Next-Generation-Sequenzierung der ribosomalen 16S-RNA Gene Amplikons

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die Sequenzierung von 16 S-R-R-N-A. Gene, die aus Umweltproben mit einer Tischsequenziermaschine amplifiziert wurden. Dies wird erreicht, indem zunächst das 16-S-R-R-N-A-Gen mit modifizierten Primern amplifiziert wird.

Der zweite Schritt besteht darin, die Amplifikationsprodukte zu reinigen, zu quantifizieren und zu poolen. Als nächstes wird der Amplikon-Pool an Sequenzierkugeln gebunden, die während der Emulsions-PCR klonal amplifiziert wurden, und auf einem Tischsequenzierer sequenziert. Der letzte Schritt besteht darin, die resultierenden Sequenzdatensätze zu analysieren.

Letztendlich 16 S-R-R-N-A. Die Genamplikon-Sequenzierung wird verwendet, um die Zusammensetzung und Diversität der mikrobiellen Gemeinschaft in einer Umweltprobe zu bestimmen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie DGG oder Klonsequenzierung besteht darin, dass sie einen tieferen und klareren Einblick in die Zusammensetzung und Vielfalt der mikrobiellen Gemeinschaften bietet.

Diese Methode kann Ihnen helfen, eine der Schlüsselfragen der mikrobiellen Ökologie zu beantworten: Wer ist da, um mit den Vorwärts- und Rückwärtsprimern zu beginnen? Die beiden X Hot Start Tac plus Master Mix und die Samples, die Reihenfolge der Forward und Reverse Primer passen auf das gezeigte Template. Die Sequenz enthält Ionen-Torrent-spezifische Adapter.

Eine Sequenzierungstaste zur Kalibrierung der Signalintensität zu Beginn der Sequenzierung. Führen Sie einen vorlagenspezifischen Primer und einen Barcode mit 10 Basenpaaren aus. Mischen Sie dann die Primer und Proben vor der Verwendung gründlich an.

Bereiten Sie eine PCR-Reaktion vor. Mischen Sie 20 Mikroliter pro Reaktion, die 0,5 Mikromolar des Reverse-Primers, 0,4 Milligramm pro Milliliter BSA und ein X Hot-Start-Tac plus Mastermix enthalten. Pipettieren Sie anschließend 18,5 Mikroliter des Mastermixes in jedes PCR-Röhrchen und fügen Sie 0,5 Mikroliter einer 20 millimolaren Primer-Stammlösung hinzu, die jeder der Proben, die zusammen sequenziert werden, einen anderen Barcode enthält.

Geben Sie dann außerhalb der PCR-Haube einen Mikroliter einer Probe in einer Konzentration von einem bis 10 Nanogramm pro Mikroliter in das PCR-Röhrchen. Stellen Sie ein Programm mit einer anfänglichen Denaturierung von 95 Grad Celsius für fünf Minuten ein. Dann 25 Zyklen von 95 Grad Celsius für 30 Sekunden.

55 Grad Celsius für 30 Sekunden und 72 Grad Celsius für 45 Sekunden. Die endgültige Dehnung sollte 10 Minuten lang bei 72 Grad Celsius liegen. Legen Sie die Röhrchen in eine PCR-Maschine und starten Sie das Programm.

Die PCR-Endprodukte können bis zur Verwendung bei vier Grad Celsius oder minus 20 Grad Celsius gelagert werden. Bereiten Sie ein 2%Aros-Gel mit den größten verfügbaren Kämmen vor. Mischen Sie dann fünf Mikroliter mit sechs x Gelladefarbstoff mit jeder PCR-Reaktion und laden Sie die Proben auf das Gel, wobei Sie jede Probe durch ein leeres Schema trennen.

Lassen Sie das Gel 50 Minuten lang bei 70 Volt laufen. Nachdem das Gel ausgeführt wurde, machen Sie ein Foto des Gels und schneiden Sie die Bänder mit einem Skalpell ab. Es wird erwartet, dass jedes Band etwa 250 Basenpaare umfasst, die ein Produkt mit 190 Basenpaaren und 63 Basenpaaren enthalten, aus denen die Adapter und Barcodes bestehen.

Wiegen Sie anschließend die herausgeschnittenen Banden und fahren Sie mit der Gelextraktion und Reinigung der PCR-Produkte fort. Quantifizieren Sie dann mit einem Kit wie dem Kajak-Schnellgel-Extraktionskit jedes PCR-Produkt mit Picogrün und führen Sie Verdünnungen durch, um eine Stammlösung mit fünf mal 10 bis neun Molekülen pro Mikroliter zu erhalten, was ungefähr einem Nanogramm pro Mikroliter entspricht. Wenn einige Proben eine geringere Amplifikation aufweisen, passen Sie die Konzentration nach Bedarf an, aber gehen Sie nicht unter 1,57 mal 10 bis zum siebten Molekül pro Mikroliter.

10 Mikroliter jedes verdünnten PCR-Produkts poolen, um einen gleichen molaren Probenpool zu erhalten, und für jeden der geplanten Sequenzierungsläufe einen separaten Pool vorbereiten. Die gepoolten PCR-Produkte können im Gefrierschrank aufbewahrt werden, bis sie zur Herstellung einer Emulsion verwendet werden. Verdünnen Sie zunächst die gepoolten PCR-Produkte auf 26 Picamolar in einem Volumen von 25 Mikrolitern und extrahieren Sie die Reagenzien aus einem Ionen-PGM-Template-Kit.

Arbeiten Sie dann in einer PCR-Haube und bereiten Sie die Emulsions-PCR vor. Mischen Sie die gepoolten PCR-Produkte und die Kugelpartikel können bei der Arbeit auf dem Labortisch hinzugefügt werden. Mischen Sie die Lösung gründlich und geben Sie dann die Mischung in eine Filterpatrone und bedecken Sie sie vorsichtig mit Emulsionsöl.

Drehen Sie anschließend die Filterpatrone langsam um und laden Sie die Kartusche auf das automatisierte Emulsions-PCR-Gerät. Wählen Sie dann das entsprechende Programm aus und starten Sie den Vorgang. Nachdem die automatisierte Emulsions-PCR abgeschlossen ist, entfernen Sie den Überstand aus den Sammelröhrchen und holen Sie die Kugelpartikel am Boden der Röhrchen heraus. Wiederbelebung.

Suspendieren Sie die Kugeln in 100 Mikrolitern Waschlösung und nehmen Sie ein Aliquot von zwei Mikrolitern für die Quantifizierung der Bibliothek. Um die PCR-Produkte zu sequenzieren, bereiten Sie einen Sequenzierungslaufplan vor, der die Details des Sequenzierungslaufs angibt. Öffnen Sie dann das Gerät, klicken Sie auf Initialisieren und installieren Sie bei Aufforderung Waschlösung Nummer zwei, Waschlösung Nummer eins und die Auto-pH-Pufferlösung in das Sequenzierinstrument.

Setzen Sie als Nächstes den Initialisierungsvorgang fort und fügen Sie, wenn Sie dazu aufgefordert werden, die Nukleotide D-A-T-P-D-P-D-C-T-P und DTTP in ihre jeweiligen 50-Milliliter-Röhrchen hinzu. Schrauben Sie dann die Röhrchen auf die Sequenziermaschine und fahren Sie mit dem Initialisierungsvorgang fort. Sobald der Initialisierungsvorgang abgeschlossen ist, beginnen Sie sofort mit dem Laden der Probe, um die Proben für die Sequenzierung vorzubereiten.

Zentrifugieren Sie die angereicherten Kügelchen aus der Emulsions-PCR bei 15.500 G für 1,5 Minuten, um die Kügelchen am Boden des Röhrchens zu sammeln. Entfernen Sie dann das S Natin und lassen Sie genau drei Mikroliter in der Tube. Geben Sie als Nächstes drei Mikroliter des Sequenzierprimers in das Röhrchen und pipettieren Sie auf und ab, um die Partikel zu resuspendieren und die Lösung gründlich zu mischen.

Inkubieren Sie das Röhrchen zwei Minuten lang bei 95 Grad Celsius und dann zwei Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Wenn die Inkubation abgeschlossen ist, fügen Sie einen Mikroliter Polymerase hinzu und mischen Sie gut, dann inkubieren Sie die Mischung fünf Minuten lang bei Raumtemperatur. Während die Mischung inkubiert, laden Sie den Sequenzierungschip auf den Sequenzierer und führen Sie eine Chip-Qualitätsprüfung durch.

Anschließend wird die Flüssigkeit mit einer Schnellzentrifugation und einer Mikrozentrifuge vom Chip entfernt. Laden Sie die Probe in den Chip, indem Sie langsam sieben Mikroliter der Enzymkugelmischung nach unten pipettieren und dabei vermeiden, dass Blasen in den Chip gelangen. Sobald die Probe in den Chip geladen ist, setzen Sie den Chip in das Gerät ein und starten Sie den Sequenzlauf.

Um mit der Analyse der Daten zu beginnen, stellen Sie eine Verbindung zum Sequenzierungsdatenserver her und laden Sie die schnelle Q-Datei herunter. Erstellen Sie dann eine durch Tabulatoren getrennte Oligos-Datei, die die Primer- und Barcode-Informationen enthält. Laden Sie als Nächstes die Green Genes Referenzdateien von der Mutter-Website herunter, starten Sie mother und führen Sie die Analyse durch.

Konvertieren Sie die FASTQ-Dateien in eine schnelle Datei in hoher Qualität, indem Sie den Befehl am unteren Bildschirmrand verwenden. Bestimmen Sie die Gruppenmitgliedschaft jeder Sequenz und kürzen Sie die Sequenzen. Mit diesem Befehl klassifizieren Sie dann die Sequenzen in der Taxonomie der grünen Gene.

Mit diesem Befehl liegt die durchschnittliche Ausgabe bei der Sequenzierung mit einem Drei-14-Schiff auf einem Ionenstrom-PGM bei etwa 0,3 bis 0,5 Millionen. Lesevorgänge in guter Qualität, nachdem die Ergebnisse in der Mutter gefiltert wurden. Hier ist eine typische Aufschlüsselung der Anzahl der Reads nach jedem Schritt dieses Next-Generation-Sequencing-Verfahrens, hier gezeigt, ist die durchschnittliche Zusammensetzung der Gemeinschaft auf Stammklassenebene aller 36 gemultiplexten Umweltproben, die mit Primern amplifiziert wurden, die auf die V-, Drei- bis Vier-Region des 16-s-Ribosoms abzielen und mit dem Mother-One-Master analysiert wurden.

Diese Technik kann in zwei Tagen durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man 16 s ribosomale RNA-Bewerber mit einem Tischsequenziergerät