Generierung von Genomic Löschungen in Säugerzelllinien über CRISPR / Cas9

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, das CRISPR Cas Neun-Nuklease-System zu verwenden, um genomische Deletionen zu erzeugen. Zuerst werden die beiden CRISPR-Plasmide und das A-GFP-Reporterplasmid gleichzeitig in die Zellen elektrogereinigt. Isolieren Sie dann mit Hilfe der fluoreszenzaktivierten Zellsortierung die oberen 3 % der GFP-exprimierenden Zellen.

Anschließend werden die sortierten Zellen mit einer limitierenden Verdünnung plattiert und mittels konventioneller PCR nach bioallelischen Deletionsklonen gescreent. Letztendlich kann CRISPR Cas nine verwendet werden, um Gene und genetische Elemente zu untersuchen, indem es Deletionsallele für den Funktionsverlust erzeugt. Im Vergleich zu Frameshift-Mutationen, die von einer einzigen Guide-RNA erzeugt werden, können große Deletionen, die vom CRISPR Cas nine-Nukleasesystem erzeugt werden, dazu beitragen, den Verlust von Funktionsmutationen sicherzustellen. Dieser Ansatz ermöglicht auch ein einfaches und kostengünstiges Screening über eine konventionelle PCR.

Wir hatten die Idee zu dieser Methode, als wir feststellten, dass das Screening auf kleine Indels, die von einer einzigen Guide-RNA erzeugt werden, technisch herausfordernd, mühsam und teuer ist. Deletionsallele sind auch besonders informativ für die Untersuchung von genetischen Elementen, die nicht beschichtet sind. Für jedes CRISPR-Paar-Pellet zweimal 10 auf die sechs in Suspension gezüchteten Zellen. Die Zellen werden in 100 Mikrolitern Elektroporationslösung resuspendiert und dann in eine Elektroporations-QAT überführt.

Fügen Sie fünf Mikrogramm CRISPR Cas neun Konstrukt SG RNAA hinzu, fünf Mikrogramm CRISPR Cas neun. Konstruieren Sie SG, a, B und 0,5 Mikrogramm des GFP-Expressionskonstrukts, pipettieren Sie mehrmals vorsichtig auf und ab, um es zu mischen. Versuchen Sie, die Bildung von Blasen mit einem Elektroporationssystem zu vermeiden.

Reinigen Sie die Zellen mit 250 Volt für fünf Millisekunden in einem zwei Millimeter großen Tiegel mit einer sterilen Transferpipette und überführen Sie die Lösung sofort auf einen Milliliter vorwärmtes Kulturmedium. Inkubieren Sie die Zellen bei 30 Grad Celsius für 24 bis 72 Stunden. Führen Sie die Zellen durch einen sterilen 50-Mikron-Filter in ein Faxrohr.

Dann werden die oberen 3% der GFP-positiven Zellen per Fax sortiert, um sie für Zellen anzureichern, die hohe Plasmidspiegel erhalten haben. Nach der Optimierung der limitierenden Verdünnungsbedingungen für die interessierenden Zellen wurden die Zellen in eine 96-Well-Platte sortiert und eine Verdünnung von 30 Zellen pro Platte mit 100 Mikrolitern Zellkulturmedium pro Well durchgeführt. Für die restlichen sortierten Bulk-Zellen frieren Sie die Hälfte der Zellen für die zukünftige Beschichtung ein.

Plattieren Sie die andere Hälfte für das Screening und die Primervalidierung. Inkubieren Sie diese Bulk-Zellen drei bis sieben Tage lang bei 37 Grad Celsius. Lassen Sie die Klone je nach Verdopplungszeit der Zelllinie sieben bis 14 Tage lang bei 37 Grad Celsius inkubieren.

Wird verwendet, um genomische DNA-Resus zu isolieren, die Eltern- und die Bulk-Zellpellets in 50 Mikrolitern DNA-Extraktionslösung zu suspendieren. Führen Sie die Probe in einen Thermocycler, um genomische DNA zu extrahieren. Messen Sie dann die DNA-Konzentration.

Stellen Sie nun eine 20-Mikroliter-PCR-Reaktion zusammen, indem Sie 10 Mikroliter mit zwei XPCR-Mixen kombinieren: 0,5 Mikroliter 10 mikromolare Forward-Primer, 0,5 Mikroliter 10-mikromolare Reverse-Primer, 50 bis 100 Nanogramm genomische DNA und Wasser bis zu 20 Mikroliter. Führen Sie die PCR für die Nicht-Deletionsbande und die Deletionsbande in getrennten Reaktionen durch.

Geben Sie dann die Proben in einen Thermocycler und führen Sie sie in 35 Zyklen mit einer Knietemperatur von 60 Grad Celsius durch, wie im beigefügten schriftlichen Protokoll beschrieben. Lösen Sie die Proben auf einem 2%-Aros-Gel bei 10 Volt pro Zentimeter unter Verwendung eines XTAE-Puffers auf. Untersuchen Sie dann die Proben auf das Vorhandensein oder Fehlen von Nicht-Deletions- und Deletionsbanden.

Überlegen Sie sich eine Strategie, um die Deletions- und Nicht-Deletions-PCR-Primerpaare in einer einzigen Reaktion zu multiplexen. Alternativ können Sie Deletions- und Nicht-Deletions-PCR-Reaktionen separat durchführen. Bei Suspensionszellen werden alle Klone auf eine einzelne 96-Well-Platte übertragen, die bereits 50 Mikroliter Zellkulturmedium pro Well enthält.

Übertragen Sie dann 50 Mikroliter aus jeder Vertiefung auf eine 96-Well-PCR-Platte. Alternativ können Adhärenzzellen, Trypsin, Augen und Klone vor dem Transfer auf eine einzelne 96-Well-Platte verwendet werden. Übertragen Sie dann 50 Mikroliter aus jeder Vertiefung auf eine 96-Well-PCR-Platte, zentrifugieren Sie die PCR-Platte fünf Minuten lang bei 400-fachem G und entfernen Sie den Überstand, indem Sie die PCR-Platte über eine Senke schnippen.

Fügen Sie nun 50 Mikroliter DNA-Extraktionslösung pro Vertiefung hinzu und resuspendieren Sie die Zellpellets nach der genomischen DNA-Extraktion, führen Sie PCR-Reaktionen durch, um Nicht-Deletion und Deletionsbanden von den Klonen nachzuweisen. Lösen Sie PCR-Produkte auf einem 2%aros-Gel bei 10 Volt pro Zentimeter auf. Verwendung eines XTAE-Puffers.

Identifizieren Sie die Klone mit der gewünschten Deletion und amplifizieren Sie die Kulturen in einer größeren Platte oder einem Kolben. In dem gezeigten Beispiel sind von links nach rechts elterliche Zellen drei Nicht-Deletionsklone, drei mono-allelische Deletionsklone und drei bi-allelische Deletionsklone zu beobachten. Die Verwendung mehrerer nicht überlappender SG r NNA-Paare kann helfen, Off-Target-Effekte zu kontrollieren.

Jedes Paar würde zur Produktion einer eindeutigen Deletion führen. Breakpoints, die auf SG-Paare an verschiedenen Stellen in Bezug auf das Gen abzielen, können verwendet werden, um den gesamten Genkörper zu löschen, um Frameshift-Indels zu erzeugen, selbst wenn eines oder beide Allele nicht gelöscht wurden, oder um eine Störung einer bestimmten Isoform zu ermöglichen. In diesem Experiment.

In Bezug auf die Deletion des gesamten Gens wurden PIM eins zwei SG RNA-Paare entworfen, in den PX 3 3 0 Expressionsvektor kloniert und durch Elektroporation an MEL-Zellen abgegeben. Zusammen mit dem GFP-Reporter wurden die oberen 3% der GFP-positiven Zellen klonal zur Begrenzung der Deletion plattiert und mittels PCR auf monoallelische und bioallelische Deletionsklone ohne Deletion auf diese PIM-Ein-Deletion untersucht. Bioallelische Deletionsklone wurden für die weitere Proliferation ausgewählt, nachdem fünf Tage Zeit für die Expansion eingeräumt worden waren.

Jeder Klon wurde erneut durch PCR von genomischer DNA getestet, um die BIC-Deletion und -Deletion zu bestätigen. Die Amplikons wurden einer Sanger-Sequenzierung unterzogen, um die genaue Deletion zu identifizieren. RNA wurde aus BIC-Deletionsklonen isoliert und mit R-T-Q-P-C-R analysiert, um den Verlust der PIM-One-Expression zu bestätigen.

Einmal gemeistert, kann diese Technik in wenigen Wochen abgeschlossen werden, um vitale Deletionsklone zu identifizieren. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie das CRISPR CAS-Neun-Nuklease-System verwenden, um genomische Deletionen zu erzeugen, indem Sie CRISPR-Plasmide porieren, GFP-helle Zellen sortieren und einzelne Klone durch konventionelle PCR auf BioE-Deletionsklone untersuchen.