Nicht-enzymatische, Serumfreie Zellkultur von Pre-invasive Brustläsionen für Spontane Erzeugung Mammospheres

Primärzellkultur unter Verwendung von intaktem Gewebe Organoiden stellt ein Modellsystem, das die multizellulären Mikroumgebung in vivo nachahmt. Wir entwickelten ein Serum-freien Primär Brustepithel Gewebekulturmodell, das gemischte Zellkultur-Linien und Exponate differenzierte Morphologie perpetuiert, ohne enzymatische Gewebezerstörung. Breast Organoiden lebensfähig bleiben für> 6 Monate.

Das übergeordnete Ziel des folgenden Versuchs ist es, nicht enzymatisch gestörtes steriles Brustgewebe zu kultivieren, das Bereiche mit insi duktalen Karzinomen oder DCIS-Läsionen enthält, um die spontane Bildung von Mammosphären in vitro zu erzeugen. Dies wird erreicht, indem kleine Stücke des Brustgewebes, die duktale Segmente enthalten, teilweise in ein minimales Volumen an freiem Serummedium getaucht werden, um einen Sauerstoff- und Nährstoffgradienten innerhalb des Organoids zu schaffen. Anschließend werden die Organoide ungestört kultiviert, bis die Epithelzellen und Fibroblasten aus den offenen Gängen austreten und sich an den Gewebekulturkolben anheften.

Letztlich kann der epitheliale Ursprung der daraus resultierenden spontanen Mam-Ophere-Bildung sowohl durch direkte mikroskopische Untersuchung als auch durch Immunfluoreszenzfärbung bestätigt werden. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, die eine enzymatische Dissoziation des Brustgewebes verwenden, besteht darin, dass unsere DCIS-Organoidkultur der Brust den biologischen Kontext der duktalen Mikroumgebung beibehält, ohne die zellulären In-vivo-Interaktionen zu stören. Obwohl diese Methode einzigartige Einblicke in die Biologie des duktalen Mammakarzinoms in situ liefern kann, können zwei auch auf andere Arten von präinvasiven neoplastischen Läsionen angewendet werden, wie z. B. intraepitheliale oder intraepitheliale Neoplasien der Bauchspeicheldrüse.

Bei diesem Eingriff ist darauf zu achten, dass das Gewebe während des Transports zwischen dem Operationssaal und dem Gewebeverarbeitungsbereich steril bleibt. Darüber hinaus sollten die Instrumente und Reagenzien, die für die Gewebeverarbeitung verwendet werden, steril sein, um eine Kontamination zu vermeiden. Vor der Entnahme der Gewebeproben desinfizieren Sie zunächst den Arbeitsbereich mit 70%igem Ethanol und öffnen Sie ein Paar sterile Handschuhe, indem Sie die Hülle auf die Arbeitsfläche legen. Legen Sie die sterile Innenseite der Handschuhhülle mit der Vorderseite nach oben und ziehen Sie dann die Handschuhe an.

Reinigen Sie anschließend die Oberfläche des Probenbehälters mit 70 % Ethanol und entfernen Sie die Plastikfolie vom Behälter. Legen Sie die Brusttaschentuchprobe auf die Handschuhhülle und tauchen Sie dann zwei Wattestäbchen in die Gewebemarkierungsfarbe. Rollen Sie die Tupfer über die Gewebeoberfläche, um den Farbstoff auf das Gewebe aufzutragen, tupfen Sie das gefärbte Gewebe mit einem Stück essiggetränkter Gaze ab und schneiden Sie dann das Brustgewebe in etwa fünf Millimeter dicke vertikale Stücke, ohne das Gewebe vollständig zu durchschneiden.

Das Gewebe steril zu halten, ist der wichtigste Teil des Eingriffs. Um den Erfolg zu gewährleisten, ist es wichtig, dass die Farbstoffe, Wattestäbchen, steriler Mullessig und Klingen leicht zugänglich sind, um eine Kontamination während der Tissueverarbeitung zu vermeiden. Palpieren Sie nun das Gewebe auf Verkalkungsbereiche ab und erkennen Sie die DCIS an ihrem charakteristischen festen blassen Aussehen, das von rötlichen, gummiartigen Rändern umgeben ist, die sich aufgrund von Kalziumspitzen körnig anfühlen.

Schneiden Sie alle Verkalkungsbereiche heraus, einschließlich einer kleinen Menge des umgebenden Brustgewebes. Geben Sie das Taschentuch dann in ein steriles 50-Milliliter-Röhrchen mit 20 bis 30 Millilitern nährstoffreichem Medium. Nachdem Sie das Röhrchen mehrmals umgedreht haben, um das Gewebe und das Medium zu mischen, ersetzen Sie den Überstand durch frisches Medium.

Legen Sie dann das Röhrchen in einen isolierten Behälter und transportieren Sie das Gewebe zum Gewebekulturlabor, um die Brustgewebezellen zu kultivieren. Gießen Sie das Taschentuch und eine kleine Menge des nährstoffreichen Mediums in eine sterile Petrischale. Schneiden Sie dann mit einem sterilen Skalpell das faserige Gewebe ab.

Nachdem Sie die fibrösen Stücke verworfen haben, schneiden Sie das Brustgewebe in etwa drei Quadratmillimeter große Stücke, wobei jedes Organoid mindestens ein erkennbares Gangsegment innerhalb des umgebenden Stromas enthält. Als nächstes werden die Organoide mit einer sterilen Pinzette in einen sterilen Gewebekulturkolben gegeben und 11 Milliliter frisch zubereitetes serumfreies nährstoffreiches Medium hinzugefügt. Schwenken Sie den Kolben, um die Organoide gleichmäßig im Medium zu verteilen, und inkubieren Sie den Kolben dann 48 Stunden lang bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2.

Legen Sie den Kolben am zweiten Tag, nach der Inkubation, vorsichtig auf einen inversen Mikroskoptisch, um ihn auf mögliche bakterielle oder pilzliche Kontamination zu prüfen, und achten Sie darauf, plötzliche scharfe Bewegungen oder Verwirbelungen des Kolbens zu vermeiden. Wird keine Kontamination festgestellt, so wird der Kolben für einen weiteren Tag in den Inkubator gestellt. Wenn eine Kontamination festgestellt wird, entsorgen Sie den Kolben und den Inhalt am dritten Tag nach der Inkubation in einem geeigneten Behälter.

Milliliter Medium für 20 bis 30 Minuten bei 37 Grad Celsius in einen sterilen Behälter geben. Ersetzen Sie dann, ohne die Organoide zu stören, das konditionierte Medium durch das vorgewärmte frische Medium. Drehen Sie den Kolben sehr vorsichtig, um das Medium über die Kolbenoberfläche zu verteilen, und setzen Sie den Kolben dann wieder in den Inkubator ein.

Sobald die organoiden Zellkolonien etabliert sind, wechseln Sie das Medium, wie gerade gezeigt, alle drei Tage. Nach 10 bis 14 Tagen in Kultur sind alle nicht anhaftenden Gewebestücke zu verwerfen, Mammosphären und 3D-Strukturen entstehen spontan aus mehreren unabhängigen menschlichen DCIS-Ganggewebefragmenten von verschiedenen Patienten, bei denen eine atypische duktale Hyperplasie oder ein duktales Karzinom in situ diagnostiziert wurde, weder Serum-Basalmembranextrakt noch gelartige Matrices sind für die spontane Bildung von Mammossphären erforderlich. Die Mammossphären erzeugen auch Mamma-Xenotransplantattumoren in einem NOD-Skid-Mausmodell mit dem gleichen Wachstumsmuster wie bei invasivem Krebs.

Diese Ergebnisse zeigen, dass Vorläuferzellen mit invasivem Potenzial in der menschlichen Brust, dem DCIS-Gang, existieren, aber anscheinend in der duktalen Nische gehalten und durch die duktale Nische kontrolliert und dazu gebracht werden können, in Organoidkulturen zu entstehen. Die epitheliale Herkunft der Mammossphären und Xenotransplantate, die aus DCIS-Mammosphären gewonnen wurden, kann durch Immunfluoreszenz bestätigt werden. Diese Bilder zeigen beispielsweise die Identifizierung von Mammossphären in einer Envivo-Kultur durch einen monoklonalen Antikörper der Maus, der auf humanes EPCA reagiert, sowie im Zentrum eines NOD-Skid-Xenotransplantats.

Die Mammoskugel, die neoplastische Epithelzellen in dieser repräsentativen Kultur bildete, stammten aus präinvasiven Brustläsionen, die keine Frank-Invasion oder Mikroinvasion aufwiesen. Die histopathologische Untersuchung des für die Organoidkultur verwendeten Gewebes ergab konfluente intraduktale Läsionen mit intakten Basalmembrangrenzen, was darauf hindeutet, dass die in diesem Kultursystem gebildeten spontanen Mammosphären nur aus präinvasiven neoplastischen Bereichen stammten. und waren nicht das Produkt seltener Gebiete mit Mikroinvasion. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, mit Radiologen, Pathologen und dem Forschungspersonal über die Notwendigkeit zu sprechen, die Sterilität des Gewebes während der Gewebevergrößerung oder der bildgebenden Untersuchungen aufrechtzuerhalten. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie Umkehrphasen-Protein-Microarrays oder Immunhistochemie durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten.

Wir können zum Beispiel fragen, wie das molekulare Profil der verschiedenen Zellpopulationen aussieht, die innerhalb dieses Kultursystems spontan entstehen. Unsere Technik hat Forschern auf dem Gebiet der Proteomik und Genomik den Weg geebnet, um die Autophagie, die Kalziumsignalgebung und die DNA-Reparatur in lebendem prämalignem Gewebe der Brust zu erforschen.