Name: Next-Generation-Sequenzierung der ribosomalen 16S-RNA Gene Amplikons (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: Lernen Sie die Next-Generation-Sequenzierung von 16S-rRNA-Gen-Amplikonen aus Umweltproben mit einem Benchtop-Sequenzer. Diese Methode ermöglicht die detaillierte Charakterisierung mikrobieller Gemeinschaften.

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Die Entwicklung der hier vorgestellten Methode wurde mit verschiedenen Finanzierungsquellen durchgeführt, darunter Genome Canada und Genome Quebec, Environment Canada STAGE-Programm und interne NRC-Mittel.

1. 16S rRNA-Gen-Bibliothek Amplicon Vorbereitung der Fusion-Methode <ol><li> Tauen die Primer (Vorwärts, F343-Iona-MIDXX: 5&#39;-CCA TCT CAT CCC TGC GTG TCT CCG AC T CAG XXX XXX XXX XTA CGG RAG GCA GCA G-3 &#39;; umzukehren, R533-IonP1: 5&#39;-CCT CTC TAT GGG CAG TCG GTG AUF EINEN TTA CCG CGG CTG CTG GC-3 &#39;; fett: Ion Torrent spezifische Adapter, kursiv: Sequenztaste für die Kalibrierung von Signalintensität zu Beginn der Sequenzierung Lauf, regelmäßige Schrift: template-spezifischen Primer, X ... X: 10 bp Barcode, siehe Tabelle 1 für einige Barcode-Sequenzen), die 2x HotStartTaq Plus-Master-Mix und die Proben. Vor Gebrauch gründlich mischen, mit Ausnahme des Master-Mix, der sanft gemischt werden sollte. </li><li> Vorbereitung einer PCR-Mischung (20 ul-Reaktionen) mit 0,5 uM des Reverse-Primers, 0,4 mg / ml Rinderserumalbumin (BSA) und 1x HotStartTaq Plus Master Mix. Fügen 18,5 ul des Master-Mix auf Each PCR-Röhrchen. </li><li> Ein Forward-Primer (0,5 ul an 20 mM) mit einem anderen Strichcode für jede der Proben, die zusammen sequenziert werden. 1 ul Probe (1-10 ng / ul) auf die PCR-Röhrchen. </li><li> Die Röhrchen in einer PCR-Maschine und führen Sie das folgende Programm: initiale Denaturierung bei 95 ° C für 5 min; 25 Zyklen von 95 ° C für 30 sec, 55 ° C für 30 sec und 72 ° C für 45 sec; Schlussverlängerung bei 72 ° C für 10 min. PCR-Produkte können bei 4 ° CO gehalten werden / N oder gefroren bis zur Verwendung. </li></ol> 2. Amplicon Reinigung, Quantifizierung und Pooling <ol><li> Bereiten Sie eine 2% Agarose-Gel mit die größten Kämme. Werden 5 ul 6x Gel-Beladungsfarbstoff zu dem Reaktions und Last auf dem Gel, die Trennung jeder Probe durch einen leeren gut. Führen Sie das Gel bei 70 V für 50 min. </li><li> Nehmen Sie ein Bild von dem Gel und schneiden die Bänder (erwarteten Größe ca. 250 bp: 190 bp-Produkt sowie 63 bp-Adapter und Barcodes) mit einem sauberen Skalpell. </li><li&gt; Wiegen Sie die ausgeschnittenen Banden und fahren Sie mit dem Gel Extraktion und Reinigung der PCR-Produkte (mit zB QIAquick Gel Extraction Kit). </li><li> Quantifizierung jedes PCR-Produkt mit PicoGreen und machen Verdünnungen um eine Stammlösung bei 5 x 10 9 Moleküle / ul (etwa 1 ng / ul) zu erhalten. Wenn einige Proben zeigen geringere Verstärkung, passen Sie die Verdünnungen auf eine niedrigere Konzentration, wenn man bedenkt, dass die niedrigste für die nachfolgende Verfahren Konzentration beträgt 1,57 x 10 7 Moleküle / ul (26 Uhr). </li><li> Pool 10 ul der verdünnten PCR-Produkt zu einer äquimolaren Pool von Proben zu erhalten. Bereiten Sie eine separaten Pool für jede der geplanten Lauf Sequenzierung. Die gepoolten PCR-Produkte können in der Tiefkühltruhe aufbewahrt werden, bis sie verwendet. </li></ol> 3. Emulsions-PCR und Sequenzierung <ol><li> Führen Emulsions-PCR: <ol><li> Verdünne die gepoolten PCR-Produkte auf 26 pM in einem Volumen von 25 ul. Tau-Reagenzien von einem Ion PGM-Vorlage-Kit. </li><li> Bereiten Sie die Emulsions-PCR-Mix (Reagenzien im Kit enthalten) in einer PCR-Haube und die gepoolten PCR-Produkte und die Kugel-Teilchen (mitgeliefert) auf der Bank hinzuzufügen. Gründlich mischen und legen Sie die Mischung in eine Filterpatrone und vorsichtig von oben mit Öl-Emulsion (mitgeliefert). </li><li> Langsam kehren die Filterpatrone und Last auf dem automatisierten Emulsion PCR-Gerät (zB Ion One Touch 2 Instrument). Wählen Sie das entsprechende Programm und starten Sie den Vorgang. </li></ol></li><li> Nach der automatisierten Emulsions-PCR abgeschlossen ist, entfernen Sie den Überstand aus den Sammelrohren und rufen Sie die Kugel Teilchen am Boden der Rohre. Resuspendieren der Kugeln in 100 ul Waschlösung (im Kit enthalten) und einen 2,0-ul-Aliquot für Bibliotheks Quantifizierung. </li><li> Führen Sie die Bibliothek Quantifizierung. <ol><li> Mischungs 100 ul SSPE-Puffer (150 mM NaCl, 10 mM NaPO 4, 1 mM Na 2 EDTA) mit 2 ul Adapter B&#39;-Fam (5&#39;-FAM -CTG AGA CTG CCA AGG CAC ACA GGG GAT AGG-3 &#39;) und Sonde 2 ul Adapter A-Cy5 (5&#39;-Cy5 -CCA TCT CAT CCC TGC GTG TCT CCG ACT CAG-3&#39;)-Sonde. Fügen 52 ul dieser Mischung mit dem 2,0-ul-Aliquot in Schritt 3.2 aufgenommen und mit 2 ul Waschlösung (von der Vorlage Kit) mit den restlichen 52 ul als Rohling für die Quantifizierung. </li><li> Inkubieren bei 95 ° C für 2 min, dann bei 37 ° C für 2 min. Übertragen Sie die Mischungen in 1,5-ml-Röhrchen. </li><li> 1,0 ml TEX-Puffer (10 mM Tris, 1 mM EDTA, 0,01% Triton X-100, pH 8,0), Mischen und Zentrifugieren bei 15.500 × g für 3 min bei RT. Entfernen Sie den Überstand und lassen Sie 20 ul in jedes Röhrchen. Wiederholen Sie diesen Waschvorgang zwei Mal. </li><li> Fügen Sie 180 ul von TEX-Puffer resuspendieren Die pelletierten Partikel und übertragen in 500 ul Qubit Röhren. </li><li> Messen Fluoreszenz für FAM und Cy5 mit einem Qubit Gerät und berechnen das Verhältnis von positiven Kugeln mit Hilfe der auf der Website zur Verfügung Ion Gemeinschaft Rechner. </li></ol></li><li> Bereichern den Rest der Form kugelförmiger Partikel für positive Kugeln (enthaltend amplifizierte DNA) unter Verwendung eines automatisierten Anreicherungssystem (zB Ionen One Touch Anreicherungssystem). <ol><li> Pipette Reagenzien in den Vertiefungen der vorgesehenen 8-Well-Streifen: Nun 1: Kugel Partikel aus Schritt 3.2; Nun 2: vorgewaschen MyOne Streptavidin C1-Perlen (13 ul); Gut 3, 4 und 5: Waschlösung (in der Vorlage Kit enthalten); Gut 6: leer; Gut 7: Schmelz-off-Lösung (125 mM NaOH, 0,1% Tween 20); Gut 8: leer. </li><li> Installieren Sie eine Spitze auf dem Pipettieren Arm und ein 0,2-ml-Röhrchen für die Probenentnahme. Starten Sie das Gerät. Am Ende der Anreicherung werden 10 ul der Neutralisierungslösung (enthalten). Die angereicherten Kügelchen können eine 4 ° C für bis zu 15 Tage aufbewahrt werden. </li></ol></li><li> Initialisieren der Sequenzierung Instruments: <ol><li> Eine Verbindung zum Instrument Sequenzierung und bereiten eine Sequenzierung Laufplan, der die Details der Sequenzierung Lauf. </li><li> Installierenl der Waschlösung # 2 (in der Ionen-PGM-Sequenzierungs-Kit vorgesehen), die Waschlösung # 1 (350 ul 100 mM NaOH) und die Auto-pH-Pufferlösung (vorgesehen). </li><li> Starten Sie die Initialisierung und wenn Sie dazu aufgefordert in ihren jeweiligen 50-ml-Röhrchen fügen Sie die dATP, dGTP dCTP und dTTP Nukleotide (mitgeliefert). Schrauben Sie die Rohre auf die Sequenzierung Maschine und setzen Sie die Initialisierung. Wenn die Initialisierung abgeschlossen ist, starten Sie den Vorgang sofort laufen. </li></ol></li><li> Vorbereitung der Proben für die Sequenzierung und laden Sie die Chip: <ol><li> Sammle die angereicherten Bereiche aus Schritt 3.4 an der Unterseite des Rohres durch Zentrifugation bei 15.500 × g für 1,5 min. Entfernen Sie den Überstand verlassen genau 3 ul. </li><li> Hinzufügen 3 ul Sequenzierprimer (in der Sequenzierungs-Kit zur Verfügung gestellt), gut mischen durch Pipettieren von oben und unten, um die Partikel zu suspendieren. Inkubieren bei 95 ° C für 2 min, dann bei 37 ° C für 2 min. </li><li> 1 ul-Polymerase (im Lieferumfang enthalten), gut mischen und Incubaß bei RT für 5 min. Fahren Sie mit den Enzym-Kugelgemisch auf der Sequenzierung Chip innerhalb von 30 min zu laden. </li><li> Während der Inkubation laden die Sequenzierung Chip auf dem Sequenzer und einen Chip Qualitätsprüfung durchzuführen. Entfernen Sie die Flüssigkeit aus dem Chip durch Zentrifugation und laden Sie die Probe in der Chip durch langsames Pipettieren Sie die Enzym-Mix Kugel (7 ul) und der Vermeidung der Einführung von Blasen in den Chip. </li><li> Zentrifugieren Sie die Chip dreimal für 1 min in einer Mikro. Ändern Sie die Ausrichtung des Chips an jeder Zentrifugation und mischen durch Pipettieren von oben und unten zwischen jedem Lauf. </li><li> Laden Sie den Chip in dem Gerät und den Lauf starten. </li></ol></li></ol> 4. Grundsequenzdatenanalyse <ol><li> Eine Verbindung zum Server Sequenzierungsdaten und laden Sie die Datei fastq. Erstellen Sie eine durch Tabulatoren getrennte Datei &quot;Oligos&quot; der Grundierung und Barcode-Informationen (siehe Beispiel in Tabelle 1), die. Laden Sie die Greengenes Referenzdateien aus der Mothur Website ( <a href="http://www.mothur.org/wiki/Taxonomy_outline">http://www.mothur.org/wiki/Taxonomy_outline</a> ). </li><li> Starten Mothur und Durchführung von Analysen: <ol><li> Konvertieren Sie die Datei in ein fastq fasta und ein Qualitäts Datei mit dem folgenden Befehl: fastq.info (fastq = test.fastq) </li><li> Bestimmen Sie die Gruppenzugehörigkeit jeder Sequenz und trimmen die Sequenzen mit dem folgenden Befehl: trim.seqs (fasta = test.fasta, Oligos = barcode.txt, QFile = test.qual, qwindowaverage = 20, qwindowsize = 50, minlength = 150, keepforward = T) </li><li> Die verschiedenen Optionen können entsprechend der gewünschten Stringenz modifiziert werden </li><li> Klassifizieren Sie die Sequenzen in der Greengenes Taxonomie mit dem folgenden Befehl: classify.seqs (fasta = test.trim.fasta, method = wang, Gruppe = test.groups, template = gg_99_otus.fasta, Taxonomie = gg_99_otus.tax, Cutoff = 50) </li></ol></li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

<html> Die hier vorgestellte Methode ist unkompliziert und preiswert, und sollte es vielen Labors, die Macht der metagenomische Sequenzierung zugreifen. Obwohl sie in Abhängigkeit von der Sequenzierung Plattform abhängig, wenn die Bibliotheken konstruiert wenig praktische Zeit erforderlich, wobei die meisten der Verfahren ist automatisierbar. Für die Sequenzierungsplattform verwendet hier (Ion Torrent PGM) kann das komplette Verfahren innerhalb von zwei Tagen Arbeit durchgeführt werden. Im Moment des Schreibens (September 2013), waren wie folgt die Reagenzienkosten auf das Beispiel oben beschrieben bezogen werden: PCR-Amplifikation von 36 Proben: $ 25, Gel-Reinigung und PicoGreen DNA-Quantifizierung von 36 Proben: $ 125, Emulsions-PCR für eine gepoolte Amplikon Probe : $ 150 und Sequenzierungsreagenzien: $ 250, für einen Gesamtbetrag von $ 550 oder $ 15 pro Probe oder $ 0,0015 pro-Qualität gefiltert Lese. Dieser Preis umfasst nicht Instrument Servicevertrag Instrument Abschreibungen, Techniker Gehalt und Laborraumnutzung. Zelt &quot;&gt; Eine der wichtigsten Schritte ist es, alle Produkte in einem äquimolaren Verhältnis zu bündeln, um eine ähnliche Anzahl von Abrufen liest für jede der Proben. PicoGreen Quantifizierung wurde hier verwendet, aber andere Verfahren geeignet sein könnten, wenn auch weniger genau (zB UV-Quantifizierung, Gel-basierte Quantifizierung). Selbst, indem Sie die genaue Quantifizierung und Pooling, gibt es eine gewisse Variabilität in der Anzahl der Lesevorgänge pro Probe und in der typischen Lauf in Tabelle 2 aufgeführt, von 4.380 bis 32.750 reicht es liest, mit einem Durchschnitt von 10.338 liest. Wenn der Verarbeitung große Anzahl von Proben (mehr als 40-50), Einzel Spalte Gel Reinigung kann durch Gel-Reinigung in Platte oder Reinigung mit Perlen mit einer strengen Grenzgröße ersetzt werden (zB AMPure Perlen) . Bis heute ist die am häufigsten verwendete nächsten Generation Sequenzierungstechnologie für die 16S rRNA-Gen 454. Das Ion Torrent-Sequenzierungstechnologie in diesem Protokoll verwendet wird, ist konzeptionell sehr ähnlich454 und beide Technologien sind anfällig für die gleiche Art von Sequenzierungsfehlern. Nicht überraschend, wurde gezeigt, dass Ion Torrent-Sequenzierung ergab Sequenzierungsergebnisse sehr ähnlich 454-Sequenzierung 10. Kürzlich haben viele Forscher die Verwendung von Illumina Technologie für 16S-rRNA-Gen-Amplikons Sequenzierung 18,19 sucht. In jedem Fall wäre es einfach, den aktuellen Protokoll für andere Tisch Sequenzer wie die Illumina MiSeq oder 454 GS Junior durch eine Änderung der Fusions Primer-Sequenzen, um die Adapter und Barcodes für diese Sequenzierungstechnologien benötigt einstimmt, wie in der kürzlich beschriebenen Verfahren anzupassen für die Illumina MiSeq 19. Alternativ könnten die Forscher Schritte 1 und 2 des Protokolls detailliert hier und senden Sie die gepoolten Amplikons zu einer Sequenzierungszentrum, wo die Emulsion PCR und Sequenzierung durchgeführt werden würde. Das 16S-rRNA-Gen liest wurden beschnitten und klassifiziert mit Mothur, aber viele andere Analysen können durchgeführt werden, auf16S rRNA-Gen-Amplikons. Beispielsweise können beta-Diversität durch Berechnen der Abstände zwischen jedem Unifrac Probenpaare unter Verwendung des Verfahrens beschrieben in ausgewertet <a href="http://unifrac.colorado.edu/">http://unifrac.colorado.edu/</a> 20. Alpha-Diversität-Indizes und der Anzahl der Betriebs taxonomische Einheiten von jeder Probe können mit Tools wie innerhalb QIIME AmpliconNoise 21 oder nach dem Verfahren von Huse et al. 22 und innerhalb Mothur skizziert berechnet werden. Die hier verwendeten Primer der variablen Regionen 3 und 4 von der 16S-rRNA-Gen, aber viele andere Regionen ausgerichtet werden konnte. In dieser Studie wurden die 16S-rRNA-Gene von Pflanzenmaterial verstärkt und die Wahl der Primer wurde hergestellt, um eine Amplifikation der Chloroplast 16S rRNA-Gen 23,24 vermeiden. Es gibt eine Vielzahl von anderen Primern, die in Laufzeit der Produktlänge, Leistung und Nützlichkeit taxonomischen 25,26 variieren. Jedoch in allen Fällen 200-400 bp liest der 16S rRNA-Gen nicht zuverlässig auf Artenebene eingestuft werden, und Analysen, die zur Gattung und höhere taxonomische Ebenen beschränkt. Andere Gene könnte besser geeignet sein, wenn Spezies-Ebene Informationen benötigt werden, wie die cpn60 und rpoB Gene 27,28. Zukunft drastische Tropfen in die Kosten der Sequenzierung und steigt in die Macht der Analyseinstrumente könnte es möglich, 16S rRNA-Gen-Sequenzierung durch Schrotflinte Metagenomik ersetzen, aber bis dahin 16S-rRNA-Gen-Sequenzierung bleibt der Goldstandard der Umweltmikrobiologie.

Metagenomische Sequenzierung ist eine sehr leistungsfähige Technologie, da sie die Gesamtheit der genetischen Information in einer Umweltprobe enthaltenen Ziele. Es gibt verschiedene Geschmacksrichtungen von metagenomische Sequenzierung, einschließlich Shotgun-Sequenzierung, Großeinsatz Bibliotheken und Amplikon-Sequenzierung. Amplicon-Sequenzierung bietet den Vorteil, dass sie relativ preiswert, schnell und in der Lage zu erzeugen liest aus einer genomischen Region, die im Allgemeinen ausgerichtet werden kann. Zusätzlich wird die Datenanalyseablauf für Amplikon-Sequenzierung meist genormt. Da es auf PCR-Basis, hat jedoch alle Vorspannungen unvollständiger Spezifität unvollständige Abdeckung und Primer bezogen vorspannt 1,2, die diesen Ansatz semi-quantitative macht am besten. Mehrere genomischen Regionen für Amplikon-Sequenzierung auch funktionelle Gene gezielt werden, aber die beliebtesten Optionen sind Markergene wie das 16S rRNA-Gen verwenden, um ein Community-Profil zu erzeugen. Traditionell 16S rRNA-Gen-Amplikon sequeber bouncing wurde mit arbeitsintensive Techniken, Klonierung in E. enthalten geführt coli-Kolonie Kommissionierung und Plasmid-Extraktion, gefolgt von Sanger Sequenzierung der isolierten Plasmide, und folglich die meisten Studien analysiert weniger als 100 Klone pro Probe. Next-Generation-Sequencing brachte zwei große Fortschritte: massiven Parallelisierung der Sequenzierungsreaktionen und, am wichtigsten, klonalen Trennung der Vorlagen ohne die Notwendigkeit, Gen-Fragmente in einer Gast einfügen. Das hat enorm die Sequenzierung von 16S rRNA-Gen-Amplikons, die nun wieder als eine Routine Merkmal vieler Umweltmikrobiologie Studien ist, was zu einer &quot;Renaissance&quot; für 16S rRNA-Gen-Sequenzierung Amplikon 3 vereinfacht. Seit dem Aufkommen der Roche 454-Sequenzierung im Jahr 2005 4, haben mehrere andere Next-Generation-Sequencing-Technologien auf dem Markt erschienen (zB Illumina, Festkörper, PacBio). In jüngerer Zeit die Einführung der Tisch Sequenzrs gebracht, um kleine Labore die Sequenzierung Kapazität einmal exklusiv für große Sequenzierungszentren. Fünf Tischmaschinen sind derzeit verfügbar: die 454 GS Junior, der Ion Torrent Personal Genome Machine (PGM) und Proton, und die Illumina MiSeq und NextSeq 500. Während alle diese Sequenzer bieten weniger liest pro Lauf und weniger Basen pro Dollar als die meisten Voll Maßstab Sequenzer, sind sie flexibler, schneller, und ihre niedrigen Anschaffungskosten und Lauf macht sie für kleine akademische Labors erschwinglich. Tisch Sequenzer sind besonders gut für Amplikon, kleines Genom und geringer Komplexität Metagenom-Sequenzierung in der Umweltmikrobiologie Studien geeignet, weil diese Art von Studien in der Regel nicht eine extreme Tiefe der Sequenzierung erfordern. Zum Beispiel ist es allgemein anerkannt, dass die 16S-rRNA-Gen-Sequenzierung untersucht die Anzahl der Lesevorgänge pro Probe ist nicht entscheidend, wie ~ 1000 liest die gleichen Muster, wie Multi-Millionen Datensätze liest 5 zu erzeugen. Having said that, Tisch nächsten gene<html> n Sequenzer noch große Mengen an Sequenzdaten mit maximaler Renditen generieren ~ 35 MBP (454 GS Junior), ~ 2 GBP (Ion Torrent PGM), ~ 10-15 GBP (Ion Torrent Proton), ~ 10 GBP (Illumina MiSeq) und ~ 100 GBP (Illumina Weiter Seq 500), die mehr als genug für die meisten Umweltmikrobiologie Studien ist. Next-Generation-Sequenzierung des 16S-rRNA-Amplikons mit Tisch Sequenzer wurde vor kurzem in einer Vielzahl von Umgebungen angewendet. Zum Beispiel hat der Ion Torrent PGM für Gemeinschaft verwendet wurden Analysen von Uran-Mine Aufbereitungsrückstände, die besonders hohen pH-Wert und geringe Durchlässigkeit 6 hatte, der Rückführung von Aquakultursystemen 7, der Kohlenwasserstoff-kontaminierten Böden der Arktis 8,9, der Ölsandgewinnung betroffen Sedimenten und Biofilme aus dem Athabasca River 10,11, der Rhizosphäre von Weiden in kontaminierten Böden 12 gepflanzt, der menschlichen und tierischen Körpern 13-16 und von Faul 17. jove_content &quot;&gt; In diesem Beitrag haben wir ausführlich unsere Herangehensweise an sequenzieren 16S rRNA-Gen-Amplikons im Haus mit Hilfe eines Tisch nächsten Generation Sequencer (der Ion Torrent PGM). Nach der DNA-Extraktion, 16S rRNA-Gene verstärkt mit Domain-Ebene bakterielle Primer, die enthalten Sequenzierung Adapter und einzigartig, probenspezifische Sequenzen (Barcodes). Die Amplifikate werden gereinigt, quantifiziert und vereinigt in einem äquimolaren Verhältnis. Die gepoolten Proben werden dann klonal in einer Emulsions-PCR amplifiziert und sequenziert. resultierenden Sequenzen werden unter Verwendung öffentlich erhältlicher Werkzeuge der Bioinformatik (analysiert zB Mothur).

<table><tbody><tr><td>Ion 314 Chip Kit v2</td><td>Life Technologies</td><td>4482261</td><td></td></tr><tr><td>Ion PGM Sequencing 200 Kit v2</td><td>Life Technologies</td><td>4482006</td><td></td></tr><tr><td>Ion PGM Template OT2 200 Kit</td><td>Life Technologies</td><td>4480974</td><td></td></tr><tr><td>HotStarTaq Plus Master Mix Kit</td><td>Qiagen</td><td>203646</td><td></td></tr><tr><td>Primer und Sonden</td><td>IDT</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Qiaquick Gel Extraktionskit</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>BSA 20 mg/ml</td><td>Roche</td><td>10.711.454.001</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne Streptavidin C1</td><td>Life Technologies</td><td>65001</td><td></td></tr></tbody></table>

next-generation-sequenzierung der ribosomalen 16s-rna gene amplikons

Next-generation Sequencing of 16S Ribosomal RNA Gene Amplicons

Eine der wichtigsten Fragen in der mikrobiellen Ökologie ist &quot;Wer ist da?&quot; Diese Frage kann mit verschiedenen Werkzeugen beantwortet werden, aber eines der lang anhaltende Gold-Standards ist es, 16S ribosomale RNA (rRNA)-Gen Amplikons von Domain-Level-PCR erzeugte Sequenz Reaktionen Verstärken von genomischer DNA. Traditionell wurde diese durch Klonierung und Sanger (Kapillarelektrophorese) Sequenzierung der PCR-Produkte durchgeführt. Das Aufkommen der nächsten Generation Sequenzierung hat sich enorm vereinfacht und erhöht die Sequenzierung Tiefe für 16S rRNA-Gen-Sequenzierung. Die Einführung von Tisch Sequenzer ermöglicht jetzt kleinen Labors, ihre 16S-rRNA-Sequenzierung im Haus in einer Angelegenheit von Tagen durchzuführen. Hier wird ein Konzept für die 16S rRNA-Gen-Sequenzierung Amplikon mit einer Tisch nächsten Generation Sequencer beschrieben. Die Umwelt-DNA wird zuerst durch PCR unter Verwendung von Primern, die Sequenzierung Adapter und Barcodes enthalten. Sie werden dann zu kugelförmigen Teilchen durch Emulsions-PCR verbunden. Die Teilchen loaded auf einem Einweg-Chip, und der Chip wird in der Maschine nach der Sequenzierung Die Sequenzierung durchgeführt wird eingefügt. Die Sequenzen sind in fastq Format abgerufen, filtriert, und die Strichcodes werden verwendet, um die Probe herzustellen Mitgliedschaft des liest. Das gefilterte und klassierte Lesevorgänge werden dann unter Verwendung öffentlich verfügbaren Tools analysiert. Ein Beispiel, wo die Analyse liest wurden mit einem Taxonomie-Suchalgorithmus innerhalb des Software-Pakets Mothur gegeben eingestuft. Die hier vorgestellte Methode ist einfach, preiswert und unkompliziert und sollte kleiner Labors helfen, die Vorteile aus dem laufenden genomische Revolution zu nehmen.

Nach der Reinigung auf einem Gel mit 25 Zyklen der PCR-Amplifikation werden die Amplifikationsprodukte der Regel in einer Konzentration von 0,2 bis 10,0 ng in 50 ul Wasser. Dies kann in Abhängigkeit von der Ausgangs-DNA-Konzentration, der Art der Probe und der Reinigungssatz variieren. Es wird empfohlen, die Anzahl der PCR-Zyklen auf den niedrigsten möglich zu halten, um Chimärenbildung zu vermeiden und zu verringern Verstärkung Vorurteile, wenn man bedenkt, dass alle Proben mit der gleichen Anzahl von Zyklen amplifiziert werden. Um die Anzahl der polyklonalen liest und leeren Bereichen zu minimieren und die Anzahl von Lesevorgängen sollte die Qubit-Verhältnis zwischen 0,1 und 0,3 und das FAM-Fluoreszenz oberhalb von 200 verwenden eine 314-Chip auf einem Ion Torrent PGM ist, ist um den mittleren Ausgangs 0,3-0,5 M gute Qualität liest nach der Filterung der Ergebnisse in Mothur. Tabelle 2 zeigt eine typische Aufteilung der Anzahl der liest nach jedem Schritt des Verfahrens für einen Lauf mit 36 Multiplex-Umweltpsychische Proben mit Primern gezielt den V3-4 Region der 16S und unter Verwendung Mothur amplifiziert. In Mothur, die trim.seqs Verfahren erzeugen eine Datei &quot;* .trim.fasta&quot;, die die Sequenzen, die den Qualitätsfilter und ein &quot;* .scrap.fasta&quot;, die die Sequenzen enthält, die nicht den Qualitätsfilter zusammen mit dem Grund bestanden haben bestanden für die Ablehnung in der Sequenz-Header. Wenn mit Barcodes in der Datei &quot;Oligos&quot; geliefert, wird dieser Befehl auch eine Datei erzeugen &quot;* .Gruppen&quot;, die die Gruppenzugehörigkeit eines jeden Sequenz basierend auf der Barcode-Sequenz enthält. Die classify.seqs Verfahren erzeugt einen &quot;.tax.summary&quot;, die in Excel geöffnet werden kann. Diese Datei enthält die Zusammenfassung der taxonomischen Zugehörigkeit (in Zeilen) für jede der Proben (Spalten). Diese Datei kann für nachgeschaltete statistische Analysen verwendet werden und die Gemeinschafts Zusammensetzung an verschiedenen taxonomischen Ebenen zu visualisieren. Die Datei &quot;.taxonomy&quot; enthält die detaillierte taxonomischeZugehörigkeit für jede Sequenz. Die durchschnittliche Zusammensetzung der Gemeinschaft an dem Stamm / Klassenstufe in allen 36 Proben ist in Abbildung 1 dargestellt. <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51709/51709fig1highres.jpg" width="500" /> Abbildung 1. Durchschnittliche Community Komposition an der Stamm / Klasse-Niveau in allen Proben. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="248"><colgroup><col /><col /><col /></colgroup><tbody><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:64px;"> vorwärts </td><td style="width:139px;"> TACGGRAGGCAGCAG </td><td style="width:47px;"></td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> Strichcode </td><td> CTAAGGTAAC </td><td> Sample01 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> Strichcode </td><td> TAAGGAGAAC </td><td> Sample02 </td></tr><tr height = &quot;20&quot;&gt; <td height="20" style="height:20px;"> Strichcode </td><td> AAGAGGATTC </td><td> Sample03 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> Strichcode </td><td> TACCAAGATC </td><td> Sample04 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> Strichcode </td><td> CAGAAGGAAC </td><td> Beispiel05 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> Strichcode </td><td> CTGCAAGTTC </td><td> Beispiel06 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> Strichcode </td><td> TTCGTGATTC </td><td> Sample07 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> Strichcode </td><td> TTCCGATAAC </td><td> Sample08 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> Strichcode </td><td> TGAGCGGAAC </td><td> Sample09 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> Strichcode </td><td> CTGACCGAAC </td><td> Beispiel10 </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Beispiel-Datei &quot;Oligos&quot; für den Einsatz in Mothur. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="660"><colgroup><col /><col /><col /><col /></colgroup><tbody><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:363px;"></td><td style="width:67px;"> Anzahl liest </td><td style="width:123px;"> % Der vorherigen Schritt </td><td style="width:107px;"> Durchschnittl. pro Probe </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:363px;"> Anzahl der Wells </td><td align="center"> 1262519 </td><td> - </td><td align="center"> 35.070 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:363px;"> Wells mit Perlen </td><td align="center"> 1114108 </td><td align="center"> 88.20% </td><td align="center"> 30.947 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:363px;"> Perlen mit Vorlagen </td><td align="center"> 1112746 </td><td align="center"> 99,90% </td><td align="center"> 30.910 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:363px;"> Monoklonale Perlen </td><td align="center"> 826.805 </td><td align="center"> 74.30% </td><td align="center"> 22.967 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:363px;"> Gute Qualität liest (Ausgabe vom Sequenzer) </td><td align="center"> 782.204 </td><td align="center"> 94.60% </td><td align="center"> 21.728 </td></tr><tr height="40"><td height="40" style="height:40px;width:363px;"> Pass Mothur Filter (min. Durchschnittl. Qualitätsfaktor von 20 über einen 50 Basispunkte-Fenster, min. Länge von 150 bp) </td><td align="center"> 372.168 </td><td align="center"> 47.60% </td><td align="center"> 10.338 </td></tr><tr height="40"><td height="40" style="height:40px;width:363px;"> Klassifiziert am Stamm Ebene in Greengenes (50% Konfidenz-Schwelle) </td><td align="center"> 342.171 </td><td align="center"> 91.90% </td><td align="center"> 9.505 </td></tr><tr height="40"><td height="40" style="height:40px;width:363px;"> Eingestuft in der Ebene der Familien in Greengenes (50% Vertrauensgrenze) </td><td align="center"> 316.512 </td><td align="center"> 92,50% </td><td align="center"> 8.792 </td></tr><tr height="40"><td height="40" style="height:40px;width:363px;"> Eingestuft in der Gattungsebene in Greengenes (50% Vertrauensgrenze) </td><td align="center"> 289.899 </td><td align="center"> 91.60% </td><td align="center"> 8.053 </td></tr></tbody></table> Tabelle 2. Anzahl der Lesevorgänge von einem typischen Lauf für 36 Umweltproben auf einer Ion Torrent 314 Chip gemultiplext produziert.

Die Charakterisierung der mikrobiellen Gemeinschaft ist ein langjähriges Ziel in der Umweltmikrobiologie. Next-Generation-Sequencing-Methoden ermöglichen nun die Charakterisierung mikrobieller Gemeinschaften in einer noch nie dagewesenen Tiefe mit minimalem Kosten- und Arbeitsaufwand. Wir beschreiben hier unseren Ansatz zur Sequenzierung bakterieller ribosomaler 16S-RNA-Gene mit einem Tischsequenzierer.

Next-Generation-Sequenzierung der ribosomalen 16S-RNA Gene Amplikons

One of the major questions in microbial ecology is &#8220;who is there?&#8221; This question can be answered using various tools, but one of the ...

Das allgemeine Ziel dieses Verfahrens ist es, die 16S-rRNA zu sequenzieren. Gene, die aus Umweltproben mittels eines Tischsequenzierers amplifiziert wurden. Dies wird erreicht, indem zunächst das 16S-rRNA-Gen unter Verwendung modifizierter Primer amplifiziert wird.Der zweite Schritt besteht darin, die Amplifikationsprodukte zu reinigen, zu quantifizieren und zu mischen. Anschließend werden die Amplikon-Mischungen an Sequenzierungs-Kügelchen gebunden, die während der Emulsions-PCR klonal amplifiziert wurden, und auf einem Tischsequenzierer sequenziert. Der letzte Schritt ist die Analyse der resultierenden Sequenzdatensätze. Schließlich wird die 16S-rRNA-Gen-Amplicon-Sequenzierung verwendet, um die Zusammensetzung und Vielfalt der mikrobiellen Gemeinschaft in einer Umweltprobe zu bestimmen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber etablierten Methoden wie DGG oder Klonierungssequenzierung liegt darin, dass sie einen tieferen und klareren Einblick in die Zusammensetzung und Vielfalt mikrobieller Gemeinschaften ermöglicht.Diese Methode kann Ihnen helfen, eine der zentralen Fragen der mikrobiellen Ökologie zu beantworten: Wer ist vorhanden? Um die Vorwärts- und Rückwärtsprimer zu beginnen, verwenden Sie die beiden X hot start tac plus master mix und die Proben. Die Sequenz der Vorwärts- und Rückwärtsprimer entspricht der dargestellten Vorlage. Die Sequenz enthält Ion-Torrent-spezifische Adapter.Ein Sequenzierungsschlüssel zur Kalibrierung der Signalintensität zu Beginn der Sequenzierung. Führen Sie einen templatespezifischen Primer und einen 10 Basenpaare langen Barcode durch. Anschließend mischen Sie die Primer und Proben vor der Verwendung gründlich.Bereiten Sie eine PCR-Reaktion vor. Mischen Sie 20 Mikroliter pro Reaktion, die 0,5 Mikromolar des reversen Primers, 0,4 Milligramm pro Milliliter BSA und einen X Hot-Start-Taq-Plus-Mastermix enthalten. Pipettieren Sie anschließend 18,5 Mikroliter des Mastermixes in jedes PCR-Röhrchen und geben Sie 0,5 Mikroliter einer 20-Millimolar-Stammlösung des vorwärts gerichteten Primers, die einen unterschiedlichen Barcode enthält, zu jeder Probe hinzu, die gemeinsam sequenziert wird.Dann außerhalb der PCR-Haube ein Mikroliter einer Probe mit einer Konzentration von einem bis 10 Nanogramm pro Mikroliter zur PCR-Röhre hinzufügen. Ein Programm mit einer initialen Denaturierung von 95 Grad Celsius für fünf Minuten einstellen. Anschließend 25 Zyklen bei 95 Grad Celsius für 30 Sekunden.55 Grad Celsius für 30 Sekunden und 72 Grad Celsius für 45 Sekunden. Die endgültige Verlängerung sollte bei 72 Grad Celsius für 10 Minuten erfolgen. Stellen Sie die Röhrchen in eine PCR-Maschine und starten Sie das Programm.Die endgültigen PCR-Produkte können bis zur Verwendung bei vier Grad Celsius oder minus 20 Grad Celsius aufbewahrt werden. Bereiten Sie ein 2 %iges Agarosegel unter Verwendung der größten verfügbaren Kämme vor. Mischen Sie dann fünf Mikroliter Sechs-mal-Gel-Ladepuffer mit jeder PCR-Reaktion und laden die Proben auf das Gel, wobei jede Probe durch eine leere Position getrennt wird.Wir führen das Gel 50 Minuten lang bei 70 Volt durch. Nach dem Lauf des Gels machen Sie ein Bild des Gels und schneiden die Banden mit einem Skalpell aus. Jede Bande sollte etwa 250 Basenpaare lang sein, wobei ein 190 Basenpaare langes Produkt sowie 63 Basenpaare, die die Adapter und Barcodes bilden, enthalten sind.Als Nächstes wiegen Sie die ausgeschnittenen Banden und führen Sie die Gelextraktion und Reinigung der PCR-Produkte durch. Verwenden Sie dazu ein Kit wie das Kayak Quick Gel Extraction Kit, quantifizieren Sie jedes PCR-Produkt mit Pico Green und stellen Sie Verdünnungen her, um eine Stammlösung mit fünf mal 10 hoch neun Molekülen pro Mikroliter zu erhalten, was ungefähr einem Nanogramm pro Mikroliter entspricht. Falls einige Proben eine geringere Amplifikation aufweisen, passen Sie die Konzentration entsprechend an, unterschreiten Sie jedoch nicht 1,57 mal 10 hoch sieben Moleküle pro Mikroliter.Poolen Sie 10 Mikroliter jedes verdünnten PCR-Produkts, um einen äquimolaren Pool von Proben zu erhalten; bereiten Sie für jeden geplanten Sequenzierungslauf einen separaten Pool vor. Die gepoolten PCR-Produkte können bis zur Verwendung für die Emulsions-PCR im Gefrierschrank aufbewahrt werden. Verdünnen Sie die gepoolten PCR-Produkte anschließend auf 26 Pikomolar in einem Volumen von 25 Mikrolitern und verwenden Sie die Reagenzien aus einem Ion PGM Template Kit.Arbeiten Sie anschließend in einer PCR-Haube und bereiten Sie die Emulsions-PCR vor. Mischen Sie die gepoolten PCR-Produkte, und die Sphärenpartikel können bei Arbeit am Laborplatz zugegeben werden. Vermengen Sie die Lösung gründlich und geben Sie danach das Gemisch in eine Filterpatrone, die vorsichtig mit Emulsionsöl überschichtet wird.Danach das Filterkartusche langsam umdrehen und in das automatisierte Emulsions-PCR-Gerät einsetzen. Anschließend das geeignete Programm auswählen und den Vorgang starten. Nach Abschluss der automatisierten Emulsions-PCR das Überstandmedium aus den Sammelröhrchen entfernen und die Sphärenpartikel am Boden der Röhrchen gewinnen. Resus.Suspendieren Sie die Sphären in 100 Mikrolitern Waschlösung und entnehmen Sie ein zwei Mikroliter großes Aliquot zur Bibliotheksquantifizierung. Um die PCR-Produkte zu sequenzieren, bereiten Sie einen Sequenzierlaufplan vor, der die Einzelheiten des Sequenzierlaufs festlegt. Öffnen Sie dann das Gerät, klicken Sie auf „Initialisieren“ und installieren Sie, wenn dazu aufgefordert, Waschlösung Nummer zwei, Waschlösung Nummer eins und die automatische pH-Pufferlösung in das Sequenziergerät.Als Nächstes fahren Sie mit dem Initialisierungsverfahren fort und fügen bei Aufforderung die D-A-T-P-D-G-T-P-D-C-T-P- und DTTP-Nukleotide in ihre jeweiligen 50-Milliliter-Röhrchen hinzu. Danach schrauben Sie die Röhrchen auf das Sequenziergerät und setzen das Initialisierungsverfahren fort. Sobald das Initialisierungsverfahren abgeschlossen ist, starten Sie unverzüglich das Probenaufladeverfahren, um die Proben für die Sequenzierung vorzubereiten.Zentrifugieren Sie die angereicherten Sphären aus der Emulsions-PCR bei 15.500 × g für 1,5 Minuten, um die Sphären am Boden des Reaktionsgefäßes zu sammeln. Entfernen Sie anschließend die S natin und lassen Sie genau drei Mikroliter im Reaktionsgefäß zurück. Geben Sie danach drei Mikroliter des Sequenzierungsprimers zum Reaktionsgefäß hinzu und pipettieren Sie mehrmals auf und ab, um die Partikel erneut in Suspension zu bringen und die Lösung gründlich zu mischen.Inkubieren Sie das Reagenzglas zwei Minuten lang bei 95 Grad Celsius und anschließend zwei Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Nach Abschluss der Inkubation fügen Sie ein Mikroliter Polymerase hinzu, mischen gründlich und inkubieren die Mischung fünf Minuten lang bei Raumtemperatur. Während die Mischung inkubiert wird, laden Sie den Sequenzierchip in den Sequenzierer und führen eine Qualitätsprüfung des Chips durch.Entfernen Sie anschließend die Flüssigkeit vom Chip durch eine kurze Zentrifugation in einem Mikrozentrifugiergerät. Geben Sie die Probe in den Chip, indem Sie langsam sieben Mikroliter der Enzymsphären-Mischung aufpipettieren und dabei vermeiden, Blasen im Chip einzuschließen. Sobald die Probe in den Chip aufgebracht ist, setzen Sie den Chip in das Gerät ein und starten den Sequenzierlauf.Um mit der Analyse der Daten zu beginnen, stellen Sie eine Verbindung zum Sequenzierungsdatenserver her und laden Sie die FASTQ-Datei herunter. Erstellen Sie anschließend eine tabulatorgetrennte Oligo-Datei, die die Primer- und Barcode-Informationen enthält. Laden Sie danach die Green-Genes-Referenzdateien von der Mother-Website herunter, starten Sie Mother und führen Sie die Analyse durch.Konvertieren Sie die FASTQ-Dateien mithilfe des unten auf dem Bildschirm angezeigten Befehls in eine Fast-A-Qualitätsdatei. Bestimmen Sie die Gruppenzugehörigkeit jeder Sequenz und schneiden Sie die Sequenzen ab. Klassifizieren Sie anschließend die Sequenzen anhand dieses Befehls in der Green-Genes-Taxonomie.Mithilfe dieses Befehls liegt die durchschnittliche Ausbeute bei Sequenzierung mit einem Three 14 Ship auf einem Ion Torrent PGM bei etwa 0,3 bis 0,5 Millionen. Hochwertige Reads nach der Filterung der Ergebnisse in Mother. Hier folgt eine typische Aufschlüsselung der Anzahl an Reads nach jedem Schritt dieses Next-Generation-Sequencing-Verfahrens. Dargestellt ist die durchschnittliche Gemeinschaftszusammensetzung auf Ebene der Phylum-Klasse aller 36 multiplexierten Umweltproben, die mit Primern, die auf den V-drei-bis-vier-Bereich des 16S-Ribosoms zielen, amplifiziert und mittels Mother One Master analysiert wurden.Diese Technik kann innerhalb von zwei Tagen durchgeführt werden, sofern sie ordnungsgemäß ausgeführt wird. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man 16S-ribosomale RNA-Amplicons mithilfe eines Tischsequenzierers sequenziert.

next-generation-sequencing-of-16s-ribosomal-rna-gene-amplicons

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Pyrosequencing ist eine vielseitige Technik, die mikrobielle Genom-Sequenzierung, die verwendet werden, um bakterielle Spezies identifizieren, diskriminieren Bakterienstämme und erkennen genetische Mutationen, die eine Resistenz gegen antimikrobielle Mittel werden erleichtert. In diesem Video, wird das Verfahren für die mikrobielle Amplikon Generation Amplikon pyrosequencing und DNA-Sequenzanalyse nachgewiesen werden.

Pyrosequencing für Mikrobielle Identifizierung und Charakterisierung

Matrixgestützte Laserdesorption/Ionisationszeit-Massenspektrometrie (MALDI-TOF MS) und molekulare Techniken (16S rRNA-Gensequenzierung) ermöglichen die Identifizierung seltener bakterieller Krankheitserreger in der Routinediagnostik. Das Ziel dieses Protokolls liegt in der Kombination beider Techniken, die zu genaueren und zuverlässigeren Daten führt.

Identifizierung von Rare bakteriellen Erregern von 16S rRNA-Gen-Sequenzierung und MALDI-TOF-MS

Wir beschreiben eine effiziente, robuste und kosteneffektive Methode zur Nukleinsäure von Tupfern zur Charakterisierung von Bakteriengemeinschaften Extraktion unter Verwendung von 16S rRNA-Gen-Amplikons Sequenzierung. Das Verfahren ermöglicht eine gemeinsame Verarbeitungsansatz für mehrere Probenarten und beherbergt eine Reihe von nachgelagerten analytischen Prozessen.

Effiziente Nukleinsäure-Extraktion und 16S rRNA Gen-Sequenzierung für bakterielle Gemeinschaft Charakterisierung

Ein Protokoll zur Quantifizierung von bakteriellen 16S rRNA-Genen und Transkripten aus Küstensedimenten mittels Echtzeit-PCR wird bereitgestellt. Die Methodik umfasst die Co-Extraktion von DNA und RNA; Herstellung von DNA-freier RNA; und Quantifizierung von 16S rRNA-Genen und -Transkripten mittels RT-q-PCR, einschließlich Standardkurvenkonstruktion.

Gleichzeitige DNA-RNA-Extraktion aus Küstensedimenten und Quantifizierung von 16S rRNA-Gene und Transkripte von Real-time PCR

Metagenomik wurde verwendet, um das Mikrobiom von Silage-Rinderfutter zu untersuchen. Die Analyse wurde durch Schrotflintensequenzierung durchgeführt. Dieser Ansatz wurde verwendet, um die Zusammensetzung der mikrobiellen Gemeinschaft im Viehfutter zu charakterisieren.

Metagenomanalyse von Silage

Dieses Manuskript beschreibt ein detaillierte standardisierte Protokoll von Hochdurchsatz-16 s rRNA-Amplifikate Sequenzierung. Das Protokoll stellt eine integrierte, uniformierte Machbare und preiswerte Protokoll Kotprobe Sammlung durch Datenanalysen ab. Dieses Protokoll ermöglicht die Analyse einer großen Anzahl von Proben mit strengen Standards und mehrere Steuerelemente.

Geführte Protokoll für fäkale mikrobielle Charakterisierung von 16 s rRNA-Amplifikate Sequenzierung

Hier wird ein vereinfachtes Standard-Betriebsverfahren für die Mikrobiom-Profilierung mit 16S rRNA metagenomischer Sequenzierung und Analyse mit frei verfügbaren Werkzeugen beschrieben. Dieses Protokoll wird Forschern helfen, die neu im Mikrobiom-Bereich sind, sowie solchen, die Aktualisierungen von Methoden benötigen, um bakterielleS Profiling mit einer höheren Auflösung zu erreichen.

Mikrobiota-Analyse mit zweistufiger PCR- und 16S-rRNA-Gensequenzierung der nächsten Generation

Hier beschreiben wir die Phasen der Probenentnahme und Vorbereitung für RIBO-seq in Bakterien. Die Sequenzierung der nach diesen Richtlinien erstellten Bibliotheken liefert ausreichende Daten für eine umfassende bioinformatische Analyse. Das Protokoll, das wir präsentieren, ist einfach, verwendet Standard-Laborgeräte und dauert sieben Tage von der Lyse bis zur Beschaffung von Bibliotheken.

RIBO-seq in Bakterien: ein Probensammlungs- und Bibliotheksvorbereitungsprotokoll für die NGS-Sequenzierung

Dieses Protokoll beschreibt einen umfassenden Ansatz für die Kultivierung, Sequenzierung und De-novo-Hybridgenomassemblierung von Harnbakterien.   Es bietet ein reproduzierbares Verfahren zur Erzeugung vollständiger, zirkulärer Genomsequenzen, die bei der Untersuchung sowohl chromosomaler als auch extrachromosomaler genetischer Elemente nützlich sind, die zur Kolonisierung im Urin, zur Pathogenese und zur Verbreitung antimikrobieller Resistenzen beitragen.

Hybride De-Novo-Genomassemblierung zur Erzeugung vollständiger Genome von Harnbakterien unter Verwendung von Kurz- und Langzeitsequenzierungstechnologien

Eine grundlegende Aufgabe in der Zellbiologie ist es, die Mechanismen, die die Identität der Organellen, die eukaryotischen Zellen machen zu Grunde liegen zu definieren. Hier schlagen wir eine Methode, um die Gene verantwortlich für die morphologische und funktionelle Integrität der Anlage Organellen mittels Fluoreszenzmikroskopie und Next-Generation-Sequencing-Tools zu identifizieren.

Fluoreszenz-Mikroskopie Screening und Next-Generation-Sequencing: Nützliche Tools für die Identifizierung von Genen in den Organellen Integrität beteiligt

Lernen Sie die Next-Generation-Sequenzierung von 16S-rRNA-Gen-Amplikonen aus Umweltproben mit einem Benchtop-Sequenzer. Diese Methode ermöglicht die detaillierte Charakterisierung mikrobieller Gemeinschaften.

Next-Generation-Sequenzierung der ribosomalen 16S-RNA Gene Amplikons

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