Orthotopische Injektion von Brustkrebszellen in das Brustfettpolster von Mäusen, das Tumorwachstum zu studieren.

Krebs ist eine komplexe Erkrankung, die durch den den Tumor umgebenden Gewebes sowie lokale pro- und anti-inflammatorischen Mediatoren beeinflusst wird. Daher kann orthotrope Pritzer, anstatt subkutanen Modellen nützlich sein, um Krebsprogression in einer Weise, dass eine bessere ahmt menschlichen Pathologie studieren.

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Progression der Brustzellen nach der Transplantation von Tumorzellen in das Gedächtnis-Fettpolster der Maus zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem Brustkrebszellen in das Gedächtnisfettpolster einer erwachsenen Maus injiziert und dann das Tumorvolumen mit einem Messschieber zu vorgegebenen Zeitebenen gemessen wird. Am Ende des Versuchs wurden die Tumormasse und das Tumorvolumen bestimmt und das Blut und die Lunge des Tieres für die weitere Analyse entnommen.

Letztendlich können Makro- und Mikrometastasen durch visuelle bzw. immunhistochemische Analyse quantifiziert werden. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der subkutanen Tumorzellinjektion besteht darin, dass die Injektionsstelle des Brustfettpolsters die ursprüngliche Stelle der Brusttumorbildung nachahmt, was zu zuverlässigeren Ergebnissen führt. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich Brustkrebs zu beantworten, z. B. welche Tumore, Suppressoren, Onkogene oder stromale Kompartimentkomponenten an der Krebsprogression beteiligt sind.

Einen Tag vor dem Eingriff rasieren Sie die N-O-D-S-C-I-D-Gamma-Mäuse von der vierten Brustwarze bis zur Mittellinie und wiegen sie, um sicherzustellen, dass alle Tiere ungefähr vergleichbare Gewichte haben. Waschen Sie am nächsten Tag eine menschliche Brust-Adenokarzinom-Zellkultur einmal mit PBS und versuchen Sie dann, die Zellen zu anisieren, wenn sich die meisten Zellen abgelöst haben. Quischen Sie die Reaktion mit 10 Millilitern DMEM-haltigem Serum ab und schleudern Sie die Zellen dann sieben Minuten lang bei 1.200 U/min bei Raumtemperatur, waschen Sie das Pellet, um alle Spuren von Serum zu entfernen, und resuspendieren Sie dann das zweite Pellet in PBS.

Nach der Zählung aliquotieren Sie die Zellen in Konzentrationen von 500.000 pro 150 Mikroliter in sterile Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis. Füllen Sie dann ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen mit 35 Millilitern PBS und ein weiteres mit 70 % Ethanol und tränken Sie Wattestäbchen darin. Wenn alle Werkzeuge für jedes Tier bereit sind, tragen Sie eine Augensalbe auf die Augen des Tieres auf.

Verwenden Sie dann Klebeband, um eine betäubende Maus sanft auf einem Heizkissen festzuhalten und die Sedierung durch Zehenkneifen zu bestätigen. Verwende ein mit Ethanol getränktes Wattestäbchen, um den rasierten Bereich zu reinigen, und mache dann mit einer Skalpellklinge einen kleinen Schnitt zwischen der vierten Brustwarze und der Mittellinie. Führen Sie das PBS-getränkte Wattestäbchen in den Einschnitt ein, um eine Tasche zu machen, und legen Sie dann mit einer Pinzette ein Memory-Fettpad frei, das an seiner weißen Farbe zu erkennen ist.

Drücke das Fettpolster mit einer weiteren Pinzette an der Basis zusammen und lege das Gewebe vollständig frei. Pipettieren Sie dann die Adenokarzinomzellen einige Male auf und ab, um eine homogene Zelllösung herzustellen, und aspirieren Sie vorsichtig 150 Mikroliter Zellen in eine Insulinspritze. Achten Sie darauf, eine Spritze waagerecht mit dem Nadelloch nach oben zu halten.

Injizieren Sie die Zellen in das Brustfettpolster und bestätigen Sie die erfolgreiche Injektion durch Schwellung des Gewebes. Lassen Sie dann das Fettpolster vorsichtig los und nähen Sie den Schnitt mit einer Mückenzange, indem Sie die Naht um die Mückenzange im Uhrzeigersinn, gegen den Uhrzeigersinn und im Uhrzeigersinn drehen, um drei Knoten zu machen. Nach der Operation injizieren Sie ein Analgetikum und setzen Sie jedes Tier in eine sternale liegende Position in einen Einzelkäfig, während Sie die Mäuse überwachen, bis sie sich vollständig erholt haben.

Acht Wochen nach der Zellimplantation werden die Mäuse für die Organentnahme vorbereitet. Befestigen Sie das Tier auf einer Schaumstoffunterlage und verwenden Sie Messschieber, um das Tumorvolumen zu messen. Machen Sie als Nächstes einen langen vertikalen Schnitt in der Mittellinie und dann zwei horizontale Schnitte direkt unter dem vorderen Bein und über dem hinteren Bein.

Stecken Sie die Haut an den Schaumstoff, um den Tumor freizulegen, und verwenden Sie dann eine Schere, um den Tumor von der Haut zu trennen. Entfernen Sie dann vorsichtig die Lunge und legen Sie die linke Lunge für drei Tage in die Bowen-Lösung, wonach dieser oberflächliche Metastasen mit bloßem Auge deutlich sichtbar wird, frieren Sie einen Teil des Gewebes in flüssigem Stickstoff für die spätere RNA-Isolierung ein und legen Sie den restlichen Teil des Tumors in eines der konischen Röhrchen, die mit Formin gefüllt sind. Nachdem das Tier durch Herzpunktion getötet worden war, wurde die Blutprobe von 450 Mikrolitern in ein Mikrozentrifugenröhrchen mit 50 Mikrolitern 3,2 % Natriumcitrat gegeben, dann die roten Blutkörperchen heruntergeschleudert und die Plasmaproben bei minus 20 Grad Celsius gelagert, bis experimentelle Fehler wie eine ungenaue Inokulation der Zellen oder Leckagen zu Variationen der Tumorgröße oder sogar zum Fehlen eines Tumors führen können, was zu Die Bildung einer Struktur, die dem Gedächtnis ähnlich erscheint.

Fettpolster mit Kontrollpuffer injiziert. Die Wachstumsrate des Tumors hängt auch von der Art der injizierten Zelllinie ab und kann im Allgemeinen durch die Haut der Maus beobachtet werden. Darüber hinaus können im Bereich um den Tumor herum große Gefäße vorhanden sein, die durch den Gefäßumbau entstehen und die eine entscheidende Rolle bei der Ableitung von Abfallprodukten und der Versorgung des Tumorgewebes mit Nährstoffen und Sauerstoff spielen können.

Anders als bei In-vitro-Experimenten kann es in vivo sein, dass die Wachstumsrate der Tumorzellen aufgrund von Hypoxie und Nährstoffmangel zeitlich nicht konstant ist. Nekrotische Bereiche können sich im umgebenden Gewebe bilden, und diese Bereiche beeinflussen die Wachstumsrate des Tumors. Darüber hinaus können injizierte Zellen, die bestimmte Gene von Interesse exprimieren, das Fortschreiten der Krebserkrankung beeinflussen, da die Gene ein Tumorwachstum induzieren können, das schnell beginnt, sich aber am Ende verlangsamt oder umgekehrt.

Entnahme der Lunge in der Bowen-Lösung hilft bei der Visualisierung der oberflächlichen Metastasierungsherde, die als erhabene blasse Formationen auf der Oberfläche des Lungengewebes erscheinen. Die Bildung von Herden ist abhängig von der Zelllinie. Nicht-aggressive Zellen können nur Mikrometastasen hervorrufen, die durch H- und E-Färbung auf paraffineingebettetem Lungengewebe leicht identifiziert werden können.

Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden wie Eliza durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z.B. wie sich das Wachstum des experimentellen Tumors auf die Spiegel von Zytokinen oder pro-angiogenen Molekülen im Plasma auswirkt.