Die komplizierte Struktur des Vertebraten-Nervensystems ergibt sich aus einer komplexen Reihe von Ereignissen, die Zelldifferenzierung, Zellmigration und Veränderungen der Zellmorphologie involvieren. Das Studium dieser Prozesse ist von wesentlicher Bedeutung für unser Verständnis der Funktion des Nervensystems sowie unsere Fähigkeit zur Diagnose und Behandlung von Erkrankungen, die sich aus einer Fehlentwicklung ergeben. Allerdings ist das Nervengewebe für experimentelle Manipulationen relativ unzugänglich, vor allem in embryonalen Säugetieren. Als Ergebnis nutzen viele Wissenschaftler den Vorteil der Explantationskultur, um neurologische Entwicklungsprozesse in einer “organotypischen” Umgebung zu untersuchen, was bedeutet, dass das Gewebe aus dem Organismus entfernt wird, aber ihre komplexe zelluläre Architektur beibehalten wird. Im Allgemeinen werden Explantationskulturen durch sorgfältige Sektion des Nervengewebes erzeugt, die dann in ein genau abgestimmtes Wachstumsmedium eingetaucht werden und in vitro kultiviert werden.
Dieses Video zeigt zunächst einen kurzen Überblick über die neuronale Explantationskultur einschließlich ihrer Vorteile gegenüber anderen in vitro-Verfahren und wichtigen Überlegungen für die Aufrechterhaltung des gesunden Gewebes. Als Nächstes wird ein allgemeines Protokoll für die Herstellung einer Explantationskultur aus embryonalem Mausgehirn bereitgestellt, das die Isolierung der Embryonen von der Mutter und die Sezierung des Gehirns behandelt. Die Präsentation enthält auch einen Überblick über die Schnittkultur, in der dünne Schnitte von Gewebe des Nervensystems für einen besseren visuellen Zugang zu den Entwicklungszellen erzeugt werden. Schließlich werden einige Anwendungen dieser Techniken zur Verfügung gestellt, um zu zeigen, wie sie verwendet werden können, um wichtige Fragen im Bereich der Nervenentwicklung zu beantworten.
Die Explantationskulturen dienen als eine Technik, um die Entwicklung von spezifischen Zellpopulationen und Nervenstrukturen zu untersuchen. In den entwicklungsneurowissenschaftlichen Experimenten werden Explantate von Nervengewebe aus einem Embryo für die weitere Entwicklung in vitro herausgeschnitten. Diese Kulturen geben Forschern die Fähigkeit, das entwickelnde Gewebe zu manipulieren und die Entwicklung von Gewebe zu visualisieren, in einer Weise, die in vivo nicht möglich ist. Dieses Video zeigt einige wichtige Grundlagen hinter der Arbeit mit explantiertem Gewebe, Schritt-für-Schritt-Verfahren für zwei Ansätze zur Explantation von Kulturen sowie Anwendungen dieser Technik.
Vor dem Eintauchen in die Methoden wollen wir einige Grundprinzipien besprechen. Die Explantate können aus einer Reihe von Modellorganismen und einer Vielzahl von Gewebetypen hergestellt werden. Im Allgemeinen werden die Kulturen durch vorsichtiges Entfernen des Nervengewebes aus einem Embryo erzeugt durch das Sezieren wird ein Bereich von Interesse entfernt und in eine künstliche Umgebung platziert. Die Gewebe können auch in dünne Schichten geschnitten und in “Schnittkulturen” gezüchtet werden. Weil die Kulturumgebung so konzipiert ist, dass sie die in vivo-Bedingungen des gesamten Organs nachahmt, wird diese Kulturstrategie häufig als “organotypisch” bezeichnet.
Bevor wir beginnen, sollten die Instrumente mit 70 % Ethanol sterilisiert werden. Als Nächstes wird eine schwangere Maus mit der bevorzugten Methode des Labors eingeschläfert. Dann wird chirurgisch die Gebärmutter herausgeschnitten und in eiskaltem Puffer platziert. Die Schale wird zu einem Stereomikroskop transferiert und die einzelnen Embryonen werden aus ihrem Dottersack entfernt. Anschließend wird das Gehirn isoliert, sorgfältig wird die Region von Interesse herausgeschnitten und zu einer Kulturschale transferiert, die Kulturmedium enthält. Die Explantate können in einem 37 °C-Inkubator mit 5% CO2 für einige Wochen mit dem Ersetzen von 50% des Mediums alle 2-3 Tage gehalten werden.
Die Schnittkultur von Gehirngewebe erfordert einige zusätzliche Schritte. Vor dem Schneiden wird das Gewebe in Agarose eingebettet, die dem Gewebe Unterstützung bietet, sodass es, während es in Scheiben geschnitten wird, intakt bleibt. Um dies zu tun, wird eine 1,5% niedrigschmelzende Agaroselösung erwärmt, bis die Agarose gelöst ist. Als Nächstes wird die Agarose in Einbettschälchen transferiert und zum Abkühlen gelassen um eine Beschädigung des Gewebes zu verhindern. Das Gewebe kann dann sorgfältig untergetaucht werden und die Agarose wird zum Aushärten gelassen. Die resultierenden Blöcke werden geschnitten und dann zu einem Probentisch geklebt und mit einem Vibratom geschnitten, welches ein Instrument ist, das eine vibrierende Klinge verwendet, um dünne Scheiben von lebendem Gewebe zu schneiden. Wenn die Scheiben erzeugt sind, werden sie vorsichtig zu einer beschichteten Platte transferiert, die Kulturmedien enthält und kultiviert, wie zuvor erwähnt.
Es gibt eine Reihe von Vorteilen für die Verwendung von Explantationskulturen über in vivo und anderen in vitro-Verfahren. Als Erstes, Zellen in explantiertem Gewebe sind besser zugänglich für experimentelle Instrumente. Zweitens, die Tatsache, dass Explantate die komplexe zelluläre Architektur für die Entwicklung von Nervengewebe behalten bedeutet, das Zell-Zell-Interaktionen untersucht werden können. Drittens, da sie die chemische Zusammensetzung des Kulturmediums steuern können, können Wissenschaftler Explantate verwenden, um die Wirkung bestimmter Substanzen bei der Gewebeentwicklung zu testen.
Da es trotzdem aus seiner natürlichen Umgebung entfernt wird, muss besonders darauf geachtet werden, um glückliches und gesundes Gewebe in vitro aufrechtzuerhalten. Zum Beispiel hat die Anwesenheit von extrazellulärer Matrix oder ECM einen erheblichen Einfluss auf das Zellverhalten, deshalb werden gereinigte ECM-Proteine häufig zum Beschichten von Kulturschalen verwendet. Eine weitere wichtige Überlegung ist die Lösung, in der die Explantate gebadet werden. Während herkömmliches Zellkulturmedium oft verwendet wird, erfordern einige Experimente Lösungen, die dem zirkulierendem Medium im Zentralnervensystem sehr ähnlich sind: die Zerebrospinalflüssigkeit ist ein entscheidendes Reagenz in Experimenten wie die, die wir zeigen werden.
Da wir nun über die Methoden der Explantationskultur gesprochen haben, wollen wir sehen, wie diese Techniken eingesetzt werden.
Zellmigrationsassays verwenden explantiertes Gewebe, um die abstoßenden und anziehenden Signale zu untersuchen, die in neuronaler Zellbewegung beteiligt sind. In diesem Experiment werden Perlen, die vorher in Wachstumsfaktoren eingeweicht wurden, in Hinterhirn-Explantate implantiert, um neuronale Zellwanderung zu untersuchen. Nach 3-4 Tagen Exposition wurden die Neuronen mit einem Konfokalmikroskop abgebildet. Die Ergebnisse zeigen, dass die Motoneuronen in Richtung der Perlen, die in dem vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor getränkt wurden, wandern, aber nicht bei Kontrollperlen, die in Puffer getränkt wurden.
Die Co-Kultur-Assays werden oft verwendet, um die Zell-Zell-Interaktionen während der Entwicklung zu untersuchen. In diesem Beispiel wurden Teile des Rückenmarks auf der Oberseite einer Schicht von Muskelzellen kultiviert, um zu untersuchen, wie die Verbindungen zwischen spinalen Motorneuronen und dem Skelettmuskel gemacht werden. Bereits 2 Tage nach der Inkubation werden die Vorsprünge von den Neuronen, die auch als Neuriten bekannt sind, aus dem Explantat gesehen. Innerhalb von 5 Tagen wird die funktionelle Innervierung durch die Kontraktion der Muskelzellschicht beobachtet.
Während der Entwicklung des Nervensystems müssen Nervenzellen ihre Axone verlängern, um eine Verbindung zwischen dem Zielgewebe und des zentralen Nervensystems herzustellen. Eine Möglichkeit, um diesen komplexen Prozess zu untersuchen, ist durch Axonlenkungs-Assays. Die Forscher nutzen explantiertes Gewebe, um die Faktoren innerhalb der Nervenzellen und in der näheren Umgebung zu untersuchen, die helfen, das Axon an den richtigen Ort zu lenken.
Das war der JoVE Leitfaden zur Explantationskultur von Nervengewebe. Dieses Video enthält einen Überblick über die Vorteile von Explantationskulturen, Kultur Strategien, Schritt-für-Schritt-Protokolle von zwei häufig verwendeten Explantationsverfahren und Möglichkeiten, wie diese Techniken in den heutigen Laboren verwendet werden. Danke für das Aufpassen!
Explant cultures serve as a technique to investigate the development of specific cell populations and neural structures. In developmental neuroscience experiments, explants are neural tissues excised from an embryo for continued development in vitro. These cultures give researchers the ability to manipulate and visualize the developing tissues in ways that are not possible in vivo. This video will introduce some important principles behind working with explanted tissues, step-by-step procedures for two approaches to explant culture, as well as applications of this technique.
Before delving into the methods, lets go over some basic principles. Explants can be established from a number of model organisms and a variety of tissue types. Generally, the cultures are created by carefully removing neural tissue from an embryo, dissecting away a region of interest, and placing it into an artificial environment.
Tissues can also be sectioned into thin sheets and grown in “slice culture.” Because the culture environment is designed to mimic the in vivo conditions of the whole organ, this culture strategy is often called “organotypic.”
Before getting started, be sure to sterilize your instruments with 70% ethanol. Next, euthanize a pregnant mouse using your lab’s preferred method. Then, surgically excise the uterus and place in ice-cold buffer. Transfer the dish to a dissection microscope and remove individual embryos from their yolk sac. Next, isolate the brain, carefully dissect out your region of interest, and transfer to a culture dish containing culture medium. Explants can be maintained in a 37 °C incubator containing 5% CO2 for a few weeks by replacing 50% of the medium every 2 – 3 days.
Slice culture of brain tissue requires a few extra steps. Prior to sectioning, the tissue is embedded in agarose, which provides support to the tissue so it remains intact while it’s being sliced. To do this, a 1.5% low melting point agarose solution is heated until the agarose dissolves. Next, the agarose is transferred to embedding molds and allowed to cool slightly to avoid damaging the tissue.
The tissue can then be carefully submerged and the agarose left to harden. The resulting blocks are trimmed and then glued to a specimen stage and sectioned using a vibratome, which is an instrument that uses a vibrating blade to cut thin slices of living tissue. As slices are generated, they are carefully transferred to a coated plate containing culture media and cultured as previously mentioned.
There are a number of advantages to using explant cultures over in vivo and other in vitro methods. First, cells in explanted tissue are more accessible to experimental tools. Second, the fact that explants maintain the complex cellular architecture of developing neural tissue means that cell-cell interactions can be studied. Third, since they can control the chemical composition of the culture medium, scientists can use explants to test the effect of specific compounds on tissue development.
Nevertheless, since it’s being removed from its natural environment, special care must be taken to maintain happy and healthy tissue in vitro. For example, the presence of extracellular matrix, or ECM, has a significant impact on cell behavior, so purified ECM proteins are often used to coat culture dishes. Another important consideration is the solution in which the explants are bathed. While traditional cell culture media is often used, some experiments require solutions that closely resemble the fluid circulating in the central nervous system: the cerebrospinal fluid, which is a critical reagent in experiments like the ones you are about to see.
Now that we have gone over explant culture methods, lets see how these techniques are used.
Cell migration assays use explanted tissue to examine the repulsive and attractive signals that are involved in neural cell movement. In this experiment, beads that have been previously soaked in growth factors are implanted into hindbrain explants to examine neural cell migration. After 3 – 4 days of exposure, neurons were imaged using a confocal microscope. The results show that motor neurons migrate towards beads soaked in vascular endothelial growth factor, but not control beads soaked in buffer.
Co-culture assays are often used to investigate cell-cell interactions during development. In this example, segments of spinal cord were cultured on top of a layer of muscle cells to study how connections are made between spinal motor neurons and skeletal muscle. As early as 2 days after incubation, projections from the neurons, also known as neurites, are seen emerging from the explant. Within 5 days, functional innervation is observed by the contraction of the muscle cell layer.
During development of the nervous system, neurons must elongate their axons to establish a connection between the target tissue and the central nervous system. One way of studying this complex process is through axon guidance assays. Researchers use explanted tissues to examine the factors within the neurons and in the surrounding environment that help guide the axon to its proper location.
You’ve just watched JoVE’s guide to explant culture of neural tissue. This video covered an overview of the advantages of explant cultures, culture strategies, step-by-step protocols of two commonly used explant procedures and ways these techniques are used in the lab today.
Thanks for watching!
