Name: Der Nachweis von Human-Leukozyten-Antigen Biomarkern bei Brustkrebs Verwendung Markierungsfreie Biosensorik (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: Erfahren Sie die markierungsfreie Biosensorik zur Detektion von HLA-Peptid-Komplexen als Biomarker bei Brustkrebs. Diese Methode ermöglicht die schnelle Patientenstratifizierung für Immuntherapien.

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Diese Studien wurden teilweise von der Development Corporation of Abilene unterstützt, die Laborraum und Gehaltsunterstützung für Experimmune, ein Zentrum für immuntherapeutische Entwicklung am Texas Tech University Health Sciences Center und Resonant Sensors Incorporated bereitstellt.

Ethics Statement: De identifizierten menschlichen Gewebe- und Plasmaproben wurden von Hendrick Medical Center unter einem Institutional Review Board erhalten genehmigten Protokoll. 1. Die Zugabe von biotinylierten Antikörpers HINWEIS: Die Überwachung dieser Schritt ist optional. Siehe alternative Protokoll, wenn keine Überwachung. <ol><li> Besorgen Sie handelsübliche Avidin-Derivat beschichteten Platten (siehe Materialien und Geräte Tabelle). </li><li> Dann werden 50 &amp; mgr; l phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) pH 7,2 in die Vertiefungen. HINWEIS: vorinkubieren PBS bei 28 ° C temperaturabhängige Resonanzverschiebungen zu minimieren. </li><li> Öffnen Bioassay-Scanner-Software und folgen Sie den Setup-Assistenten, um das experimentelle Verfahren, die Auswahl von Leer-, Standard- und Proben im Plattenlayout Temperatureinstellung (28 ° C), die Anzahl der Scans pro min umfasst definieren (1), und die Dauer des Experiments ( 150 min, für präparative Schritte unterzubringen). </li&gt; <li> Legen Sie die Testplatte vorbereitet in das Etikett frei Bioassay-Scanner und starten Sie den ersten Scan. Wenn der erste Scan abgeschlossen ist, wählen Sie &quot;Selbst Bezug auf starten&quot;. Die Grundlinie ist die erste Reihe von Abtastungen zu Beginn des Experiments gesammelt. Wenn dies das erste Lese zu diesem speziellen Platte durchgeführt, damit der Scanner ausführen zu temperieren und zu beseitigen Drift der Basislinie. Abbildung 2 zeigt einen Screenshot einer Baseline, gefolgt von Probenzugabe. </li><li> Nachdem die Grundlinie stabilisiert hat oder zumindest 5-Scans, halten Sie den Lese- und Auswerfen der Platte. </li><li> Entfernen PBS durch das Einbringen in die Spüle und fügen Sie 50 ul RL21A biotinyliertem Antikörper an [10 ug / ml in PBS pH 7,2], um alle außer Kontrolle Vertiefungen auf der Platte. Dann werden 50 &amp; mgr; l PBS zu den Kontrollvertiefungen. </li><li> Legen Sie die Platte wieder in den Bioassay-Scanner und wieder lesen, bis eine Sättigung erreicht ist, etwa 1,5 Stunden. </li><li> Unterbrechen Sie die Lese- und Auswerfen der Platte. </li><li> Waschen Sie die<html> Platte 3-mal mit 200 ul / Vertiefung phosphatgepufferter Kochsalzlösung + 0,05% Tween 20 (PBST) gewaschen, gefolgt von 3 Spülungen mit 200 ul / Vertiefung PBS, pH 7,2. Wiederholen Sie mit PBS. Tippen Sie überschüssiges PBS von Platte auf Küchenpapier vor dem Umzug mit dem nächsten Schritt. HINWEIS: Dieser Schritt kann auf einem automatischen Plattenwäscher durchgeführt oder waschen Sie die Platte 3-mal mit 200 ul PBST durch das Einbringen von Flüssigkeit in einem Waschbecken und ersetzen PBST mit einer Pipette werden. </li><li> In 50 ul PBS pH-Wert 7,2 an alle aktiven Brunnen. </li><li> Legen Sie die Platte wieder in den Bioassay-Scanner und wieder lesen, um nach dem Waschen Resonanz zu überwachen. </li><li> Stoppen Sie den Lese- und Auswerfen der Platte. </li></ol> Alternatives Protokoll für Schritt 1: <ol start="13"><li> In 50 ul RL21A biotinyliertem Antikörper an [10 ug / ml PBS] in alle Vertiefungen. </li><li> Inkubiere bei Raumtemperatur für 1,5 h oder über Nacht bei 4 ° C. </li><li> 3-mal waschen Sie die Platte mit 200 ul / von 3 Spülungen mit 200 ul / Vertiefung PBS gut PBST, gefolgt wie in Schritt 1.9. </li></ol>jove_title &quot;&gt; 2. Die Zugabe von Analyt <ol><li> Entfernen Sie die PBS und 50 ul pro Vertiefung geeigneter Assay-Puffer. Für diesen Test wurde kommerziell erhältlichen normalen menschlichen Serum 1:20 verdünnt in PBS. </li><li> Öffnen Bioassay-Scanner-Software und folgen Sie den Setup-Assistenten, um experimentelle Verfahren zu definieren. </li><li> Legen Sie die Platte in den Bioassay-Scanner und beginnen eine Baseline zu lesen. Wenn dies das erste Lese zu diesem speziellen Platte durchgeführt, lassen Sie den Scanner laufen zu temperieren und zu beseitigen Drift der Basislinie. </li><li> Nachdem die Grundlinie stabilisiert hat oder zumindest 5-Scans, halten Sie den Lese- und Auswerfen der Platte. </li><li> Entfernen Sie die Testpuffer aus den Vertiefungen. </li><li> Spike Steuerungen mit HLA A * 02: 01 tragendes Monomer relevant (FLSL) oder irrelevante (SLLV, YLEV oder KVL) Peptide bei Konzentrationen von [0,625 bis 10 &amp; mgr; g / ml] in Assay-Puffer. Dann werden 50 ul des Standards in den Kontrollvertiefungen der Platte </li><li> Dann werden 50 ul des Analyten in Testpuffer auf die ProbeVertiefungen der Platte. Für diesen Assay versetzt kommerziell verfügbaren Humanserum verwendet wurde. </li><li> Legen Sie die Platte wieder in den Bioassay-Scanner und wieder lesen, bis eine Sättigung erreicht ist, etwa 30 bis 60 min. </li><li> Unterbrechen Sie die Lese- und Auswerfen der Platte. </li><li> 3-mal waschen Sie die Platte mit 200 ul / von 3 Spülungen mit 200 ul / Vertiefung PBS gut PBST, gefolgt wie in Schritt 1.9. </li><li> In 50 ul Testpuffer auf allen aktiven Brunnen. </li><li> Legen Sie die Platte wieder in den Bioassay-Scanner und wieder lesen, um nach dem Waschen Resonanz zu überwachen. </li><li> Stoppen Sie den Lese- und Auswerfen der Platte. HINWEIS: Der Assaypuffer konnte PBS, Zellkulturmedium oder Humanserum je nach Ziel des Assays in PBS 1:20 verdünnt werden. </li></ol> 3. Datenanalyse <ol><li> Analysieren Sie mit Hilfe der Bioassay-Scanner-Software oder Exportrohdatendateien auf bevorzugte statistische Analyse-Software. Der Bioassay-Scanner-Software generiert automatisch die Bindungskurve, die auf diePlattenlayout im Versuchsaufbau zur Verfügung gestellt. HINWEIS: Falls nicht mit dem Bioassay-Scanner-Software für die Analyse, die Schritte 3,2-3,4. </li><li> Subtrahieren Sie die Grundlinie und Negativkontrolle von jeder weiteren Datenpunkt. </li><li> Berechnen Sie den Mittelwert und Standardabweichung für replizieren Brunnen zu jedem Zeitpunkt. </li><li> Generieren Sie ein Diagramm der Bindungskurve oder wählen Endpunktdaten für Balkendiagramme. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren, Debra Wawro Weidanz und Robert Magnusson, jeweils Chief Executive Officer und Chief Technology Officer bei Resonanzsensoren Incorporated, die die Bioassay-Platten-Lesegerät und Testplatten in diesem Artikel verwendet produziert.

Das hier beschriebene Verfahren stellt einen Biomarker Screeningsystem für die Krebsdiagnostik, die schnelle Erkennung von löslichen Peptid / HLA-Komplexe in Patientenserum, Plasma, Urin oder Speichel-Proben in einem Hochdurch ermöglichen würde 96- oder 384-Well-Format. Dieses Testsystem unter Verwendung von T-Zell-Rezeptors nachahmt monoklonalen Antikörper und eine markierungsfreie Detektionssystems schneidet die Analysezeit auf weniger als 1 h im Vergleich zu 3,5 Stunden nach herkömmlichen ELISA. Dieses Hochdurchsatz-Ansatz ermöglicht die schnelle Stratifizierung von Patienten mit klinischen Studien für therapeutische Krebsimpfstoffe oder Biopharmazeutika. Derzeitige Verfahren zum Nachweis dieser Krankheitsziele erforderlich Affinitätsreinigung und HPLC-MS / MS individueller Patientenproben, eine mühsame und zeitraubender Prozess. Obwohl dieses Verfahren zugänglich zu herkömmlichen ELISA-Verfahren, gibt es Bedenken, dass sekundäre Nachweisreagenzien wie die anti-β2-Mikroglobulin-Antikörper konnte die Struktur des naszierenden HL verändernEin Molekül, und die Bindung an die TCRM Begrenzungserkennung. Markierungsfreie Detektion lindert diese Bedenken. Dieses Verfahren könnte für die Verwendung auf anderen markierungsfreie Systeme wie ein Oberflächenplasmonresonanz-System modifiziert werden. Dies wäre jedoch erheblich die höhere Durchsatzkapazitäten im Vergleich zum Bioassay-System in dieser Studie verwendet reduzieren. Dieses Protokoll kann wirksam zum Nachweis von Nicht-HLA-Biomarkern in Patientenserum und Plasma bei Einhaltung einigen kritischen Schritte modifiziert werden. Überwachung der anfänglichen Antikörper-Beschichtungsverfahren ist für die Optimierung der Oberfläche zu empfehlen, da eine &lt;200 pm Verschiebung wird wahrscheinlich bei niedrigen Signal für die nachfolgenden Detektionsschritt führen. Der Studienbeginn und nach dem Waschen liest sind für die Endpunktanalyse als die Fülle von Serumproteinen kann die Bindung von geringer Konzentration Analyt maskieren. Schließlich können Temperaturschwankungen von Proben in Brunnen zu Brunnen Variation führen. Es wird empfohlen, alle Proben vorinkubiert eind das Etikett frei biosassay Einheit Temperaturregler auf 2-3 ° C über der Raumtemperatur eingestellt werden. Gekühlte Proben müssen genügend Zeit, um die Betriebstemperatur zu erreichen gestattet. Zukünftige Modifikationen dieses Protokolls umfassen Multiplexen TCRM auf der Plattenoberfläche. Das Bioassay-System ist derzeit zugänglich Spek von Vertiefungen in einer Dichte von mindestens 8-plex. Durch die Einführung von 4-8 TCRM in jede Vertiefung, pro Testprobenvolumen reduziert werden und ermöglichen die Erfassung von immer komplexer Daten pro Patient. Diese Fähigkeit könnte weiter Patienten informieren im Hinblick auf Therapiemöglichkeiten.

Die Klasse-I-Human-Leukozyten-Antigen (HLA) Proben Peptide von 8-11 Aminosäuren in der Länge von der proteasomalen Abbau des intrazellulären Proteins Repertoires abgeleitet und stellt diese Peptide auf der Oberfläche jeder kernhaltigen Zelle 1,2. Der HLA-Komplex ist &quot;Natur Biomarker&quot;, was den Zustand jeder Zelle (1) zum umlaufenden zytotoxischen T-Lymphozyten (CTL). Die Anerkennung der Krankheit assoziierten Peptiden ergibt Beseitigung des betreffenden Zelle durch CTL. Daher ist die adaptive Immunantwort sehr wirksam zur Beseitigung von viralen Infektionen und Tumoren. Allerdings übt das Immunsystem Druck, der oft fördert Auswahl auf Viren oder Tumor der Lage Umgehung eine effektive CTL-Antwort. T-Zell-Rezeptor nachahmen (TCRM) monoklonale Antikörper (mAbs), die spezifische Peptid / HLA-A * 02 zu erkennen: 01-Komplexe, wie die von Brustkrebs-assoziierten Proteinen, Makrophagenmigration-Hemmfaktor, abgeleitet (MIF19-27) 3 und NY-ESO-1, 157-165, ermöglichen Detektion und Zerstörung von Brustkrebs-Zellen in Abwesenheit einer wirksamen Antitumor-CTL-Reaktion 4,5. Diese repräsentative Arbeiten an HLA-A * 0201-Molekül, das durch bis zu 30% der Population exprimiert wird, konzentriert. Die Identifizierung von anderen relevanten HLA / Peptid-Komplexe, gefolgt von der Herstellung von TCRM ermöglicht jedoch die Entwicklung gezielter Immuntherapien und Begleiterkrankungen Diagnostik, erweitern den Nutzen dieser Arbeit zu einem viel breiteren Bevölkerung. Ein Teil des Peptid / HLA-Komplexen zur Zelloberfläche gebunden ist, in das Plasma freigesetzt. Aufgrund der hohen Komplexität von Peptid / HLA-Pools, aktuelle Methoden für den Bergbau die immunopeptidome für HLA verbundenen Biomarker sind zeitaufwendig. Dieses Verfahren erfordert die Affinitätsreinigung von löslichem HLA aus Plasma, Abscheidung von HLA assoziierten Peptiden durch Umkehrphasen-Hochdruckflüssigkeitschromatographie(RP-HPLC) und Peptidsequenzierung durch Tandem-Massenspektrometrie (MS / MS) 6,7. Obwohl dieses Verfahren eine praktikable Option für die Entdeckung neuer therapeutischer Ziele, es ist ein schwerfälliger Prozess als Begleiter Diagnose-Tool für HLA damit verbundenen Ziele bereits in der therapeutischen Impfstoff oder biopharmazeutische Pipeline 8-10. TCRM gerichtet gegen diese Ziele stellen die Werkzeuge für die schnelle Entwicklung eines diagnostischen Begleit bei Stratifizierung Patienten in relevanten klinischen Studien und bieten fundierte Therapiemöglichkeiten abzielen. In dieser Arbeit wird ein Durchbruch Biomarker-Screening-System für die Krebsdiagnostik vorgestellt, TCRM und eine markierungsfreie Bioassay-System, das den biologischen Wechselwirkungen mit minimalen Verarbeitungsschritte überwacht nutzt. Die markierungsfreie Bioassay-System basiert auf einem Verfahren, das die Geführte-Mode-Resonanz- (GMR-) Effekt, der in der dielektrischen Wellenleitergitter 11-14 auftritt nutzt basiert. Bei Breitbandlicht Kontakte die diffraktiveGitter in der für dieses System erforderlichen Platten werden zwei bestimmte Wellenlängen reflektiert. Die Bindungswechselwirkung zwischen einem immobilisierten Rezeptor und seinem Liganden wird in Echtzeit durch Verfolgung der Resonanzwellenlängenverschiebung mit einem Spektrumanalysator 12 überwacht. Separate Resonanzspitzen auftreten, für einfallendes TE (elektrische Vektor senkrecht zur Einfallsebene) und TM (Magnetvektor normal zur Einfallsebene) Polarisationszustände Bereitstellen mehrerer Datenpunkte, die möglicherweise erhöhen Erfassungsgenauigkeit 11,14. Verwendung des Antikörpers vorsensibilisierten Platten in diesem markierungsfreien Assaysystem, das Assay Laufzeit mit der Datenanalyse ist ungefähr 45 min. Darüber hinaus können mehrere Patientenproben in einem 96- oder 384-Well-Format über eine HPLC-MS / MS-basiertes Format abgefragt werden, ist klar im Vorteil.

<table><tbody><tr><td>ResoSens Markierungsfreies Bioassay-Nachweissystem</td><td>Integrierte Resonanzsensoren Integrierte</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Avidin-sensibilisierte bionetische 96-Well-Platten</td><td>Integrierte Resonanzsensoren Integrierte</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ResoVu-Software</td><td>Integrierte Resonanzsensoren Integrierte Resonanzsensoren Integrierte</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RL21A Biotinylierte TCRm mAb&nbsp;</td><td>PureMHC, LLC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RL9A Biotinyliertes TCRm mAb&nbsp;</td><td>PureMHC, LLC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FLSL HLA-A*02:01 Monomer&nbsp;</td><td>Experimmune</td><td></td><td>vollständige Peptidsequenz: FLSELTQQL</td></tr><tr><td>SLLV HLA-A*02:01 Monomer&nbsp;</td><td>Experimmune</td><td></td><td>vollständige Peptidsequenz: SLLMWITQV</td></tr><tr><td>YLEV HLA-A*02:01 Monomer&nbsp;</td><td>Experimmune</td><td></td><td>vollständige Peptidsequenz: YLEPGPVTV</td></tr><tr><td>KVL HLA-A*02:01 Monomer&nbsp;</td><td>Experimmune</td><td></td><td>vollständige Peptidsequenz: KVLEYVIKV</td></tr><tr><td>Gepooltes normales menschliches Serum&nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>BP2657100</td><td></td></tr><tr><td>MDA-MB-231 Zellüberstand</td><td>ATCC</td><td>HTB-26</td><td>Zellen, gezüchtet in IMDM, 10 % FBS und 1 % Penn/Streptokokken. Überstände aus 3 Tage konfluenten Kulturen.</td></tr><tr><td>Iscove's Modifikation des Dulbecco-Mediums (IMDM)</td><td>Life Technologies</td><td>12440-053</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum (FBS)</td><td>Life Technologies</td><td>10082-147</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>15070-63</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxid</td><td>ThermoFisher</td><td>5318-1</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>ThermoFisher</td><td>BP665-1</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung + 0,05 % Tween 20 (PBST)</td><td>ThermoFisher</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>2,2'-Azinobis [3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonsäure]-diammoniumsalz (ABTS)</td><td>ThermoFisher</td><td>37615</td><td></td></tr><tr><td>Kaninchen Anti-Mensch &Beta; 2 Mikroglobulin&nbsp;</td><td>Dako</td><td>A0072</td><td></td></tr><tr><td>Peroxidase konjugiertes Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG&nbsp;</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>111-035-144</td><td></td></tr><tr><td>Nunc&nbsp; Mikrotiterplatten</td><td>ThermoFisher</td><td>439454</td><td></td></tr><tr><td>Synergy 2 Mikroplatten-Reader</td><td>Biotek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Immpress Reagenzien-Kit</td><td>Vektor</td><td>Vektor MP-7402</td><td></td></tr><tr><td>Immpact DAB</td><td>Vektor</td><td>SK-4105</td><td></td></tr><tr><td>Hämatoxylin QS</td><td>Vektor</td><td>H3403</td><td></td></tr><tr><td>IgG2a</td><td>MP BioMedicals</td><td>50328</td><td></td></tr><tr><td>IgG2b</td><td>MP BioMedicals</td><td>50330</td><td></td></tr><tr><td>anti-HLA-A2 (BB7.2)</td><td>Experimmune</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Prism 5</td><td>Graphpad</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

der nachweis von human-leukozyten-antigen biomarkern bei brustkrebs verwendung markierungsfreie biosensorik

Detection of Human Leukocyte Antigen Biomarkers in Breast Cancer Utilizing Label-free Biosensor Technology

Nach Angaben der American Cancer Society, werden mehr als 200.000 Frauen mit invasivem Brustkrebs pro Jahr diagnostiziert, und rund 40.000 an der Krankheit sterben. Die menschliche Leukozyten-Antigen (HLA) Klasse-I-Peptide, die von Proben proteasomalen Abbau von Zellproteinen abgeleitet und stellt diese Fragmente auf der Zelloberfläche für die Abfrage durch zirkulierende cytotoxische T-Lymphozyten (CTL). Erzeugung von T-Zell-Rezeptor-Mimetikum (TCRM) monoklonale Antikörper (mAbs), die Brustkrebs erkennen spezifische Peptid / HLA-A * 02: 01-Komplexe, wie sie aus Makrophagen-Migration-Hemmfaktor (MIF 19-27) und NY-ESO- abgeleiteten 1, 157-165 aktivieren Erkennung und Zerstörung von Brustkrebs-Zellen in Abwesenheit einer wirksamen Antitumor-CTL-Antwort. Intakte Klasse I HLA / Peptid-Komplexe werden von Brustkrebszellen zu vergießen und stellen möglicherweise relevanten Biomarkern. In dieser Arbeit wurde ein Durchbruch Biomarker-Screening-System für die Krebsdiagnostiks Einbeziehung T-Zell-Rezeptor mimic monoklonalen Antikörper in Kombination mit einem neuartigen, markierungsfreie Biosensor Verwendung Geführte-Mode-Resonanz- (GMR-) Sensor-Technologie dargestellt. Der Nachweis von Schuppen MIF / HLA-A * 02: 01-Komplexe in MDA-MB-231 Zellüberstände, Stachelhumanserum und Patientenplasma wird demonstriert. Die Auswirkungen dieser Arbeit konnte personalisierten Medizin durch die Entwicklung von Begleiterkrankungen Diagnose gezielter Immuntherapien zu revolutionieren.

Ein repräsentativer Satz von Experimenten wurde unter Verwendung des gut charakterisierten TCRM, RL21A, ein murines IgG2a monoklonaler Antikörper, der spezifisch für ein Peptid (MIF 19-27 oder FLSL) im Rahmen des HLA-A * 02: 01 Molekül 3. Die verwandten Peptid / HLA-Monomer sowie irrelevanten HLA-Monomer 15 wurde verwendet, um das beschriebene Verfahren zu demonstrieren. 3 zeigt den Assay-Format. RL21A ist spezifisch für die FLSL / HLA-Monomer mit geringer Kreuzreaktivität mit anderen Peptid / HLA-Komplexe 3. Diese Besonderheit wird mit der markierungsfreien Bioassay-System (Abbildung 4) rekapituliert. Die Empfindlichkeit des Etiketts frei Bioassay-System für diesen Versuch ist in niedrigen nanomolaren Bereich durch Titration des RL21A Antikörper immobilisiert auf FLSL / HLA-Monomer (Abbildung 5) bestimmt. Obwohl das Hintergrundsignal wesentlich im Serum erhöht, specific Detektion FLSL / HLA-Monomer in Stachelhumanserum ist in Figur 6 erreicht und ein Konzentrationsgradient ist leicht erkennbar in diesen Proben. Schließlich Stände aus der MDA-MB-231-Zelllinie, die zuvor gezeigt, dass die FLSL / HLA-A * 02 zu präsentieren: 01 Molekül, werden gezeigt, um lösliche FLSL Monomer enthalten mit diesem Etiketten kostenlose Testplattform (Bild 7). Anschließende Zugabe FLSL / HLA-Monomer erhöht das Signal auf RL21A (Abbildung 7). Aufgrund der Empfindlichkeit des Systems, ebenso gut Variation einschließlich negativer Resonanzverschiebungen können als Ergebnis von Temperaturschwankungen auftreten können, wie ersichtlich als Funktion der Standardabweichungen in den 4 und 5. Diese Variationen können dramatisch durch Vorinkubation von allen Proben und dem Bioassay-Plattenleser bei einer Temperatur etwas höher als Raumtemperatur (dh 28 ° C) reduziert werden. In 8 kurz, 96-Wanne Polystyrol-Platten wurden beschichtet mit [10 ug / ml] RL21A für 2 h bei Raumtemperatur mit PBST gewaschen, mit 0,5% fettarme Milch, mit PBST gewaschen, blockiert, und während 2 Stunden bei Raumtemperatur mit seriellen Verdünnungen inkubiert FLSL HLA-Monomer in normalem Humanserum, 1:10 verdünnt in PBS, eine Standardkurve zu erzeugen oder Patientenplasma verdünnt 1:10 in PBS. Die Platte wurde mit PBST gewaschen, inkubiert 1 h bei Raumtemperatur mit Kaninchen-Anti-Human-β2 Mikroglobulin [1: 5000], um intakte HLA detektieren und in PBST gewaschen. Die Platten wurden dann für 30 min mit Ziege-Anti-Kaninchen IgG [1: 10.000] inkubiert und mit PBST gewaschen. Kolorimetrische Nachweis wurde unter Verwendung von ABTS (2,2'-Azinobis [3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonsäure] -diammonium Salz) Substrat mit einer 15 min Inkubationszeit und bei 405 nm auf einem Mikroplattenlesegerät beobachtet. FLSL / HLA wurde in drei Patientenproben nachgewiesen. In 8B wurde Patientenplasma RL.064 1:20 in PBS verdünnt und fügened zu der Platte und auf der markierungsfreien Detektor für 60 min überwacht. Spezifischer Nachweis von FLSL / HLA-Komplex in Patientenserum wurde durchgeführt. Student t-Test wurde unter Verwendung von Grafiken und Statistik-Software (p &lt;0,05). In 8C Gewebeschnitte wurden mit 1 &amp; mgr; g / ml mit Maus anti-HLA-A2 (BB7.2) als eine positive Kontrolle, RL21A, IgG2b und IgG2a bzw. als Negativkontrolle angefärbt. Die Färbung wurde mit einem Anti-Maus-Nachweis-Kit, DAB (Diaminobenzidin) und Hämatoxylin QS für die Kernfärbung, wie vom Hersteller gerichtet erkannt. Die Färbung von Tumorgewebe durch RL21A bestätigt Präsentation FLSL / HLA-Komplexen. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/52159/52159fig1highres.jpg"> Abb. 1: Tumor-Antigen-Präsentation durch die Klasse-I-Human-Leukozyten-Antigen-Krebs Transformation ist ein intrazelluläres Störung. HLA Probe intracellular Proteine ​​und zeigen krebsbedingte Veränderungen an der Zelloberfläche. CTL und TCRM können Krebszellen durch HLA-Peptid-Komplexe unterscheidbar diesen Zellen zu erkennen. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/52159/52159fig2highres.jpg"> Abb. 2: Screenshot der Datenerfassung im Biotest-Scanner-Software Beispiel für die Datenerfassung, die die anfänglichen Basis-Scan durch RL21A Antikörper zusätzlich zu einer Platte mit 10 ug / ml FLSL / HLA-Komplex beschichtet gefolgt. Antikörperkonzentrationen sind wie angegeben. Jede Zeile steht für eine Einzelperson gut über die Zeit verfolgt. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/52159/52159fig3highres.jpg"> Abb. 3: Assay-Format Illustration von Antikörpern auf dem Beugungsgitter Oberfläche der Testplatte Erfassung rel immobilisierteinschlägigen Peptid / HLA-Komplexe in Lösung. <img alt="4" src="/files/ftp_upload/52159/52159fig4highres.jpg"> Abbildung 4: Spezifität der RL21A für FLSL / HLA-Komplex Demonstration der Spezifität der biotinyliert RL21A TCRM für seine relevanten (FLSL) HLA-Monomer verglichen mit irrelevanten HLA-Monomer (YLEV, SLLV und KVL).. Biotinylierte RL21A TCRM [10 ug / ml] auf der Avidin beschichtete Assayplattenoberfläche immobilisiert und der Nachweis wurde durchgeführt unter Verwendung von unmarkierten relevant oder irrelevant HLA Monomer [10 &amp; mgr; g / ml] in PBS. RL21A war spezifisch für FLSL / HLA-Komplex. Zwei-Wege-ANOVA wurde mit Grafik und Statistik-Software (p &lt;0,001). <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/52159/52159fig5highres.jpg"> Abb. 5: Die Bindung Empfindlichkeit RL21A zu seinem verwandten Peptid / HLA-Komplex Illustration der Detektiveam Limit und verbindliche Empfindlichkeit RL21A auf die FLSL / HLA-Komplex. Biotinylierte HLA Monomer FLSL [10 ug / ml] wurde auf der Testplatte Oberfläche immobilisiert und unmarkierte RL21A wurde der Platte in seriellen Verdünnungen in PBS wie angegeben zugegeben. Erkennung für dieses System war in niedrigen nanomolaren Bereich. <img alt="Figur 6" src="/files/ftp_upload/52159/52159fig6highres.jpg"> Abbildung 6: Nachweis von HLA-Komplexe in Spitz Human Serum Nachweis der Nachweis von HLA im Humanserum.. Biotinylierte RL21A TCRM [10 ug / ml] auf der Avidin beschichtete Assayplattenoberfläche immobilisiert. Gepoolten normalen Humanserum relevant (FLSL) oder irrelevante (SLLV) HLA-Monomer versetzt wurde 1:20 mit PBS verdünnt und dann zu der Platte und auf der markierungsfreien Detektor für 60 min überwacht. Spezifischer Nachweis von FLSL / HLA-Komplex in Humanserum wurde durchgeführt. In der Regel hoch ist Hintergrundsignal (irrelevant SLLV Monomer)er für verdünnten Serumproben im Vergleich zu reinig Analyten in PBS (siehe Abbildung 4). Zwei-Wege-ANOVA wurde mit Grafik und Statistik-Software (p &lt;0,0001). <img alt="7" src="/files/ftp_upload/52159/52159fig7highres.jpg"> Abb. 7: Lösliche HLA-Komplexe wurden in Brustkrebs-Zellkulturüberständen nachgewiesen Die Fähigkeit, HLA in Brustkrebs-Zellüberständen erkennen demonstriert. Biotinylierte RL21A TCRM, RL9A TCRM (Negativkontrolle) und eine Isotypenkontrolle wurden auf der Testplatte Oberfläche immobilisiert. Spiked [5 &amp; mgr; g / ml] und unspiked MDA-231-Zellkulturüberstände wurden zugegeben, und die Bindung wurde für 60 min auf der markierungsfreien Detektor überwacht. FLSL und SLLV HLA-Monomer aufgestockte Proben repräsentieren positive Kontrollen für RL9A und RL21A verbindlich. Einweg-ANOVA wurde mit Grafik und Statistik-Software (p &lt;0,0001). Fig. 8: Spezifische Detektion FLSL / HLA-Komplexe in den Proben (A) Eine traditionelle Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) wurde verwendet, um FLSL / HLA-Komplexe spezifisch in Patientenplasma zu detektieren. (B) Biotinylierte RL21A TCRM oder IgG2a [10 ug / ml] auf der Avidin Assay-Platte immobilisiert. (C) Brusttumorgewebe von Patienten RL.064 war voller Flecken, wie oben beschrieben 3 bis Tumordarstellung des FLSL / HLA-Komplexe zu überprüfen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52159/52159fig8large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a>

Intakte Klasse I HLA / Peptid-Komplexe werden von Krebszellen zu vergießen, was einem Potential von Bedeutung sind Krebs-Biomarker. Verwendung markierungsfreie Sensorik und T-Zell-Rezeptor imitiert monoklonalen Antikörpern, Nachweis von Schuppen MIF / HLA-A * 02: 01-Komplexe in MDA-MB-231 Zellüberstände, Stachelhumanserum und Patientenplasma wird gezeigt, so dass die Entwicklung von ein neuer Krebsdiagnoseplattform.

Der Nachweis von Human-Leukozyten-Antigen Biomarkern bei Brustkrebs Verwendung Markierungsfreie Biosensorik

According to the American Cancer Society, more than 200,000 women will be diagnosed with invasive breast cancer each year and approximately 40,000 will ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die Messung des humanen Leukozytenantigens oder HLA-assoziierten Tumorantigens in Patientenflüssigkeiten für die Stratifizierung von Patienten in eine relevante Immuntherapie. Dies wird erreicht, indem zunächst T-Zell-Rezeptor-ähnliche Antikörper, bekannt als TCRM, auf der MICROPLATE-Oberfläche immobilisiert werden. Der zweite Schritt besteht darin, die Patientenprobe zusammen mit der seriellen Verdünnung von Zielpeptid-HLA-Monomeren hinzuzufügen, um eine Standardkurve zu erzeugen, die die Quantifizierung des Zielantigens in Patientenproben ermöglicht.Anschließend wird die Bindung des Zielantigens an den Antikörper auf dem Free-Label-Bioassay-System überwacht, bis das Gleichgewicht erreicht ist. Der letzte Schritt besteht darin, die resultierenden Daten zu analysieren, indem die Standardkurve verwendet wird, um die Menge des Zielantigens in Patientenproben zu quantifizieren. Letztendlich wird die markierungsfreie Biosensortechnologie zum Nachweis von Krebs-Biomarkern in Patientenproben eingesetzt.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Techniken wie lc MSS ist der schnelle Hochdurchsatznachweis von HLA-assoziierten Antigenen. Dies ermöglicht eine schnelle Stratifizierung von Krebspatienten in die Behandlungsmodalitäten, da es als Plattform zum Nachweis von Biomarkern dient. Während diese Methode mit dem Screening von Krebs-Biomarkern verwandt ist, ist das System tatsächlich für viele Anwendungen anwendbar, darunter zellbasierte Assays, Immunphänotypisierung, Hybrid-Screening oder das Screening von kleinen Molekülbibliotheken.Die Idee zu dieser Methode hatten wir erst, als wir einen therapeutischen Antikörper zur Nachahmung von T-Zell-Rezeptoren entwickelten. Wir haben uns gefragt, wie wir Patienten identifizieren können, die am meisten von dieser Art der Therapie profitieren würden. Kristen Dahl, eine Doktorandin der Biotechnologie, die in meinem Labor arbeitet, wird dieses Verfahren vorführen.Beginnen Sie mit der Vorinkubation der phosphatgepufferten Kochsalzlösung oder PBS bei 28 Grad Celsius, um temperaturbedingte Resonanzverschiebungen zu minimieren. Geben Sie 50 Mikroliter phosphatgepufferte Kochsalzlösung oder PBS pH 7,2 in die Vertiefungen der mit Avadon-Derivaten beschichteten Platten. Öffnen Sie als Nächstes die Bioassay-Scanner-Software.Folgen Sie dem Setup-Assistenten, um das experimentelle Verfahren zu definieren, das die Auswahl von Rohlingen, Standards und Proben im Plattenlayout, die Temperatureinstellung, die Anzahl der Scans pro Minute und die Länge des Experiments umfasst. Setzen Sie dann die vorbereitete Assay-Platte in den markierungsfreien Bioassay-Scanner ein und starten Sie den ersten Scan. Die Baseline ist der anfängliche Satz von Scans, die zu Beginn des Experiments gesammelt wurden.Wenn dies der erste Test ist, der auf dieser speziellen Platte durchgeführt wird, lassen Sie den Scanner lange genug laufen, um die Temperatur auszugleichen und eine Drift in der Basislinie zu vermeiden. Nachdem sich die Basislinie stabilisiert hat oder nach mindestens fünf Scans, unterbrechen Sie den Lesevorgang und werfen Sie die Platte aus. Entleeren Sie das PBS und fügen Sie 50 Mikroliter RL 21, einen biotinylierten Antikörper, zu allen außer Kontrollwells auf der Platte hinzu.Geben Sie dann 50 Mikroliter PBS in die Kontrollvertiefungen. Setzen Sie anschließend die Platte wieder in den Bioassay-Scanner ein und setzen Sie die Messung fort, bis die Sättigung erreicht ist. Nach ca. 1,5 Stunden unterbrechen Sie den Lesevorgang und werfen Sie die Platte aus.Waschen Sie die Platte dann dreimal mit 200 Mikrolitern PBS pro Mulde plus 0,05%Tween 20 oder PBST. Nach dem Waschen dreimal mit 200 Mikrolitern PBS pH 7,2 pro Well ohne Reinigungsmittel spülen. Klopfen Sie überschüssiges PBS von der Platte auf Papiertücher, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren.Geben Sie als Nächstes 50 Mikroliter PBS in alle aktiven Vertiefungen. Setzen Sie dann die Platte wieder in den Bioassay-Scanner ein und setzen Sie die Messung fort, um die Resonanz nach dem Waschen zu überwachen. Stoppen Sie nach dem Lesen das Lesen und werfen Sie die Platte aus.Um den Analyten hinzuzufügen. Entfernen Sie das PBS und fügen Sie 50 Mikroliter eines geeigneten Assay-Puffers pro Vertiefung für diesen Assay hinzu. Im Handel erhältliches normales Humanserum wurde in PBS um eins bis 20 verdünnt.Öffnen Sie als Nächstes die Bioassay-Scanner-Software und folgen Sie dem Einrichtungsassistenten. Um das experimentelle Verfahren zu definieren, setzen Sie die Platte in den Bioassay-Scanner ein und beginnen Sie mit der Baseline-Messung. Nachdem sich die Baseline stabilisiert hat oder nach mindestens fünf Scans, unterbrechen Sie die Messung und werfen Sie die Platte aus. Entfernen Sie dann den Assay-Puffer aus den Wells.Anschließend werden die Kontrollen mit HLAA oh 2 0 1 Monomer versetzt, das relevante oder irrelevante Peptide in Konzentrationen von 0,625 bis 10 Mikrogramm pro Milliliter im Assay-Puffer enthält. Geben Sie dann 50 Mikroliter der Standards in die Kontrollvertiefungen der Platte. Geben Sie anschließend 50 Mikroliter des Analyten in Assay-Puffer in die Probenvertiefungen der Platte.Für diesen Assay wurde im Handel erhältliches Humanserum mit Dots verwendet. Setzen Sie die Platte wieder in den Bioassay-Scanner ein und setzen Sie die Messung fort, bis die Sättigung etwa 30 bis 60 Minuten nach der Sättigung erreicht ist, unterbrechen Sie die Messung und werfen Sie die Platte aus. Waschen Sie die Platte dreimal mit 200 Mikrolitern PBST pro Well, gefolgt von drei Spülgängen mit 200 Mikrolitern PBS pro Well wie zuvor, und geben Sie dann 50 Mikroliter Assay-Puffer in alle aktiven Wells.Setzen Sie nun die Platte wieder in den Bioassay-Scanner ein und setzen Sie die Messung fort, um die Resonanz nach dem Waschen zu überwachen, bevor Sie die Messung stoppen und die Platte auswerfen. Analysieren Sie schließlich die Daten mit der Bioassay-Scanner-Software oder exportieren Sie Rohdatendateien in die bevorzugte statistische Analysesoftware. Die Bioassay-Scanner-Software generiert automatisch die Bindungskurve basierend auf dem Plattenlayout, das während des Versuchsaufbaus bereitgestellt wurde.Biotinyliertes RL 21 A-T-C-R-M oder IgG zwei A wurde auf der AVID AVIDAN Assayplatte immobilisiert; repräsentative Ergebnisse zeigen den Nachweis des Zieltumorantigens F-L-S-L-H-L-A in einer Patientenplasmaprobe im Gleichgewicht und nach dem Waschen. IgG zwei A wird als Kontrolle für unspezifisch bindende Gewebeschnitte verwendet, die mit einer Positivkontrolle und Negativkontrollen gefärbt wurden. Und für RL 21 bestätigt eine Färbung des Tumorgewebes mit RL 21 A die Darstellung von F-L-S-L-H-L-A-Komplexen.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie HLA-assoziierte Biomarker in Patientenflüssigkeiten mit Hilfe von T-Zell-Rezeptor-ähnlichen Antikörpern gemessen und die Bindung des Zielantigens an den Antikörper auf dem markierungsfreien Bioassay-System überwacht werden kann. Wenn Sie dieses Verfahren ausprobieren, ist es wichtig, daran zu denken, alle Probenpuffer vor der Verwendung zu inkubieren, um Temperaturspitzen zu vermeiden und für jeden Schritt den richtigen Probenpuffer zu verwenden.

detection-human-leukocyte-antigen-biomarkers-breast-cancer-utilizing

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

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Lectin-konjugierten POROS Perlen wurden für die HPLC eingesetzt. Glycopeptid-Normen diente als positive und negative Kontrollen. MARS-14 aufgebraucht wurde trypsinverdauten Humanplasma chromatographiert und Flow-Through-(FT) und gebundenen Fraktionen für ESI-LC-MS/MS Analysen gesammelt. Glykopeptide wurden in der gebundenen Fraktion angereichert, um FT verglichen.

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Schnelle Homogene Detektion von biologischen Assays mit magnetischen Modulation Biosensorik-System

Beginnen Sie mit einer bakteriellen Biosensorkultur, die in einem Medium suspendiert ist.Diese manipulierten Bakterien produzieren einen Transkriptionsfaktor, der bei der Bindung an einen bestimmten Stuhlmetaboliten einen Promotor aktiviert, der mit einem fluoreszierenden Reporter-Gen assoziiert ist.Zu dieser Kultur wird eine gefilterte menschliche Stuhlprobe hinzugefügt, die Metaboliten wie Laktat enthält, die an Wirts-Mikrobiom-Interaktionen beteiligt sind.Verdünnen Sie diese Mischung mit...

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Optische Biosensor-Techniken können Massenänderungen in der Nähe der Plasmamembran in lebenden Zellen erkennen und erlauben es, zelluläre Reaktionen in beiden Einzelzellen und Zellpopulationen zu folgen. Dieses Protokoll wird die Detektion der Modulation von Kaliumkanälen durch G-Protein-gekoppelten Rezeptoren in intakten Zellen unter Verwendung dieses Ansatzes zu beschreiben.

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Einem mikrofluidischen Biochip-basierte Elektrochemische für Markierungsfreie DNA-Hybridisierungsanalyse

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