Lokalisierung, Identifizierung und Exzision Murine Fettgewebe Depots

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Identifizierung und Exzision von Fettablagerungen für die Analyse verschiedener faktorieller Effekte auf und durch Fettgewebe zu demonstrieren. Dies wird erreicht, indem zunächst die inneren Organe und Fettdepots einer erwachsenen Maus freigelegt werden. Im zweiten Schritt werden die Organe und das überflüssige Gewebe entnommen, um die Depots besser freizulegen und so die Depots an den entsprechenden Standorten identifizieren zu können.

Im letzten Schritt wird dann das Fettgewebe mit besonderer Sorgfalt entnommen, um eine Kontamination zu vermeiden. Letztendlich wird durch die Isolierung und Exzision dieser Ablagerungen Gewebe für die histologische Analyse, die Proteinexpression, die Enzymaktivität und die Genexpressionsanalyse sowie für In-vitro-Studien bereitgestellt. Der Hauptvorteil dieses speziellen Protokolls gegenüber bestehenden Methoden besteht darin, dass es eine Isolierung mehrerer Depots mit minimaler Dissektion sowie minimaler Kontamination ermöglicht.

Dieses Verfahren kann also helfen, Fragen rund um das Thema Fettleibigkeit zu beantworten. Zum Beispiel die schädlichen oder sogar positiven Auswirkungen von Fettgewebe auf menschliche Krankheiten. Um braunes Fettgewebe zu isolieren, beginnen Sie damit, eine mit Ethanol gereinigte, euthanasierte erwachsene Maus in Rückenlage mit dem Rücken gegen den Tisch zu legen.

Heben Sie dann die Haut mit einer Pinzette direkt unter dem Zwerchfell an und schneiden Sie die Haut mit einer Schere ein. Schneiden Sie quer um den Umfang der Maus, um das Bauchfell freizulegen. Halten Sie dann die unteren Gliedmaßen und den Bauch in einer Hand und ziehen Sie mit der anderen Hand die Haut in Richtung Kopf, um die obere Hälfte der Maus zu enthandschuhen, wodurch das schmetterlingsförmige braune Fettdepot oder die Fledermaus zum Vorschein kommt.

Lokalisiere als Nächstes das Scape und das entsprechende Fledermausdepot. Verwenden Sie dann ein Präpariermikroskop, um vorsichtig oberflächliches weißes Fettgewebe auf dem Schmetterling zu entfernen, und präparieren Sie das interscapulare braune Fett, wobei Sie darauf achten, damit verbundene Muskeln zu vermeiden. Um das subkutane oder subq-Fettgewebe zu isolieren, halten Sie die oberen Gliedmaßen und den Thorax in einer Hand und ziehen Sie mit der anderen Hand die Haut in Richtung der Füße nach unten, um die untere Hälfte der Maus zu enthandschuhen und die dreieckigen leistenförmigen subq-Ablagerungen freizulegen.

Bringen Sie dann die Maus wieder in die Rückenlage und zerlegen Sie vorsichtig die Dreiecke aus subq-Fett, um das Gonadenfett aus der Bauchhöhle zu isolieren. Schneide das Bauchfell mit einer Schere quer direkt unter dem Zwerchfell. Schneiden Sie dann das Bauchfell vom Zwerchfell bis zum Rektum, in der Mitte koronal, um die Bauchorgane freizulegen, und präparieren Sie vorsichtig beide epidermalen Fettdepots von den Hoden epi und Vasa deia.

Um das perivaskuläre Fettgewebe zu isolieren, halten Sie das Tier in Rückenlage und strecken Sie die oberen und unteren Gliedmaßen nach außen. Heben Sie als Nächstes den Xiphoid-Prozess mit einer Pinzette an, um eine Spannung über die Oberseite des Körpers zu erzeugen, und schneiden Sie horizontal durch das Zwerchfell, wodurch der untere Teil der Brusthöhle freigelegt wird. Schneiden Sie durch den Brustkorb superior in Richtung Kopf bis zur Seite des Brustbeins und nehmen Sie dann den Brustkorb knapp unterhalb des Schlüsselbeins auf.

Schneiden Sie entlang der unteren Länge des Schlüsselbeins in Richtung Achselhöhle in beide Richtungen. Die Brusthöhle und ihr Inhalt sollten nun deutlich sichtbar sein. Sobald der Bereich von Flüssigkeit befreit ist, schneiden Sie die Bronchien und die daran befestigten Gefäße ab, um die Lunge zu entfernen und das Herz freizulegen.

Nachdem Sie den Magen und die Speiseröhre identifiziert haben, schneiden Sie die Speiseröhre am gastroösophagealen Übergang durch, um den Magen zu befreien. Identifizieren Sie als Nächstes den Darm und das umgebende Mesenterium. Schneiden Sie oberflächlich durch das Mesenterium und schneiden Sie dann den Dickdarm so nah wie möglich am Rektum, um Magen, Darm, Dickdarm, Bauchspeicheldrüse und Milz zu befreien.

Wenn die Organe entfernt wurden, durchtrennen Sie die Lebervenen und das Verbindungsmesenterium und entfernen Sie alle Leberlappen. Schneiden Sie die viszerale Schicht und das Fett, das die Nieren umgibt, weg und lassen Sie die Nieren in vivo an der Aorta befestigt, um als geografische Marker für die verschiedenen Segmente der Aorta zu dienen. Wenn der Bereich um die Nieren herum frei ist, verwenden Sie eine Mikroschere und eine Mikrozange, um die Aorta von ihrem dorsalen Ansatz an der Wirbelsäule und ihrem ventralen Ansatz an der Speiseröhre zu trennen.

Im Thorax verfolgen und lösen Sie die Aorta von ihrem Ursprung im Herzen bis zur Bifurkation im Beckenbereich. Um das Aortenfettgewebe zu isolieren, können an dieser Stelle die Schlüsselbeingefäße identifiziert werden. Isolieren Sie diese Gefäße vom Hals bis zur Aortenwurzel, um den Aortenübergang und die Wurzel im Herzen besser freizulegen.

Entfernen Sie dann die Thymusdrüse und durchtrennen Sie die brachiozephalie, die linke Halsschlagader und die linke Arteria subclavia, um die Bewegung des Herzens zu ermöglichen. Verwenden Sie abschließend ein Präpariermikroskop, um das perivaskuläre Fettgewebe oder die P VVA T-Schicht, die die Aorta umgibt, zu betrachten. Verwenden Sie dann eine Mikrozange, um das Gewebe vorsichtig von der Aorta wegzuziehen, und eine Mikroschere, um den Ansatz des PVAT an der Aorta vorsichtig zu durchtrennen, beginnend im Brustbereich, knapp oberhalb der Stelle, an der sich das Zwerchfell befindet.

Verwenden Sie dann eine Mikrozange, um das Gewebe vorsichtig von der Aorta wegzuziehen, und eine Mikroschere, um den Ansatz des PVAT an der Aorta vorsichtig zu durchtrennen, beginnend im Brustbereich, der knapp über der Stelle liegt, an der sich das Zwerchfell befindet. Wiederholen Sie diesen Vorgang über die gesamte Länge der Aorta und enden Sie in der infrarenalen Aortenregion, die sich knapp oberhalb der Beckenbifurkation des Aortengefäßes und unterhalb der Nierenäste befindet. Und die Proben können durch histologische Analyse unterschieden werden, wobei die primären Zelllinien der subkutanen Adipozyten und der perivaskulären Zelllinien mit h und e gefärbt werden.

Adipozyten können dann kultiviert und von Präadipozyten zu Adipozyten für die Microarray-Analyse differenziert werden. In diesen repräsentativen Bildern wurde beispielsweise die Umwandlung von kultivierten Präadipozyten in Adipozyten mit ölroten O-färbenden Adipozyten bestätigt, die mit dieser Methode isoliert, kultiviert und differenziert wurden und für weitere in vitro Analysen verwendet werden können. In diesem repräsentativen Experiment wurde beobachtet, dass die enzymatische Aktivität von MM P zwei bei isolierten perivaskulären Adipozyten als Reaktion auf eine experimentelle Behandlung im Vergleich zu unbehandelten Kontrollen abnahm.

Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, Ihre Handschuhe zu wechseln und Ihre Instrumente häufig zu reinigen, um die Kontamination zu minimieren. Nachdem diese Gewebe entnommen wurden, können eine Vielzahl von Eingriffen an ihnen durchgeführt werden. Zum Beispiel Zellkultur, histologische Analysen, Proteinmessungen und sogar Genexpression.

Und dann können diese Ergebnisse verwendet werden, um die Beziehung und die Ähnlichkeiten und Unterschiede zwischen den verschiedenen Depots zu verstehen.