Tandem-Hochdruck-Schnell Einfrieren und Gefriersubstitution von Pflanzengeweben für die Transmissionselektronenmikroskopie

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, die zellulären Strukturen von Pflanzenzellen durch Hochdruck, Einfrieren und Schnellgefriersubstitution für die anschließende Visualisierung durch Transmissionselektronenmikroskopie zu immobilisieren. Dies wird erreicht, indem eine Gewebeprobe sorgfältig für das Einfrieren vorbereitet wird, indem sie mit einem Kryoprotektivum codiert wird, um sicherzustellen, dass das Gewebe beim Einfrieren unter hohem Druck minimal beschädigt wird. In einem zweiten Schritt wird die Probe schnell unter hohem Druck eingefroren, wodurch die Zellbestandteile immobilisiert und die Bildung von kristallinem Eis begrenzt wird, was zu Zellen mit intakter Morphologie führt.

Als nächstes wird eine schnelle freie Substitution durchgeführt, um das zelluläre Wasser durch organische Lösungsmittel zu ersetzen und Fixiermittel wie Osmiumtetroxid einzuführen, wodurch zelluläre Ultrastrukturen verknüpft und stabilisiert werden. Es werden Ergebnisse erzielt, die zeigen, dass das Hochdruckgefrieren und die Schnellgefriersubstitution die zellulären Strukturen und die Morphologie der Pflanzen auf der Grundlage der Transmissionselektronenmikroskopie effektiv erhalten. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der konventionellen chemischen Fixierung besteht darin, dass H-P-F-Q-F-S zelluläre Inhalte in Millisekundenzeiten immobilisiert und so die Artefaktbildung minimiert.

Im Allgemeinen ist das QFS-Protokoll für einen Anfänger eine Herausforderung, daher wird empfohlen, dass zwei Personen zusammenarbeiten, bis die Benutzer mit dem Verfahren vertraut sind. Persönliche Schutzausrüstung, einschließlich Kryo-Handschuhe und Schutzbrille, muss beim Umgang mit flüssigem Stickstoff immer getragen werden. Füllen Sie eine isolierte Box mit Kryo-Fläschchenhaltern mit flüssigem Stickstoff, so dass die Halter vollständig abgedeckt sind. Die Verwendung des Fixiermittels während der Schnellgefriersubstitution oder QFS beträgt 1 % Osmium, Tetroxid und 0,1 % Urinalacetat in Aceton.

Nach der Herstellung eines großen Volumens der Lösung unter Beachtung aller Sicherheitswarnungen werden Aliquots von 1,5 Millilitern in Kryo-Fläschchen abgegeben und gefroren in flüssigem Stickstoff gelagert. Legen Sie die entsprechende Anzahl markierter Kryofläschchen mit Gefriersubstitution oder FS-Medium in das Aluminium, zwei Halter im flüssigen Stickstoff. Mit diesem Protokoll können bis zu vier Scheiben mit jeweils einer einzelnen Probe etwa ein bis eineinhalb Stunden vor der Probenvorbereitung in ein einziges Fläschchen gelegt werden.

Der Hochdruck-Gefrierschrank muss eingeschaltet und für den Lauf vorbereitet werden. Dieses Protokoll erfordert auch Hefepaste als extrazelluläres Kryoprotektivum zum Füllen des Raums um die Probe. Im Probenträger etwas Backhefe mit einem etwa gleichen Volumen von 10 % Methanol mit einem Zahnstocher mischen, bis die Paste glatt ist.

Bei einer Konsistenz der Pfannkuchenmischung hängt die benötigte Pastenmenge von der Anzahl der Proben ab. Für 10 Proben oder weniger kann die Paste in einem Mikrozentrifugenröhrchen gemischt werden. Um eine Probe für das Hochdruckgefrieren oder HPF vorzubereiten, entfernen Sie ein interessantes Blatt von der Pflanze und legen Sie es vorsichtig auf ein Stück Zahnwachs oder eine andere Schnittfläche. Schneiden Sie mit einer 0,2-Millimeter-Stanze eine Probe aus dem Blatt heraus.

Der kritischste Teil dieses Verfahrens ist die Probenvorbereitung für das Laden in diesen Probenträger. Wenn die Probe schlecht gehandhabt wird, kann kein anderer Schritt die Schadenskosten ausgleichen. Arbeiten unter einem Präpariermikroskop. Suchen Sie die 0,2 Millimeter große Seite des Probenträgers vom Typ A und beschichten Sie ihn mit Hefepaste.

Legen Sie die Blattscheibe in den Probenträger, glätten Sie die Paste mit einem feinen Pinsel, so dass die Scheibe vollständig gefüllt ist und die Paste auf gleicher Höhe mit dem Rand des Halters ist. Legen Sie den Probenträger in den Probenhalter, der trocken und bei Raumtemperatur sein sollte, und bedecken Sie die Probe mit einem Probenträger vom Typ B mit einer flachen Fläche nach unten. Stellen Sie die zuvor vorbereitete Isolierbox auf die Maschine.

Bringen Sie die Probe im Probenhalter in den Hochdruckgefrierschrank. Setzen Sie den Probenhalter mit der Probe in den Hochdruckgefrierschrank ein. Starten Sie einen Gefrierzyklus, indem Sie die Düsenautomatiktaste drücken, der in ein oder zwei Sekunden abgeschlossen sein sollte und so schnell wie möglich funktioniert.

Nehmen Sie den Probenhalter von der Maschine und setzen Sie die Spitze ein. Halten Sie die Probe in den flüssigen Stickstoff in der isolierten Box. Tauchen Sie die Spitzen von zwei Pinzettenpaaren in den flüssigen Stickstoff, um sie nach dem Einfrieren zu kühlen.

Die Träger sollten nur mit flüssigem, stickstoffgekühlten Zangen gehandhabt werden, die unter dem flüssigen Stickstoff arbeiten. Öffnen Sie den Probenhalter, indem Sie ihn gegen den Uhrzeigersinn drehen, und entfernen Sie den Probenträger mit einer mit flüssigem Stickstoff gekühlten Pinzette aus dem Halter, wobei Sie darauf achten, dass sich die Scheibe immer im flüssigen Stickstoff oder Dampf befindet. Öffnen Sie ein Kryo-Fläschchen mit FS-Medien und setzen Sie den Deckel an die Seite der Schachtel.

Halten Sie das Kryo-Fläschchen mit einer vorgekühlten Pinzette fest und verwenden Sie die andere Pinzette, um die Scheibe in das Kryo-Fläschchen zu platzieren. Schrauben Sie den Deckel des Kryo-Fläschchens wieder auf und achten Sie darauf, dass kein flüssiger Stickstoff im Fläschchen eingeschlossen wird. Flüssiger Stickstoff dehnt sich während der Erwärmung um das 700-fache aus und jeder eingeschlossene flüssige Stickstoff kann während dieser Zeit Explosionen verursachen.

Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis alle gewünschten Proben eingefroren sind. Mehrere Blattscheiben mit demselben Probentyp können in dasselbe Fläschchen gegeben werden. Um mit den Vorbereitungen für die freie Substitution zu beginnen, tauchen Sie einen Aluminium-Heizblock 10 Minuten lang in flüssigen Stickstoff oder bis das Sieden des Keimes aufhört.

Legen Sie in der Zwischenzeit eine Schicht Trockeneis auf den Boden des Behälters, der als QFS-Kammer verwendet werden soll. Es kann ein Styroporbehälter oder Eiskübel mit zerstoßenem Trockeneis oder Pellets verwendet werden. Für dieses Verfahren wird ein Temperaturfühler benötigt.

Ein Thermoelement wird durch die Oberseite eines Kryo-Fläschchens platziert, so dass es den Boden des Röhrchens erreicht, und der Deckel des Röhrchens ist mit Harz versiegelt, damit keine Flüssigkeit austritt. Füllen Sie die Tube zu Beginn jedes QFS-Laufs mit 1,5 Millilitern Aceton. Achten Sie darauf, dass die Deckel der Fläschchen fest verschraubt sind, damit das FS-Medium während der fs nicht ausläuft.

Setzen Sie die Kryofläschchen mit den Proben zusammen mit dem Temperaturfühler schnell in die mittleren Reihen des Heizblocks ein. Beginnen Sie mit der Aufzeichnung der Temperatur mit isolierten Kryohandschuhen oder einer großen Pinzette. Gießen Sie den gesamten flüssigen Stickstoff aus dem Heizblock aus.

Achten Sie darauf, die Kryo-Fläschchen nicht auszugießen. Legen Sie den Block mit den Fläschchen in die Trockeneisschicht in der QFC-Kammer. Achten Sie darauf, dass der Block so platziert ist, dass die Rohre waagerecht, aber leicht nach oben geneigt sind.

Es sollte keine Leckage geben, wenn die richtigen Kryo-Fläschchen verwendet werden. Packen Sie die QFS-Kammer mit Trockeneis, so dass die FS-Röhren bedeckt sind. Obwohl es nicht notwendig ist, die Oberseite des Blocks abzudecken, setzen Sie den Deckel auf die Kammer.

Die QFS muss in einem Abzug durchgeführt werden. Platzieren Sie eine QFS-Kammer mit den Proben auf einem Plattform-Rotationsschüttler und drehen Sie sich 120 Minuten lang mit 125 U/min. Während dieser Zeit sollte die Temperatur des Blocks allmählich auf etwa minus 80 Grad Celsius ansteigen.

Das Rühren sorgt für eine Durchmischung der Komponenten für eine bessere fs. Entfernen Sie nach zwei Stunden das Trockeneis aus der Kammer. Heben Sie den Heizblock mit einem Kryohandschuh schnell aus der QFS-Kammer und gießen Sie das Trockeneis schnell in einen Sekundärbehälter.

Schütteln Sie noch eine Stunde weiter. In dieser Zeit soll die Temperatur auf etwa minus 15 Grad Celsius bis minus 20 Grad Celsius ansteigen. Nehmen Sie am Ende der Stunde die Proben und den Temperaturfühler aus der QFS-Kammer und legen Sie sie weitere 10 bis 15 Minuten bei Raumtemperatur auf den Shaker, bis sie Raumtemperatur erreichen.

Beenden Sie die Aufzeichnung der Temperatur, wenn die schnelle kostenlose Auswechslung durchgeführt wird. Entfernen Sie das FS-Medium vorsichtig mit einer Kunststoff-Transferpipette aus jedem Kryo-Fläschchen und geben Sie es in den entsprechenden Behälter für giftige Abfälle. Waschen Sie die Proben viermal mit 100%igem Aceton.

Sammeln Sie die ersten beiden Wäschen und geben Sie sie in den Giftmüllbehälter. Achten Sie darauf, dass Sie die Proben nicht verwerfen, wenn Sie das Aceton entfernen. Nachdem die Proben gewaschen wurden, entnehmen Sie die Gewebeproben mit einer feinen Pinzette aus dem Probenträger.

Halten Sie die Proben dabei mit Aceton feucht und arbeiten Sie sehr vorsichtig, um ein Zerbrechen der Proben zu vermeiden. Es ist nicht ungewöhnlich, dass die Hefepaste von den Proben abfällt. Zu diesem Zeitpunkt ist die Hefepaste in der Regel sehr dunkelbraun, während das Blattgewebe noch grün ist.

Oft fallen die Gewebeproben während der FS aus dem Probenträger, sammeln Sie die Proben mit einer Transferpipette in acetonhaltigen Kryofläschchen. Anschließend werden die Proben nach Standardprotokollen für die Transmissionselektronenmikroskopie vorbereitet. A.Eine typische Kurve für Temperaturänderungen während QFS ist in diesem Diagramm dargestellt.

Die Temperatur steigt rapide von minus 196 Grad Celsius an, die Temperatur von flüssigem Stickstoff auf etwa minus 80 Grad Celsius. Die Spitze zu Beginn des Laufs ist auf die Elektronik der Sonde zurückzuführen und spiegelt nicht die reale Temperaturmessung wider, nachdem HPF- und QFS-Proben für die Betrachtung durch Transmissionselektronenmikroskopie vorbereitet wurden. Typische Ergebnisse sind in diesen Bildern von Blattproben eines Kaninchens opsis zu sehen.

Plasmamembranen, die glatt sind und gegen die Zellwand gedrückt werden, weisen auf eine gute Fixierung hin. Bei starker Vergrößerung ist ein verzweigtes Plasmadema sichtbar. Auch andere Organellen sind gut sichtbar.

Dazu gehören die Chloroplasten und die Thylakoide Mitochondrien, GOGI-Mikrotubuli und Plasmas desa, die großen zentralen VAEs bleiben intakt. Eine schlechte Handhabung während H-P-F-Q-F-S führt zu Artefakten, einschließlich Eiskristall-induzierter Beschädigung und Lyse. Bleiausfällungen können sich auch beim Färben von Schnitten bilden, sobald sie beherrscht sind.

Diese Technik kann in viereinhalb Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit flüssigem Stickstoff und Osmiumtetroxid äußerst gefährlich sein kann und dass bei der Durchführung dieses Verfahrens Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden sollten, einschließlich der Arbeit im Abzug und des Tragens persönlicher Schutzausrüstung wie Handschuhe, Laborkittel und Schutzbrille.