Ex-vivo-Kultur von Drosophila Pupal Hoden und Single männlichen Keim Online-Zysten: Dissection, Imaging und pharmakologische Behandlung

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, ex vivo-Kulturen von Drosophila, Pupillenhoden und Keimbahnzysten vorzubereiten, um Live-Bildgebungsstudien und Inhibitorbehandlungen zur Analyse postmiotischer Untersuchungen durchzuführen. Bei der Myogenese wird dies erreicht, indem zunächst intakte Hoden aus dem frühen Puy 24 Stunden nach der Puriumbildung präpariert werden. Der zweite Schritt besteht darin, einzelne Keimbahnzysten aus diesen Hoden zu präparieren, dann können intakte Hoden und einzelne Keimbahnzysten für Live-Imaging-Experimente verwendet werden. Alternativ besteht der nächste Schritt darin, die intakten Hoden oder die Keimbahnzyste mit Hemmstoffen zu inkubieren.

Letztendlich werden Immunfärbungen von Kürbissen, Hoden und Fluoreszenzmikroskopie eingesetzt, um die Wirkung der Behandlung zu überwachen. Der Hauptvorteil dieser ex vivo-Kulturtechnik gegenüber bestehenden genetischen Methoden besteht darin, dass sie den Zugang zur Dilo-Spermatogenese in postmiotischen Stadien ermöglicht. Im Allgemeinen haben Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten, da einige Erfahrungen erforderlich sind, um Pupillengewebe zu präparieren und zu handhaben.

Um das Experiment zu beginnen, verteilen Sie Tropfen mit 80 Mikrolitern Schilden und San M drei Insektenmedium mit fötalem Rinderserum und Antibiotika in eine 10 Zentimeter große Petrischale. Nehmen Sie dann mit einer breiten Pinzette eine Puppe und geben Sie sie auf einen Tropfen Medium auf der Schüssel. Übertragen Sie dann die Materialien auf ein Stereomikroskop, das mit einer faseroptischen Beleuchtung ausgestattet ist.

Achten Sie darauf, dass Sie die Hoden während der Dissektion mit der Pinzette Nummer fünf nicht über Raumtemperatur erhitzen. Fassen Sie die Puppe an ihrem hintersten Ende und halten Sie sie in Position. Fassen Sie die vorderen Kugeln mit einer weiteren Pinzette und öffnen Sie die Pupille mit einer Dauerwelle an ihrem vorderen Ende.

Ziehen Sie das Pupillengehäuse ab, bis zumindest ein Teil des Thorax freiliegt. Halten Sie die Puppe weiterhin an ihrem hintersten Ende in Position und lassen Sie den Innendruck der Puppe los, indem Sie beide Arme einer Pinzette in die Kopfregion der Puppe einführen. Reißen Sie anschließend die Puppe auf, indem Sie die Pinzette öffnen und die Pinzette in anteriore Richtung bewegen und achten Sie darauf, dass die Öffnung beim ersten Versuch so groß wie möglich ist.

Vermeiden Sie es, die Puppe an ihrem hinteren Ende zu beschädigen, bevor der Druck abgelassen wurde. Denn dies kann dazu führen, dass die Hoden direkt durch die kleine Öffnung geschoben und beschädigt werden. Sobald die Puppe geöffnet ist, drückt der abgelassene Innendruck der Puppe das Glomerat aus Fett, Körperzellen und Gewebe durch die große Öffnung heraus.

Vergrößern Sie dann die Öffnung mit einer Pinzette und vermeiden Sie es, die Puppe mit der Pinzette zu quetschen, da dies die Hoden beschädigen könnte. Halten Sie dann die Puppe an ihrem hintersten Ende fest. Das andere Paar Pinzetten und streift den Inhalt der Puppe vorsichtig von hinten nach vorne, um die Hoden von der Puppe zu lösen.

Prüfen Sie, ob die Pupillenhoden herausgedrückt wurden. Sie werden nicht mit anderen Geweben verbunden. Nach 24 Stunden Entnehmen Sie die Hoden mit einer vorgestanzten 200-Mikroliter-Pipettenspitze.

Übertragen Sie nur eine kleine Menge des Mediums, um die Anzahl der Fettkörperzellen zu reduzieren, die mit den Hoden transportiert werden. Legen Sie dann die Hoden in eine frische Kulturschale. Waschen Sie die Hoden mehrmals mit mittlerer Masse, bis nur noch wenige Fettkörperzellen für die Live-Bildgebung übrig sind.

Übertragen Sie die Hoden mit Medium in eine Kulturschale mit Glasboden und verwenden Sie ein inverses Bildgebungsmikroskop, um mit der Dissektion zu beginnen. Übertragen Sie einen oder mehrere Pupillenhoden in eine mit Medium gefüllte Kulturschale mit Glasboden. Verwenden Sie ein Stereomikroskop mit faseroptischer Beleuchtung und zwei Edelstahlnadeln für die Dissektion von männlichen Keimbahnzysten.

Mit einer Nadel vorsichtig feststecken, befindet sich ein Hoden an seinem vorderen oder hinteren Ende und hält ihn in Position. Führen Sie die andere Nadel in den Hoden ein und zerreißen Sie die Hodenscheide, indem Sie die Nadel zur Seite bewegen, wodurch viele der Zysten freigesetzt werden. Halten Sie einen Hoden weiterhin mit einer Nadel in Position.

Ziehe dann mit der anderen Nadel vorsichtig die restlichen Zysten aus dem Hoden heraus. Als nächstes trennen Sie aggregierte Zysten. Verwenden Sie eine 200-Mikroliter-Pipettenspitze, indem Sie die Zysten in eine frische Kulturschale mit Medium übertragen.

Stellen Sie dann die Kulturschale in ein inverses Bildgebungsmikroskop, um einzelne Zysten live zu fotografieren. Dispergieren Sie die Zysten ggf. wieder mit einer Nadel, identifizieren Sie das Stadium der Zysten mittels Phasenkontrast- und Fluoreszenzmikroskopie. Konzentrieren Sie sich auf eine Zyste des gewünschten Stadiums.

Bestätigen Sie häufig den Fokus und die Position der Zyste. Bei längeren bildgebenden Experimenten haften die Zysten nicht am Boden der Kulturschale. Beabsichtigen, unscharf zu schweben.

Füllen Sie jede Vertiefung einer 24-Well-Zellkulturplatte mit 500 Mikrolitern Medium für ein Experiment mit 12 Replikaten. Übertragen Sie dann mit einer vorgestanzten 200-Mikroliter-Pipettenspitze einen Pupillenhoden in jede Vertiefung. Überprüfen Sie anschließend mit einem inversen Fluoreszenzmikroskop das Vorhandensein von Protamin in den isolierten Hoden.

Die Hoden sollten frei von Protamin sein, B-E-G-F-P-Signal, was darauf hinweist, dass der Wechsel von His zu Protamin oder HP in keiner der Zysten stattgefunden hat. Ersetzen Sie Hoden, die bereits positive Zysten aufweisen. 500 Mikroliter Medium, das Endocarinsäure, die hemmende Verbindung, enthält, um eine Endkonzentration von 150 Mikromolar in einem Milliliter zu erreichen, werden in jede der ersten 12 Vertiefungen gegeben.

Verwenden Sie die verbleibenden Vertiefungen als unbehandelte Kontrollen, indem Sie 500 Mikroliter Medium mit Lösungsmittel hinzufügen. Dann inkubieren Sie die Platte bei fünf Grad Celsius für 24 Stunden im Dunkeln. Überprüfen Sie erneut, ob Protamin in den inkubierten Hoden

Die Kontrollhoden sollten nun eine oder mehrere Protamin-, B-E-G-F-P-positive Zysten aufweisen, was auf einen Übergang durch den HP-Schalter hinweist. Als nächstes übertragen Sie die Hoden mit einer Pipette mit einer 200-Mikroliter-Spitze auf mit Poly-L-Lysin beschichtete Objektträger. Führen Sie Kürbisvorbereitungen durch und färben Sie sie mit fluoreszierenden Antikörpern.

In Anlehnung an veröffentlichte Protokolle wurden mit dieser Dissektionsmethode Phasenkontrastbilder von Drosophila-Hoden erstellt. Hierbei handelt es sich um einen leicht gequetschten ganzen Reittierhoden einer Drosophila-Puppe. 24 Stunden nach der PY-Bildung oder einem PF sind die Spermien auf die vordere Spitze unterhalb der Nabenregion beschränkt.

Der verbleibende Hoden ist gefüllt mit Spermatozyten, Spermatiden im Nevin-Stromstadium mit runden Kernen und Spermatiden in länglichen Stadien mit wachsenden Flagellenüberlagerungen des Phasenkontrasts, EGFP- und RFP-Fluoreszenzbilder von Pupillenhoden wurden zum Nachweis von H, zwei A-V-D-R-F-P und Protamin B-E-G-F-P bei 24 Stunden A PF erhalten. Keines der Spermatide hat den HP-Wechsel häufig durchlaufen. Die Hoden, die in diesem Stadium präpariert werden, enthalten eine Autofluoreszenzstruktur. Ein Pupillenhoden wird 36 Stunden präpariert Ein PF zeigt die erste Protamin-, B-E-G-F-P-positive Zyste.

Pupillenhoden 48 Stunden A PF haben mehrere Keimbahnzysten mit sichtbaren Protamin-positiven Kernen. Es können ex vivo Live-Bilder von ganzen Hoden, die sich in Kultur entwickeln, im Zeitraffer aufgenommen werden. Mit dieser Methode wurde ein Pupillenhoden 45 Stunden lang präpariert, ein PF sechs Stunden lang in Medium inkubiert und alle fünf Minuten abgebildet.

Innerhalb dieses Zeitrahmens treten mehrere Zysten von Spermatiden aus dem HP-Switch-Stadium auf und zeigen ein helles Protamin-B-E-G-F-P-Signal. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie frühe Pupillenhoden und einzelne Keimbahnzysten in Kultur erhalten, um in vivo Bildgebung oder Inhibitorbehandlungen durchzuführen.