ersten Generation optischen Pinzette. Eine Reihe von Forschungsgruppen in mehreren Ländern die Minitweezers verwenden in ihren Einzelmolekül-Forschung 14,15,34-37. Die Details der Konstruktion, Kalibrierung und Betrieb des Gerätes, einschließlich Lehrvideos, sind in der &quot;Pinzette Lab&quot;-Website (http://tweezerslab.unipr.it) zur Verfügung. Dabei sind Verbesserungen und Kalibrierungsverfahren, die auf täglicher Basis durchgeführt werden müssen, im Detail beschrieben.

<table><tbody><tr><td>Minitweezers</td><td>Steven B. Smith Engineering</td><td></td><td><a href="http://tweezerslab.unipr.it/">http://tweezerslab.unipr.it</a></td></tr><tr><td>Datenerfassungskarte</td><td>National Instruments</td><td>USB-6351</td><td></td></tr><tr><td>Grafikkarte</td><td>National Instruments</td><td>PCI-1407</td><td></td></tr><tr><td>Labview-Programmiersoftware</td><td>National Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NI Vision Builder</td><td>National Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lasergravierer</td><td>Epilog Lasersysteme</td><td>Zing-16</td><td></td></tr><tr><td>PCR-Aufreinigungskit</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>MEGAscript T7 Kit</td><td>Life Technologies</td><td>AM1334</td><td></td></tr><tr><td>MEGAclear Kit</td><td>Life Technologies</td><td>AM1908</td><td></td></tr><tr><td>Biotin-11-UTP</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td></td>FERR0081</tr><tr><td>T4 DNA-Polymerase</td><td>New England Labs</td><td>M0203</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin-beschichtete Mikrosphäre</td><td>Spherotech</td><td>SVP-20-5</td><td></td></tr><tr><td>Antidigoxigenin-beschichtete Mikrosphäre</td><td>Spherotech</td><td>DIGP-20-2</td><td></td></tr><tr><td>Größe Standard-Mikrosphären</td><td>Spherotech</td><td>PPS-6K</td><td></td></tr><tr><td>Kaptonband</td><td>Kaptontape.com</td><td>KPPTDE-1</td><td></td></tr><tr><td>Nr. 2 Deckglas</td><td>Thermo Fisher</td><td>12-543D</td><td></td></tr></tbody></table>

nanomanipulation von rna-einzelmoleküle durch optische pinzetten

Nanomanipulation of Single RNA Molecules by Optical Tweezers

Ein großer Teil des menschlichen Genoms transkribiert wird, aber nicht übersetzt. In diesem Beitrag genomischen Ära, regulatorische Funktionen von RNA haben gezeigt, dass immer mehr wichtig zu sein. RNA-Funktion hängt oft von seiner Fähigkeit, alternative Strukturen annehmen, ist es schwierig, RNA dreidimensionale Strukturen direkt Sequenz vorherzusagen. Einzelmolekül Ansätze zeigen Potentiale, das Problem der RNA strukturellen Polymorphismus durch Überwachen Molekülstrukturen ein Molekül zu einem Zeitpunkt zu lösen. Diese Arbeit stellt eine Methode, um die Faltung und Struktur der einzelnen RNA-Moleküle mit Hilfe der optischen Pinzette gerade manipulieren. Erstens, Methoden zu synthetisieren Moleküle geeignet für Einzelmolekül-mechanische Arbeit werden beschrieben. Als nächstes werden verschiedene Eichverfahren, um die entsprechenden Operationen der optischen Pinzette sicherzustellen diskutiert. Als nächstes werden verschiedene Experimente erläutert. Um den Nutzen der Technik zu demonstrieren, Ergebnisse der mechanisch Entfaltung RNA Haarnadeln und ein einzelnes RNA Kissing Komplexes sind als Beweismittel verwendet. In diesen Beispielen wurde die Nanomanipulationstechnik verwendet, um das Falten der einzelnen Strukturdomäne, einschließlich sekundären und tertiären studieren unabhängig. Schließlich werden die Beschränkungen und zukünftige Anwendungen des Verfahrens diskutiert.

Durch den Raum begrenzt ist, wird Nanomanipulation von einzelnen RNA-Moleküle, die durch die nur mechanische Entfaltung Beispiele für RNA-Haarnadeln und ein RNA mit Tertiärstruktur demonstriert. Manipulieren Einzel Hairpin Moleküle Sobald ein Halteseil zwischen den Perlen hergestellt ist, kann Verlängerung und Kraft auf das Halteseil mit einem Benutzer-definierten Protokoll bearbeitet werden. Vier gemeinsamen Manipulation Protokolle werden häufig...

Optische Pinzetten wurden verwendet, um die RNA-Faltung zu untersuchen, indem einzelne Moleküle von ihren 5'- und 3'-Enden gedehnt wurden. Hier werden gängige Verfahren zur Synthese von RNA-Molekülen für die Pinzette, zur Kalibrierung des Instruments und Methoden zur Manipulation einzelner Moleküle beschrieben.

Nanomanipulation von RNA-Einzelmoleküle durch Optische Pinzetten

A large portion of the human genome is transcribed but not translated. In this post genomic era, regulatory functions of RNA have been shown to be ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, ein mechanisches Entfaltungs-Experiment an einer RNA-Struktur auf Einzelmolekülebene zu demonstrieren. Im ersten Schritt wird eine Durchflusskammer konstruiert und am Gerät befestigt. Im zweiten Schritt werden Mikrokugeln im Mikrometerbereich mit der gewünschten RNA-Probe vermischt, und anschließend werden die beiden unterschiedlich großen Kugeln in die Durchflusskammer eingefüllt.Schließlich können die Durchflusskammer und die optische Falle verwendet werden, um die Kügelchen gezielt in Kontakt miteinander zu bringen, um eine Vielzahl einzelner Molekülwechselwirkungen zu untersuchen. Letztendlich kann diese Nanomanipulationstechnik dazu eingesetzt werden, die Faltung von RNA auf der Ebene der sekundären und tertiären Struktur zu erforschen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der RNA-Faltung zu beantworten, beispielsweise: Wie falten und entfalten sich RNA-Moleküle?Wie verlagert es sich zwischen verschiedenen Konformationen als Reaktion auf eine Umweltveränderung? Und wie wechselwirkt es mit anderen Molekülen? Das heutige Experiment wird von meinem Doktoranden, Herrn Williams Stevenson, durchgeführt. Um eine Flusskammer herzustellen, beginnen Sie damit, sechs Löcher mit einem Durchmesser von zwei Millimetern in ein Deckglas der Größe Nr. 2 zu bohren.Verwenden Sie dann einen Lasergravierer, um drei zwei Millimeter breite Schlitze in zwei Stücke beidseitiges Polyamidband zu schneiden. Befestigen Sie eines der Bandstücke auf dem Deckglas, wobei darauf zu achten ist, dass die Löcher im Band mit den Löchern im Deckglas ausgerichtet sind. Befestigen Sie das andere Bandstück auf einem sauberen, undurchbohrten Deckglas.Entfernen Sie die Schutzfolie von beiden Klebestreifen und platzieren Sie dann eine gezogene Glas-Mikropipette und zwei Bi-Röhrchen zwischen den Kanälen auf einer der Deckgläsern. Anschließend werden die beiden Deckgläser zusammengesetzt, wobei die Mikropipette und die Bypass-Röhrchen mit den beiden Klebestreifenschichten an Ort und Stelle gehalten werden. Um eine Durchflusskammer herzustellen, befestigen Sie die Kammer an der Rückseite eines Metallrahmens, wobei die Öffnungen in der Kammer mit den fluidischen Kanälen ausgerichtet werden.Drehen Sie dann den Rahmen um und verbinden Sie die Kanäle über Polyethylen-Schläuche mit 10-Milliliter-Spritzen, die mit einem Puffer Ihrer Wahl gefüllt sind. Bringen Sie nun die gesamte Kammer zwischen den beiden Objektiven der optischen Pinzette an, wobei die Vorderseite der Kammer mit den Fluidkanälen nach rechts weisen soll. Ziehen Sie dann das linke Objektiv zurück, stecken Sie die Messingstifte des Rahmens in die Befestigungslöcher der Pinzette und ziehen Sie die Schrauben fest, um die Kammer in Position zu fixieren.Verwenden Sie ein Bungee-Seil, um das Instrument vom Tisch anzuheben. Stellen Sie das Instrument vor der Zugabe der Kügelchen an die Reaktionsstelle der Durchflusskammer in eine Schallbox. Geben Sie zunächst eine RNA-Probe des Typs A mit anti-D, mit Sauerstoff-ENC beschichteten Kügelchen oder Dig-Kügelchen versetzt, in ein Gefäß und inkubieren Sie das Gemisch 15 Minuten bei Raumtemperatur.Während der Inkubation füllen Sie die Lotus-Suspension aus abgestreiften Habit und beschichteten Kügelchen in eine Ein-Milliliter-Spritze und verbinden die Spritze mit der Fluidikleitung, die zum unteren Kanal der Durchflusskammer führt. Drücken Sie die Spritze, um die Strep-Kügelchen in die Kammer zu laden, und verwenden Sie dann die Motorsteuerungssoftware, um die optische Falle in die Nähe der Öffnung des unteren Bypassrohrs zu positionieren und die gesamte Kammer zu bewegen. Bedienen Sie anschließend den Trackball, um die optische Falle zu steuern und ein Strep-Kügelchen einzufangen.Verwenden Sie die Motorsteuerungssoftware, um die Perle nahe an die Spitze der Mikropipette zu bewegen. Ziehen Sie anschließend den mit der Mikropipette verbundenen Spritzenkolben, um die Perle durch Vakuum an der Mikropipette zu fixieren, und drücken Sie dann vorsichtig den Spritzenstempel, um Fluss in den mittleren Kanal zu erzeugen und alle verbleibenden Strep-Perlen auszuspülen. Geben Sie die Mischung aus dig-Perlenprobe in den oberen Kanal der Kammer und fangen Sie eine dig-Perle wie zuvor gezeigt ein.Danach mithilfe der optischen Falle die Dig-Perle nahe an die Streptavidin-Perle heranführen. Fluss anwenden, um den mittleren Kanal zu reinigen. Danach ein einzelnes Molekül fischen, das zwischen dem Perlenpaar verankert ist.Platzieren Sie die erfasste Dig-Perle vertikal auf der Strep-Perle. Danach steuern Sie die Falle, um die Dig-Perle in Richtung der Strep-Perle nach unten zu bewegen, und öffnen Sie ein Kraft-Abstands-Diagramm-Fenster auf dem Monitor, um die Kraftänderungen zu visualisieren. Schließlich bewegen Sie nach dem Kontakt die Dig-Perle vertikal von der Strep-Perle weg und verfolgen dabei die Kraft ihrer Trennung.Wenn ein RNA-Molekül über sein 5'- und 3'-Ende zwischen Perlen verankert ist, kann es wiederholt gestreckt und entspannt werden. Die Elastizität der doppelsträngigen Halterungen zeigt sich in nichtlinearen Kraft-Dehnungs-Kurven. Kooperatives Faltung und Entfaltung der RNA-Struktur zwischen den Halterungen spiegeln sich in abrupten Rissen und Zips in der Kraft-Dehnungs-Kurve mit negativen Steigungen wider; die Rückfaltung der Haarnadelstruktur wird durch einen Zip in der Kraft-Dehnungs-Kurve angezeigt.Wichtig ist, dass dasselbe Molekül jedes Mal bei unterschiedlichen Kräften entfaltet und wieder gefaltet werden kann. Ein solcher Trend zeigt sich in den Verteilungen der Übergangskräfte. Ein Rückkoppelungsmechanismus kann verwendet werden, um eine konstante Kraft auf den RNA-Haarnadel zu halten. Das Faltungsereignis einer RNA-Haarnadel zeigt sich durch eine Verkürzung der Ausdehnung, während die Entfaltung im passiven Modus durch eine Zunahme der Ausdehnung angezeigt wird, wobei die Positionen der Falle und der Mikropipette beide fixiert sind.Wenn sich eine RNA zu einer Haarnadelstruktur falten und ihre Ausdehnung verkürzen, bewegt sich die eingefangene Perle vom Zentrum der Falle weg, wodurch die Kraft zunimmt. Wenn die RNA zu einem einzelnen Strang gestreckt wird, bewegt sich die Perle zum Zentrum der Falle hin, wodurch die Kraft abnimmt. Mit dieser Technik können die Faltungswegwege von RNA beobachtet und gezielt beeinflusst werden.Mit pico-Newton- und Nanometer-Auflösung können Zustandslebensdauern und Übergangskräfte einzelner Moleküle gesammelt werden, um Geschwindigkeitskonstanten und freie Energien der RNA-Faltung abzuleiten. Bei dem Versuch, dieses Verfahren durchzuführen, ist es wichtig, geduldig zu sein, wenn man ein einzelnes Molekül „angelt“. Die Wahrscheinlichkeit, ein einzelnes Molekül als Anker zwischen zwei Perlen zu finden, ist sehr gering.Daher können viele Paare von Kügelchen überhaupt nicht zusammenhalten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

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Multiplexed Einzelmolekül-Kraftspektroskopie Proteolyse Messungen mit magnetischen Pinzette

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Dieses Protokoll stellt einen vollständigen experimentellen Workflow für die Untersuchung von RNA-Protein-Interaktionen mit optischen Pinzetten dar. Mehrere mögliche Versuchsanordnungen werden skizziert, einschließlich der Kombination von optischen Pinzetten mit konfokaler Mikroskopie.

Optische Pinzette untersucht RNA-Protein-Interaktionen in der Translationsregulation

Die visuelle Einzelmolekülbiochemie, die durch mikrofluidische Kammern untersucht wird, wird durch Glaszylinder, gasdichte Spritzen, stabile Verbindungen von Schläuchen zu Durchflusszellen und Beseitigung von Blasen durch Platzierung von Schaltventilen zwischen Spritzen und Schläuchen erheblich erleichtert. Das Protokoll beschreibt duale optische Fallen, die die Visualisierung von DNA-Transaktionen und intermolekularen Interaktionen ermöglichen.

Verwendung von zwei optischen Pinzetten und Mikrofluidik für Einzelmolekülstudien

Hier beschreiben wir eine magnetische Hochgeschwindigkeitspinzette, die nanomechanische Messungen an kraftsensitiven Biomolekülen mit einer maximalen Rate von 1,2 kHz durchführt. Wir stellen seine Anwendung auf DNA-Haarnadeln und SNARE-Komplexe als Modellsysteme vor, aber es wird auch auf andere Moleküle anwendbar sein, die an mechanobiologischen Ereignissen beteiligt sind.

Hochgeschwindigkeits-Magnetpinzette für nanomechanische Messungen an kraftempfindlichen Elementen

Dieses Protokoll demonstriert die Verwendung einer magnetischen Einzelmolekülpinzette zur Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen telomeren DNA-bindenden Proteinen (Telomer-Repeat-Bindungsfaktor 1 [TRF1] und TRF2) und langen Telomeren, die aus menschlichen Zellen extrahiert wurden. Es beschreibt die Vorbereitungsschritte für Telomere und telomerische Repeat-Bindungsfaktoren, die Durchführung von Einzelmolekülexperimenten sowie die Methoden der Datenerhebung und -analyse.

Analyse telomerer Protein-DNA-Wechselwirkungen mit einer magnetischen Einzelmolekülpinzette

Optische Auflösung photoakustische Mikroskopie (OR-PAM) ist eine aufstrebende Technologie, mit der abbildenden optischen Absorption...

Dreidimensionale Optische Auflösung photoakustische Mikroskopie

Wir veranschaulichen die Verwendung eines axialen optischen Pinzetten-Systems mit konstanter Kraft, um die mechanischen Eigenschaften kurzer DNA-Moleküle zu untersuchen. Durch axiales Dehnen der DNA minimieren wir sterische Behinderungen und Artefakte, die bei herkömmlicher lateraler Manipulation auftreten, und können so DNA-Moleküle von etwa 100 nm Länge untersuchen.

Stretching kurze DNA-Sequenzen mit Constant Force Axial Optische Pinzetten

Einfache und reproduzierbare Verfahren werden für die Herstellung drei strukturell unterschiedliche Kollagen Baugruppen aus einer gemeinsamen kommerziell erhältlichen Typ I-Kollagen-Monomer beschrieben. Systemeigenen Typ, können faserige langen Abstand oder segmentale langen Abstand Kollagen durch Variation der Bedingungen, denen die 300 nm lang und 1,4 nm Durchmesser Monomer-Baustein ausgesetzt gebaut werden.

In vitro Synthese von Native, Fibröse Lange Abstände und Segmentberichterstattung Lange Spacing Collagen

Lernen Sie die Nanomanipulation von RNA-Einzelmolekülen durch optische Pinzetten zur Untersuchung von Faltungsmechanismen. Diese Methode ermöglicht präzise Analysen sekundärer und tertiärer Strukturen.

Nanomanipulation von RNA-Einzelmoleküle durch Optische Pinzetten

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