Der Nachweis von Human-Leukozyten-Antigen Biomarkern bei Brustkrebs Verwendung Markierungsfreie Biosensorik

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die Messung des humanen Leukozytenantigens oder HLA-assoziierten Tumorantigens in Patientenflüssigkeiten für die Stratifizierung von Patienten in eine relevante Immuntherapie. Dies wird erreicht, indem zunächst T-Zell-Rezeptor-ähnliche Antikörper, bekannt als TCRM, auf der MICROPLATE-Oberfläche immobilisiert werden. Der zweite Schritt besteht darin, die Patientenprobe zusammen mit der seriellen Verdünnung von Zielpeptid-HLA-Monomeren hinzuzufügen, um eine Standardkurve zu erzeugen, die die Quantifizierung des Zielantigens in Patientenproben ermöglicht.

Anschließend wird die Bindung des Zielantigens an den Antikörper auf dem Free-Label-Bioassay-System überwacht, bis das Gleichgewicht erreicht ist. Der letzte Schritt besteht darin, die resultierenden Daten zu analysieren, indem die Standardkurve verwendet wird, um die Menge des Zielantigens in Patientenproben zu quantifizieren. Letztendlich wird die markierungsfreie Biosensortechnologie zum Nachweis von Krebs-Biomarkern in Patientenproben eingesetzt.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Techniken wie lc MSS ist der schnelle Hochdurchsatznachweis von HLA-assoziierten Antigenen. Dies ermöglicht eine schnelle Stratifizierung von Krebspatienten in die Behandlungsmodalitäten, da es als Plattform zum Nachweis von Biomarkern dient. Während diese Methode mit dem Screening von Krebs-Biomarkern verwandt ist, ist das System tatsächlich für viele Anwendungen anwendbar, darunter zellbasierte Assays, Immunphänotypisierung, Hybrid-Screening oder das Screening von kleinen Molekülbibliotheken.

Die Idee zu dieser Methode hatten wir erst, als wir einen therapeutischen Antikörper zur Nachahmung von T-Zell-Rezeptoren entwickelten. Wir haben uns gefragt, wie wir Patienten identifizieren können, die am meisten von dieser Art der Therapie profitieren würden. Kristen Dahl, eine Doktorandin der Biotechnologie, die in meinem Labor arbeitet, wird dieses Verfahren vorführen.

Beginnen Sie mit der Vorinkubation der phosphatgepufferten Kochsalzlösung oder PBS bei 28 Grad Celsius, um temperaturbedingte Resonanzverschiebungen zu minimieren. Geben Sie 50 Mikroliter phosphatgepufferte Kochsalzlösung oder PBS pH 7,2 in die Vertiefungen der mit Avadon-Derivaten beschichteten Platten. Öffnen Sie als Nächstes die Bioassay-Scanner-Software.

Folgen Sie dem Setup-Assistenten, um das experimentelle Verfahren zu definieren, das die Auswahl von Rohlingen, Standards und Proben im Plattenlayout, die Temperatureinstellung, die Anzahl der Scans pro Minute und die Länge des Experiments umfasst. Setzen Sie dann die vorbereitete Assay-Platte in den markierungsfreien Bioassay-Scanner ein und starten Sie den ersten Scan. Die Baseline ist der anfängliche Satz von Scans, die zu Beginn des Experiments gesammelt wurden.

Wenn dies der erste Test ist, der auf dieser speziellen Platte durchgeführt wird, lassen Sie den Scanner lange genug laufen, um die Temperatur auszugleichen und eine Drift in der Basislinie zu vermeiden. Nachdem sich die Basislinie stabilisiert hat oder nach mindestens fünf Scans, unterbrechen Sie den Lesevorgang und werfen Sie die Platte aus. Entleeren Sie das PBS und fügen Sie 50 Mikroliter RL 21, einen biotinylierten Antikörper, zu allen außer Kontrollwells auf der Platte hinzu.

Geben Sie dann 50 Mikroliter PBS in die Kontrollvertiefungen. Setzen Sie anschließend die Platte wieder in den Bioassay-Scanner ein und setzen Sie die Messung fort, bis die Sättigung erreicht ist. Nach ca. 1,5 Stunden unterbrechen Sie den Lesevorgang und werfen Sie die Platte aus.

Waschen Sie die Platte dann dreimal mit 200 Mikrolitern PBS pro Mulde plus 0,05%Tween 20 oder PBST. Nach dem Waschen dreimal mit 200 Mikrolitern PBS pH 7,2 pro Well ohne Reinigungsmittel spülen. Klopfen Sie überschüssiges PBS von der Platte auf Papiertücher, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren.

Geben Sie als Nächstes 50 Mikroliter PBS in alle aktiven Vertiefungen. Setzen Sie dann die Platte wieder in den Bioassay-Scanner ein und setzen Sie die Messung fort, um die Resonanz nach dem Waschen zu überwachen. Stoppen Sie nach dem Lesen das Lesen und werfen Sie die Platte aus.

Um den Analyten hinzuzufügen. Entfernen Sie das PBS und fügen Sie 50 Mikroliter eines geeigneten Assay-Puffers pro Vertiefung für diesen Assay hinzu. Im Handel erhältliches normales Humanserum wurde in PBS um eins bis 20 verdünnt.

Öffnen Sie als Nächstes die Bioassay-Scanner-Software und folgen Sie dem Einrichtungsassistenten. Um das experimentelle Verfahren zu definieren, setzen Sie die Platte in den Bioassay-Scanner ein und beginnen Sie mit der Baseline-Messung. Nachdem sich die Baseline stabilisiert hat oder nach mindestens fünf Scans, unterbrechen Sie die Messung und werfen Sie die Platte aus. Entfernen Sie dann den Assay-Puffer aus den Wells.

Anschließend werden die Kontrollen mit HLAA oh 2 0 1 Monomer versetzt, das relevante oder irrelevante Peptide in Konzentrationen von 0,625 bis 10 Mikrogramm pro Milliliter im Assay-Puffer enthält. Geben Sie dann 50 Mikroliter der Standards in die Kontrollvertiefungen der Platte. Geben Sie anschließend 50 Mikroliter des Analyten in Assay-Puffer in die Probenvertiefungen der Platte.

Für diesen Assay wurde im Handel erhältliches Humanserum mit Dots verwendet. Setzen Sie die Platte wieder in den Bioassay-Scanner ein und setzen Sie die Messung fort, bis die Sättigung etwa 30 bis 60 Minuten nach der Sättigung erreicht ist, unterbrechen Sie die Messung und werfen Sie die Platte aus. Waschen Sie die Platte dreimal mit 200 Mikrolitern PBST pro Well, gefolgt von drei Spülgängen mit 200 Mikrolitern PBS pro Well wie zuvor, und geben Sie dann 50 Mikroliter Assay-Puffer in alle aktiven Wells.

Setzen Sie nun die Platte wieder in den Bioassay-Scanner ein und setzen Sie die Messung fort, um die Resonanz nach dem Waschen zu überwachen, bevor Sie die Messung stoppen und die Platte auswerfen. Analysieren Sie schließlich die Daten mit der Bioassay-Scanner-Software oder exportieren Sie Rohdatendateien in die bevorzugte statistische Analysesoftware. Die Bioassay-Scanner-Software generiert automatisch die Bindungskurve basierend auf dem Plattenlayout, das während des Versuchsaufbaus bereitgestellt wurde.

Biotinyliertes RL 21 A-T-C-R-M oder IgG zwei A wurde auf der AVID AVIDAN Assayplatte immobilisiert; repräsentative Ergebnisse zeigen den Nachweis des Zieltumorantigens F-L-S-L-H-L-A in einer Patientenplasmaprobe im Gleichgewicht und nach dem Waschen. IgG zwei A wird als Kontrolle für unspezifisch bindende Gewebeschnitte verwendet, die mit einer Positivkontrolle und Negativkontrollen gefärbt wurden. Und für RL 21 bestätigt eine Färbung des Tumorgewebes mit RL 21 A die Darstellung von F-L-S-L-H-L-A-Komplexen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie HLA-assoziierte Biomarker in Patientenflüssigkeiten mit Hilfe von T-Zell-Rezeptor-ähnlichen Antikörpern gemessen und die Bindung des Zielantigens an den Antikörper auf dem markierungsfreien Bioassay-System überwacht werden kann. Wenn Sie dieses Verfahren ausprobieren, ist es wichtig, daran zu denken, alle Probenpuffer vor der Verwendung zu inkubieren, um Temperaturspitzen zu vermeiden und für jeden Schritt den richtigen Probenpuffer zu verwenden.