Ein Ex vivo Laser-induzierte Rückenmarksverletzungen Modell zu Mechanismen der axonalen Degeneration Beurteilen Sie in Echtzeit

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, die Mechanismen der akuten axonalen Degeneration in Echtzeit zu bewerten. Dies wird erreicht, indem das YFP-positive Neuro- und Rückenmarksgewebe des Oberschenkels isoliert wird, während das Gewebe kontinuierlich mit sauerstoffreicher, kalziumarmer, künstlicher zerebraler Rückenmarksflüssigkeit durchblutet wird. Dann wird das Rückenmarksgewebe unter einem Zwei-Photonen-Objektiv unter Beibehaltung physiologischer Bedingungen ausgerichtet und das Myelin mit dem lipophilen Fluoreszenzfarbstoff Nilrot gefärbt.

Als nächstes wird eine mikrogroße Läsion auf der dorsalen Oberfläche einer dorsalen Säule erzeugt, indem die Laserleistung angepasst wird, um myelinisierte Axone innerhalb der Säulen zu transektieren. Die Ergebnisse zeigen eine Retraktion der geschädigten Axone, periaxonale, Myelinschwellungen und andere zelluläre Reaktionen, basierend auf quantitativen Messungen der Bilder. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden besteht also darin, dass wir das gesamte zervikale Rückenmark verwenden und daher die Fasern der dorsalen Säule intakt bleiben.

Dadurch wird eine Schädigung der darunter liegenden zentralen myelinisierten Fasern vermieden, die häufig bei der Vorbereitung von Streifen der weißen Substanz auftritt. Dieses Verfahren wird von Dr. Starlin ada, einem Postdoktoranden in meinem Labor, demonstriert, der sich wirklich für diese Technik eingesetzt hat, um sich auf die intrakardiale Perfusion vorzubereiten. Stellen Sie kalziumarme, künstliche zerebrale Rückenmarksflüssigkeit oder A CSF mit doppelt so konzentrierten BNC-Stammlösungen her, um das ex vivo Rückenmark zu überfüllen.

Während der Bildgebung wird normaler A-Liquor mit den zweifachen Stammlösungen A und B in einer Glasflasche hergestellt. Bieten Sie diese Lösungen bis zu einem pH-Wert von 7,4 an. Bewahren Sie den kalziumarmen A-Liquor in der Nähe des Präparierbereichs gekühlt auf und bewahren Sie den normalen A-Liquor bei Raumtemperatur in der Nähe des Mikroskops auf.

Sprudeln Sie beide Lösungen vor dem Gebrauch eine halbe Stunde lang mit dem Auto und Gas und sprudeln Sie sie während des Gebrauchs kontinuierlich. Bereiten Sie anschließend die Perfusionskammer im offenen Bad für die Bildgebung vor. Schließen Sie zunächst den Metallausgang der Inline-Heizung an die Kammer an.

Kleben Sie dann die Bildgebungskammer mit einer guten Menge an klebrigem Material an die Auffangkammer, so dass die Position der Bildgebungskammer leicht angepasst werden kann. Befestigen Sie den Temperaturfühler der Inline-Heizung in der Nähe des Flüssigkeitseinlasses und befestigen Sie das Saugrohr aus Edelstahl an der Vakuumleitung am Kammerauslass. Schalten Sie nun die Vakuumpumpe und die Perfusionspumpe ein.

Sobald sich die Kammer mit A CSF füllt, drosseln Sie die Pumpe auf 1,5 bis zwei Milliliter pro Minute. Kontrollieren Sie dann das A CF-Volumen in der Kammer durch die Position der Vakuumleitung. Zur Anpassung euthanasieren sechs bis 10 Wochen alte TH eine YFP-transgene Maus.

Vergewissern Sie sich zunächst, dass es keine reflexartige Zehenkneifreaktion gibt. Rasieren Sie dann den Bereich, der das Rückenmark und das Gehirn bedeckt. Wischen Sie die freiliegende Haut nach der Rasur mit Betadin und 70% Ethanol ab.

Besprühen Sie nun den Brust- und Bauchbereich mit 70%Ethanol und perfundierten Sie die tierische trans Cardi mit carbogen bubbled low calcium A CSF. Wenn die Leber zu blasen beginnt, befestigen Sie die Perfusionsnadel mit einem Clip am Herzen. Drehen Sie dann das Tier um und wischen Sie die Rückenhautseite mit 70% Ethanol ab.

Machen Sie einen Schnitt entlang der Mittellinie von der Nase bis zur Hüfte, um die Schädeldecke und das Gewebe über den Wirbeln freizulegen. Ziehen Sie die Haut mit Stecknadeln zur Seite und befestigen Sie das Tier an Nase und Haun. Bringen Sie nun das Präparat dort mit einer Schere fest quer über die dorsale Oberfläche des Schädels auf Höhe der Riechkolben.

Führen Sie die Scherenspitze in den neu gemachten Schnitt ein und schneiden Sie entlang der beiden Schädelkappenkanten, um das Kleinhirn freizulegen. Schneiden Sie die Schädelkappe nicht vollständig heraus. Heben Sie die Schädelkappe, die das Gehirn freilegt, an und schneiden Sie vorsichtig den linken und rechten Rand des Zwischenscheitelknochens über dem Kleinhirn ab.

Während Sie nun vorsichtig an der Schädelkappe und der Oberfläche der dorsalen Wirbelsäule ziehen, schneiden Sie knapp unterhalb der hinteren Nervenwurzeln, um das Rückenmark weiter freizulegen. Schneiden Sie dann mit einer feinen Schere die Wirbel vorsichtig beidseitig ein. Bei einem Winkel von 45 Grad ist es wichtig, Schäden an den dorsalen Säulen zu vermeiden.

Diese strahlend weißen Fasern können leicht beschädigt werden, ohne dass man vorsichtig vorgehen muss, indem sie den herausgeschnittenen Knochen und die Muskeln sanft zurückziehen, während die Wirbel durchtrennt werden. Schneiden Sie ein bis zwei Zentimeter, um ein Segment des zervikalen Rückenmarksgewebes zu isolieren, das für die Bildgebung geeignet ist. Schneide dann mit einer Schere das Gewebe und den Knochen parallel zur Wirbelsäule durch.

Befreien Sie auch das Gewebe unter der Säule. Machen Sie diese Schnitte so waagerecht wie möglich, da es sehr wichtig ist, dass das Gewebe für die Bildgebung flach in der Kammerebene liegt. Verwenden Sie schließlich das Skalpell mit der Nummer 11, um den Hirnstamm über das Ende der Gras-Ulu-Fasern hinaus und auf der oberen Brustebene zu durchschneiden.

Schneide dann mit einer Schere das Gewebe und den Knochen an diesen beiden Stellen ab. Das isolierte Gewebe sollte zwei Drittel der Wirbelsäule enthalten, die den cordalen Hirnstamm, die Zervixvergrößerung und das obere thorakale Rückenmark umfasst. Übertragen Sie die isolierte Wirbelsäule in die ex vivo-Bildgebungskammer und erhöhen Sie die Temperatur der Perfundacht in der nächsten Stunde schrittweise auf 36 bis 37 Grad Celsius.

Halten Sie diese Temperatur während der Bildgebung aufrecht. Ein kritischer Aspekt dieses Protokolls besteht darin, sicherzustellen, dass Sie das Rückenmark isolieren, ohne die Fasern der dorsalen Säule zu beschädigen. Der zweitwichtigste Aspekt dieses Protokolls besteht darin, sicherzustellen, dass das Rückenmark kontinuierlich mit sauerstoffhaltiger künstlicher zerebraler Rückenmarksflüssigkeit durchblutet wird.

Befestigen Sie die Wirbelsäule vorsichtig mit einem modifizierten Objektträgerhalter in der Kammer. Es ist wichtig, das freiliegende Rückenmark und die Rückensäulen nicht zu berühren oder mit den Fäden der Liker-Fäden Druck auf sie auszuüben. Um nun das Myelin zu färben, stoppen Sie kurz den Lösungsfluss und entfernen Sie die Vakuumleitung.

Fügen Sie fünf bis 10 Mikroliter fünf Millimolar Nilrot Farbstoff in der Nähe des cordalen Endes des Rückenmarks hinzu. Mischen Sie dann die Lösung vorsichtig in der Bildgebungskammer und lassen Sie das Gewebe ein oder zwei Minuten lang inkubieren. Nach der Färbung wird der Fluss des sauerstoffhaltigen A-Liquors auf 1,5 bis zwei Milliliter pro Minute zurückgeführt und die Vakuumleitung mit einem Zwei-Fotomikroskop ersetzt.

Bilden Sie das Rückenmark mit einem Wasserimmersionsobjektiv ab. Senken Sie das Objektiv langsam auf die A-Liquoroberfläche ab und bringen Sie dann das Rückenmark unter AF-Leuchtstoffröhrenlicht in den Fokus. Wechseln Sie nun in den Scan-Modus für die Baseline-Bildgebung des aufsteigenden Grases.

Oculus myelinisierte Fasern. Um das YFP und das Nilrot anzuregen, stellen Sie die Anregung auf 950 Nanometer ein und isolieren Sie die Fluoreszenzemissionen mit DI-Chronik- und Biegepassfiltern. Wenn Sie innerhalb einer Stunde nach der Bildgebung feststellen, dass mehr als 3% der Axone Steroide enthalten, bedeutet dies, dass das Rückenmark während der Isolierung geschädigt wurde.

Es ist jetzt am besten, das Präparat zu entsorgen, um das Gewebe mit dem Laser zu verletzen. Suchen Sie zunächst einen Bereich des Gewebes, der eben zu sein scheint. Erhöhen Sie dann die Vergrößerung des Betrachtungsbereichs auf 30,3-fach.

Stimmen Sie den Laser auf 800 Nanometer ab und erhöhen Sie seine Leistung auf etwa 110 Milliwatt. Führen Sie nun fünf Sichtfeld-Laserscans durch. Das Ergebnis sollte eine vollständige Ablation mit einem Durchmesser von 20 Mikrometern sein.

Überprüfen Sie die Verletzung in den Standard-Bildgebungseinstellungen mit dem Laser bei 17 Milliwatt und bei 20,08-facher Vergrößerung. Wenn die axonalen Fasern bei der Ablation nicht vollständig durchtrennt sind, ist das Präparat zu verwerfen. Verwenden Sie nun die Zeitraffereinstellungen mit Z-Aufnahmen, um dynamische Aufnahmen von Verletzungsreaktionen zu erstellen.

Das Präparat kann bis zu 24 Stunden lang abgebildet werden. Ein Rückenmarkssegment wurde isoliert und wie zu Studienbeginn T-P-L-S-M beschrieben positioniert. Die Aufzeichnungen zeigen myelinisierte Gras-Gelenksachsen als parallel ausgerichtete YFP-positive Axone in der Scheide, dinarrot gefärbtes Myelin mit wenigen axonalen Steroiden oder anderen morphologischen Anzeichen einer axonalen Degeneration.

Feine Details sind zu sehen, wie z.B. die Nase von ROM VA, die durch Pfeilspitzen hervorgehoben wird. 40 Minuten später nach einer laserinduzierten Rückenmarksverletzung. Die meisten der durchtrennten Axone bilden charakteristische axonale Endbulben und ziehen sich von der Verletzungsstelle zurück, Axone in der Nähe der Verletzungsstelle erfährt eine sekundäre Degeneration und die axonale Schwellung tritt stärker in Erscheinung.

Im Gegensatz zu den vierteljährlich zurückziehenden Fasern waren die meisten der zurückziehenden axonalen Endknollen, die distal von der Läsion und Steroiden entfernt lagen, stark mit Nilrot markiert, was auf eine Umweltveränderung innerhalb des Axons hindeutet. Nach sieben Stunden zogen sich die Axone weiter von der Läsionsstelle weg. Dies ist jedoch bei Endbulben, die distal oder rostral von der Läsion entfernt liegen, deutlicher als bei Endbulben, die proximal oder cordal der Läsion liegen.

Letztendlich erfuhren Axone, die zunächst verschont blieben, nach und nach eine verzögerte Sekundärdegeneration. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie das Neuro- und Rückenmark isolieren und eine laserinduzierte Rückenmarksverletzung durchführen können. Daher werden Sie in der Lage sein, die dynamischen Aspekte sowohl der primären als auch der sekundären axonalen Degeneration in Echtzeit zu untersuchen.

Die Informationen, die durch die Verwendung dieses Modellsystems gewonnen werden, können zu einem wichtigen mechanistischen Verständnis sowohl von Axon- als auch von Myelinschäden nach Verletzungen führen.