Entwirren der unsichtbaren Spieler im Ozean - ein Feld Führer zu Wasserchemie und Marine Mikrobiologie

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Umweltproben an abgelegenen Feldstandorten zu sammeln und zu verarbeiten, um wichtige biochemische Hintergrundparameter und aquatische Ökosysteme zu bewerten. Dies wird erreicht, indem zunächst ausreichende Mengen an kompromittiertem Probenahmewasser an den jeweiligen Standorten gesammelt werden. Der zweite Schritt besteht darin, Filtrations- oder Konzentrationssysteme einzurichten, die einen effizienten Arbeitsablauf ermöglichen und gleichzeitig zusätzliche Handhabungsschritte des Probenahmebehälters vermeiden, da eine zusätzliche Handhabung immer ein Kontaminationspotenzial birgt.

Anschließend wird jede Probe je nach den angestrebten Parametern gefiltert oder konzentriert. Der letzte Schritt besteht darin, jede Probe entsprechend den Anforderungen des jeweiligen Analyten zu verarbeiten oder zu fixieren. Letztendlich wird die Mikroskopie verwendet, um die virale und mikrobielle Abundanz sowie die mikrobielle Biomasse direkt zu zählen und die Qualität der viralen und mikrobiellen metagenomischen Proben zu überprüfen.

Diese Methode bietet die Werkzeuge zur Bewertung von Schlüsselparametern, die erforderlich sind, um das Minimum und die Informationen zu erhalten, die für die Charakterisierung und das Verständnis der Dynamik viraler und mikrobieller Gemeinschaften unerlässlich sind. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden besteht darin, dass sie einen umfassenden, praxiserprobten Arbeitsablauf bietet, der unabhängig von der Laborumgebung ist. Emma Church, eine Studentin im Ruderlabor, wird das Verfahren vorführen.

Die Entnahme von Proben wird in diesem Video nicht gezeigt, sondern im begleitenden Protokolltextprozess beschrieben. Die Proben in der hier gezeigten Reihenfolge, beginnend mit gelöstem organischem Kohlenstoff oder DOC, um die Wahrscheinlichkeit einer Kontamination zu minimieren, montieren eine der beiden zuvor gesammelten Hatay-Kin-Einheiten und den jeweiligen Schlitz des Filtrationssets. Schließen Sie den Auslaufschlauch an, der zum jeweiligen Filterhalter führt.

Verbinden Sie den Druckluftschlauch mit der Kin-Einheit. Spülen Sie alle Leitungen mit 100 Millilitern Messwasser. Verwenden Sie dann eine säuregewaschene Pinzette, um einen 25 Millimeter großen, vorgesprengten GFF-Filter in jeden Filterhalter zu setzen.

Spülen Sie jede DOC-Flasche und jeden Verschluss aus Polyethylen hoher Dichte dreimal mit etwa 20 Millilitern gefiltertem Probenahmewasser aus. Füllen Sie jede DOC-Flasche mit etwa 40 Millilitern Probenahmewasser. Sammeln Sie mindestens Duplikate von DOC-Proben, um im Falle einer möglichen Kontamination oder eines Verlusts während des Transports eine Sicherungskopie zu haben.

Gefrieren Sie Probenahmeflaschen, die aufrecht bei minus 20 Grad Celsius stehen, bis zur Analyse nach der Entnahme der DOC-Proben. Fahren Sie mit dem Filtern fort, bis insgesamt 500 Milliliter einen GFF-Filter passiert haben, einschließlich dessen, was passiert ist. Schrauben Sie während der Entnahme der DOC-Proben den Inline-Filterhalter ab.

Verwenden Sie eine Pinzette, um den Filter für die Analyse von organischen Partikeln oder POM zu entfernen, und platzieren Sie den Filter in einem Quadrat aus vorgeplatzter Aluminiumfolie. Falten Sie die Oberseite auf sich gedreht und wickeln Sie sie ein. Frieren Sie die Filter zur Lagerung bei minus 20 Grad Celsius ein, bis sie einer Elementar- und Isotopenanalyse unterzogen werden, um anorganische Nährstoffe zu verarbeiten.

Setzen Sie in jeden Filterhalter einen 0,2-Mikrometer-Filter ein. Bringen Sie die Filterkassetten wieder an und befüllen Sie jede 20-Milliliter-Kunststoff-Szintillationsflasche dreimal mit Probenahmewasser. Füllen Sie jede Flasche bis zur Schulter.

Bei minus 20 Grad Celsius bis später einfrieren. Analyse. Um Proben für die Mikroskopie vorzubereiten, nehmen Sie den Filterhalter ab und sammeln Sie jeweils einen Milliliter Wasser in zwei Mikrozentrifugenröhrchen. Geben Sie 66 Mikroliter 32%Paraldehyd zu einem der Aliquots, die später verwendet werden sollen.

Für die Cybergoldfärbung fügen Sie 12 Mikroliter 25%ige Glutaraldehyd zum anderen Aliquot hinzu, um sie später zu färben. Mischen Sie vorsichtig und lassen Sie die Proben mindestens 15 Minuten lang fixieren. Bei Raumtemperatur im Dunkeln sollten die Proben für die Mikroskopie innerhalb einer Stunde bearbeitet werden.

Um Proben für die Durchflusszytometrie vorzubereiten, setzen Sie einen Acht-Mikrometer-Polycarbonatfilter in einen der Filterhalter ein, um Schmutz und große Eichenzellen auszuschließen. Geben Sie Probenahmewasser durch, um zwei Kryofläschchen für jede Probenahmestelle zu füllen. Geben Sie mit einem Milliliter Probe fünf Mikroliter 25 % Glutaraldehyd in jedes Kryo-Fläschchen.

Drehen Sie die Fläschchen um, um sie zu mischen, und lassen Sie die Proben 15 bis 30 Minuten lang bei Raumtemperatur fixieren. Anschließend die Proben in flüssigem Stickstoff einfrieren und bis zur Analyse auf einem Durchflusszytometer bei minus 80 Grad Celsius lagern. Um mit der Vorbereitung der mikrobiellen metagenomischen Proben zu beginnen, entfernen Sie die Inline-Filterhalter direkt.

Montieren Sie einen Punkt 22 Mikrometer zylindrisch. Filtern Sie auf die jeweilige Zeile. Filtrieren Sie das restliche Probenwasser beider Huthauteinheiten von jedem Standort durch einen Filter.

Drücken Sie nach der Filtration das restliche Wasser mit einer sauberen, mit Luft gefüllten 10-Milliliter-Spritze aus jedem Filter. Legen Sie den Filter wieder in die Originalverpackung und verschließen Sie die Verpackung mit Laborklebeband. Lagern Sie die einzeln verpackten Filter bei minus 20 Grad Celsius.

Bereiten Sie als Nächstes die viralen metagenomischen Proben vor. Füllen Sie die Proben sofort in die gewaschenen Eimer um, um sicherzustellen, dass keine Probe verloren geht oder durch die Umwelt kontaminiert wird. Vorfilter mit einem Nylonnetz mit großen Poren, um Ablagerungen und Zellmaterial vor der Konzentration zu entfernen.

Richten Sie die Tangentialstromfilter oder TFF ein, wie in diesem Diagramm gezeigt. Legen Sie eine Förderleitung in einen Probeneimer und lassen Sie die Rücklauf- und Filtratleitungen in eine Senke laufen. Schalten Sie die Schlauchpumpe ein und spülen Sie die Leitungen mit ein bis zwei Litern Probenwasser.

Legen Sie die Rücklaufleitung in den Probeneimer, um den Zyklus abzuschließen, und fügen Sie 0,7 bar Gegendruck hinzu, während Sie das Meerwasser konzentrieren. Füllen Sie den Probenbehälter auf, wenn der Füllstand sinkt. Wenn der Wasserstand unter die Leitungsaufnahme im Eimer fällt, füllen Sie das Konzentrat in ein mit Bleichmittel gewaschenes Becherglas mit dreifacher Spülung und konzentrieren Sie sich weiter.

Wenn das Reservoir leer ist, entfernen Sie den Gegendruck, erhöhen Sie die Pumprate und schieben Sie die gesamte Probe durch die Leitungen, um sie im Tripo-Becherglas aufzufangen. Führen Sie das Konzentrat durch zylindrische Filter mit einem Punkt von 45 Mikrometern, um die meisten Bakterien zu entfernen, ohne Viruslinien zu diskriminieren. Sammeln Sie den Punkt 45 Mikrometer gefiltertes Virus.

Konzentrat in 50-Milliliter-Tuben. Ändern Sie den Punkt 45 Mikrometer zylindrische Filter. Nach jeweils 150 Millilitern nach dem Sammeln des filtrierten Viruskonzentrats werden 250 Mikroliter Chloroform zu jedem 50-Milliliter-Aliquot hinzugefügt, um verbleibende Bakterien zu eliminieren, die sich invertieren, um sich zu vermischen.

Lagern Sie die Röhrchen bis zur Weiterverarbeitung aufrecht bei vier Grad Celsius. Trocknen Sie zuletzt die 0,45-Mikrometer-Filter und lagern Sie sie wie bei den mikrobiellen metagenomischen Proben gezeigt. Die Extraktion der genomischen DNA aus den mikrobiellen und viralen Proben wird in diesem Video nicht gezeigt, aber das Verfahren ist im begleitenden Protokoll zu finden.

Hier finden Sie textrepräsentative Analysen von Mikroskopieproben. Dappy gefärbte und Cyber Gold Stain-Objektträger werden untersucht, um die Häufigkeit und Größenverteilung von Bakterien und Viren zu messen. Die gesammelten Proben werden weiter auf das Verhältnis autotropher heterotropher Mikroben mittels Durchflusszytometrie untersucht, um die Anzahl der gesamten Bakterienzellen zu bestimmen, die Proben werden mit cyberg grün gefärbt, Ein Kanal für Chlorophyll und FICO Eryn wird verwendet, um die Häufigkeit von autotrophen in ungefärbten Proben zu zählen.

Die autotrophen Zählungen aus dem Nicht-ST-Fleckenanteil werden dann von der cybergefärbten Gesamtzählung subtrahiert, um die Häufigkeit heterotropher Mikroben nach der Isolierung und Reinigung von virusähnlichen Partikeln zu bestimmen, oder die VLP-Epi-Fluoreszenzmikroskopie wird verwendet, um das Vorhandensein und die Reinheit der Viruspartikel zu überprüfen. Diese Diagramme zeigen repräsentative mikrobielle Metagenomdaten. Die relative Häufigkeit der Synchronisation.

Occus SPP ist positiv mit der prozentualen Bedeckung von Korallen korreliert. Im Gegensatz zu Ella Backer, SPP, waren die Stoffwechselwege für den konjugierten Transfer positiv mit den Nitratkonzentrationen korreliert. Während der Stoffwechselweg für die DNA-Reparatur zwischen allen Metagenomen konsistent war, zeigt diese Tabelle die Datenmerkmale von zwei viralen Genomen, die von zwei Inseln erzeugt wurden.

Diese zweite Tabelle zeigt wasserchemische Daten von verschiedenen Standorten während einer Expedition. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Verfügbarkeit organischer und anorganischer Nährstoffe sowie die Häufigkeit und Struktur viraler und mikrobieller Gemeinschaften in abgelegenen Feldgebieten umfassend bewerten können.