Mess Flüsse von Mineralstoffen und Giftstoffe in Pflanzen, die mit radioaktiver Tracer

In planta ist die Messung von Nährstoff- und Giftstoffflüssen essentiell für die Untersuchung der Pflanzenernährung und Toxizität. Hier behandeln wir Radiotracer-Protokolle zur Bestimmung des Ein- und Ausflusses in intakten Pflanzenwurzeln am Beispiel von Kalium- (K⁺) und Ammoniak/Ammonium-Flussmitteln (NH₃/_{NH 4}⁺). Vorteile und Grenzen solcher Techniken werden diskutiert.

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, die unidirektionalen Flüsse von Kalium und Ammoniak in und aus den Wurzeln intakter Gerstensämlinge zu messen und die Funktion wichtiger Nährstofftransportsysteme in Pflanzenmembranen zu charakterisieren. Dies wird erreicht, indem die Sämlinge zunächst eine Woche lang in hydroponischen Lösungen mit spezifischer chemischer Zusammensetzung gezüchtet werden, um sicherzustellen, dass sich die Pflanzen in einem ernährungsphysiologisch stabilen Zustand befinden. Die hydroponische Kultur ermöglicht es, Wurzeln für experimentelle Manipulationen zugänglich zu machen.

In einem zweiten Schritt werden die Wurzeln intakter Pflanzen für unterschiedliche Zeiträume in experimentelle Lösungen getaucht, einschließlich Aufnahmelösungen, bei denen das Substrat von Interesse mit seinem radioaktiven Isotop versetzt ist. Dieser Schritt wird verwendet, um die Transportgeschwindigkeiten in und aus den Setzlingen zu bestimmen. Anschließend werden die Pflanzen entweder unmittelbar nach einer kurzen Aufnahmephase für unidirektionale Einstromexperimente präpariert oder nach längerer Aufnahme in einen FLX-Trichter überführt, um die Tracerfreisetzung zu messen.

Mit Hilfe der Kompartimentanalyse mittels tracer, flx oder Kate werden Ergebnisse erhalten, die Schlüsselaspekte der Kapazität, Energetik, Mechanismen und Regulation von Transportsystemen aufdecken können. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Zusammenhang mit der Ernährungsphysiologie der Pflanzen zu beantworten, z. B. wie Mineralstoffe und Giftstoffe in und aus Pflanzen transportiert werden. Wie reagieren solche Flüsse auf sich verändernde Umgebungen und wie beeinflussen sie die Zell- und Gewebekompartimentierung von Substraten?

Und schließlich, wie beeinflussen abiotische Stressfaktoren, die ökologische Umgebungen in der Landwirtschaft beeinträchtigen, wie z. B. Salzgehalt, Dürre und Schwermetalltoxizität, die Nährstoffflüsse und die Dynamik der Pflanzen? Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie Substratverarmungs- oder Akkumulationsassays oder eisenselektiven Vibrationselektrodenmessungen besteht darin, dass wir in der Lage sind, unidirektionale Flüsse im Gegensatz zu Nettobiegungen zu messen, was einen Unterschied zwischen Influx und eFlex darstellt. Auf diese Weise können wir wertvolle Einblicke in die Kapazität der Energetik, die Mechanismen und die Regulation von Transportsystemen für Pflanzennährstoffe und Rauschmittel gewinnen.

Die Modellart Gerste wird in diesem Experiment verwendet, die Gerstensämlinge einen Tag vor dem Experiment sieben Tage lang hydroponisch in einer klimatisierten Wachstumskammer züchten, mehrere Sämlinge zu einem einzigen Replikat bündeln. Wickeln Sie ein zwei Zentimeter langes Stück Tigon-Schlauch um den basalen Teil der Rutschen und befestigen Sie den Schlauch mit Klebeband, um einen Kragen zu erstellen. Verwenden Sie drei Pflanzen pro Bündel für den Direkteinfluss- oder DI-Assay und sechs Pflanzen pro Bündel für die Kompartimentanalyse mittels Tracer-, flx- oder Kate-Assay einen Tag vor dem Experiment.

Bereiten Sie die folgenden Materialien und Lösungen für DI vor: Sammeln Sie Vormarkierungs-, Markierungs- und DESORPTIONSLÖSUNGEN, Zentrifugationsröhrchen und Probenfläschchen, belüften und mischen Sie alle Lösungen für Kate. Sammeln Sie die folgenden Brunnen. Gemischte belüftete Markierungs- und Elutionslösungen, Exfluxtrichter, Zentrifugationsröhrchen und Probenfläschchen.

Bereiten Sie die Radiotracer am Tag des Experiments gemäß allen Anforderungen der Lizenz für radioaktive Stoffe der Institution vor. Tragen Sie geeignete Sicherheitsausrüstung und Dosimeter und verwenden Sie geeignete Abschirmungen für die Vorbereitung des radioaktiven Kaliumisotops. Kalium 42.

Stellen Sie ein sauberes, trockenes Becherglas auf die Waage und stellen Sie die Waage auf Null. Nehmen Sie ein Fläschchen mit dem Tracer aus der Verpackung und gießen Sie das Pulver in das Becherglas. Achten Sie auf die Massenpipette, 19,93 Milliliter destilliertes Wasser in das Becherglas zu geben, gefolgt von 0,07 Millilitern Schwefelsäure.

Anschließend wird die Konzentration der radioaktiven Stammlösung berechnet. Verwenden Sie angesichts der Masse und des Molekulargewichts von Kaliumcarbonat sowie des Volumens der Lösung einen Geiger-Müller-Zähler, um routinemäßig auf Kontamination zu überwachen. Das radioaktive Stickstoff-13-Isotop wird in einem Zyklotron erzeugt und kommt als Flüssigkeit für DI-Messungen an.

Pipettieren Sie unter Verwendung von Kalium 42 die Menge an radioaktiver Stammlösung, die erforderlich ist, um die gewünschte Endkonzentration von Kalium in die Markierungslösung zu erreichen. Pipettieren Sie bei DI-Messungen mit Stickstoff 13 eine kleine Menge von weniger als 0,5 Millilitern des Radiotracers in die Markierungslösung. Lassen Sie die Markierungslösung durch Belüftung gründlich durchmischen. Pipettieren Sie anschließend eine Teilprobe von einem Milliliter Markierungslösung in jedes der vier Probenfläschchen.

Messen Sie die Radioaktivität in den Fläschchen mit einem Gammazähler. Stellen Sie sicher, dass der Zähler so programmiert ist, dass die Zählungen pro Minute oder die CPM-Messwerte korrigiert werden. Für den Isotopenzerfall, der für kurzlebige Tracer besonders wichtig ist, ist die spezifische Aktivität der Markierungslösung S nicht ausgedrückt als Zählungen pro Minute pro Mikromol zu berechnen, indem die Zählungen der vier Proben gemittelt und durch die Konzentration des Substrats in der Lösung dividiert werden, die Gerstenwurzeln fünf Minuten lang in eine nicht-radioaktive Vormarkierungslösung getaucht werden, um die Pflanzen unter Testbedingungen vorauszugleichen.

Tauchen Sie danach die Wurzeln fünf Minuten lang in die radioaktive Markierungslösung. Übertragen Sie die Wurzeln für fünf Sekunden in eine DESORPTIONSLÖSUNG, um den Großteil der an der Oberfläche haftenden Radioaktivität zu entfernen. Dann die Wurzeln für fünf Minuten in ein zweites Becherglas mit Desorptionslösung geben.

Um die Wurzeln weiter von extrazellulärem Tracer zu befreien, präparieren und trennen Sie die Triebe, Basaltriebe und Wurzeln. Legen Sie die Wurzeln in Zentrifugenröhrchen und schleudern Sie die Proben 30 Sekunden lang in einer Zentrifuge mit niedriger Geschwindigkeit in klinischer Qualität. Um Oberflächen- und Interstitielles Wasser zu entfernen, wiegen Sie die Wurzeln, um das frische Gewicht zu erhalten.

Messen Sie die Radioaktivität in den Pflanzenproben mit einem Gamma-Zähler, berechnen Sie den Zustrom in die Pflanze mit dieser Formel. Beginnen Sie diesen Vorgang, indem Sie die Markierungslösung vorbereiten und den S-Knoten messen, wie zuvor gezeigt. Nach der Messung von s wird jede Probe mit 19 Millilitern Wasser befüllt, so dass das Endvolumen dem EIT-Volumen von 20 Millilitern entspricht.

Zählen Sie die Radioaktivität in jeder 20-Milliliter-Probe. Tauchen Sie die Wurzeln eine Stunde lang in die Etikettierlösung. Nach einer Stunde nehmen Sie die Pflanzen aus der Markierungslösung und geben Sie sie in den FLX-Trichter, wobei Sie darauf achten, dass sich das gesamte Wurzelmaterial im Trichter befindet.

Befestigen Sie die Pflanzen vorsichtig an der Seite des Ausflusstrichters, indem Sie einen kleinen Streifen Klebeband über den Plastikkragen kleben. Gießen Sie den ersten Elu vorsichtig in den Trichter. Starten Sie einen Timer, um in Sekunden hochzuzählen, und öffnen Sie nach 15 Sekunden den Zapfhahn und sammeln Sie das EIT im Probenfläschchen. Schließen Sie den Zapfhahn und gießen Sie vorsichtig das nächste EIT in den Trichter.

Auf diese Weise wird das EIT für den Rest der Elucian-Reihe für einen EU-Zeitraum von insgesamt 29,5 Minuten erfasst. Sobald das EU-Protokoll abgeschlossen ist, ernten Sie die Pflanzen wie oben gezeigt, zählen Sie die Radioaktivität in den EIT und die Pflanzenproben mit dem Gamma-Zähler, multiplizieren Sie den Messwert für jedes EIT mit dem Verdünnungsfaktor, stellen Sie die Tracerfreisetzung als Funktion der Elutionszeit für stationäre Bedingungen dar, führen Sie lineare Regressionen und Berechnungen der Flüsse durch. Halbe Lügen von Austausch und Poolgrößen.

Hier sind repräsentative Isothermen für den Ammoniakeinstrom in Abhängigkeit von unterschiedlichen externen Ammoniakkonzentrationen dargestellt. In intakten Wurzeln von Gerstensämlingen, die mit hohem Ammoniak- oder Ammoniumgehalt und entweder niedrigem oder hohem Kaliumgehalt angebaut wurden, waren die Ammoniakflüsse bei McKaylas mit niedrigem Kaliumgehalt signifikant höher. Meninanalysen der Isothermen zeigen, dass ein hoher Kaliumgehalt einen relativ geringen Einfluss auf die Substrataffinität der Ammoniakaufnahmetransporter hat, aber die Transportkapazität deutlich reduziert.

Das nächste Ergebnis unterstreicht die schnelle Plastizität des Kaliumaufnahmesystems. In Wurzeln von intakten Gerstensämlingen, die bei mäßigem Kalium- und Ammoniumgehalt angebaut werden. Ein Anstieg des Kaliumeinstroms um fast 350 % wurde innerhalb von fünf Minuten nach der Ammoniumentnahme aus der externen Lösung beobachtet.

Dieser Ammoniumentzugseffekt reagierte empfindlich auf die Kaliumkanalblocker, Tetraethylammonium, Barium und Cäsium. Diese Diagramme zeigen das Steady-State-Kalium 42 efl in den Wurzeln von intakten Gerstensämlingen, die mit niedrigem Kaliumgehalt und mäßigem Nitratgehalt angebaut wurden, und die unmittelbaren Auswirkungen von 10 Millimolar Cäsiumchlorid, fünf Millimolar Kaliumsulfat und fünf Millimolar Ammoniumsulfat auf flx Kalium flx wurde entweder durch Cäsium oder Kalium gehemmt, aber durch Ammonium stimuliert. Cate kann auch verwendet werden, um Konzentrationen und Umsatzzeiten des Substrats in subzellulären Kompartimenten abzuschätzen.

Die Regressionsanalyse der sich langsam austauschenden Phase der Tracerfreisetzung zusammen mit der Tracerretention in pflanzlichen Geweben kann wichtige Informationen über die Poolgröße und die Halbwertszeiten des Austauschs von subzellulären Komponenten wie Zellwand, Zytoplasma und va liefern. Diese Tabelle zeigt Cape-Parameter, die aus Messungen von Steady-State-Kalium 42 flx in Gerstensämlingen extrahiert wurden, die entweder mit einem Millimolarnitrat oder 10 Millimolar Ammonium angebaut wurden. Letzteres stellt ein toxisches Szenario dar.

Hoher Ammoniumgehalt führt zu einer Unterdrückung aller Kaliumflüsse und zu einer deutlichen Abnahme der Beckengröße. Einmal gemeistert, kann die Effizienz der DI-Methodik durch gestaffelte Behandlungen im Abstand von 30 Sekunden verbessert werden. Dabei können wir bis zu 10 Zustände in einem einzigen Experiment untersuchen.

In ähnlicher Weise können mehrere Kate-Läufe gleichzeitig durchgeführt werden, wenn genügend Zeit zwischen den Läufen vorhanden ist. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man den Fluss von Nährstoffen und Rauschmitteln in intakten Pflanzen mit Hilfe von radioaktiven Tracern messen kann.