Name: Isolierung von Myofibroblasten aus Maus und Mensch Ösophagus (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 18 s
Description: Erfahren Sie die Isolierung primärer Myofibroblasten aus dem Ösophagus von Maus und Mensch mittels Kollagenas-Verdauung. Diese Methode ermöglicht funktionelle Studien epithelial-stromaler Interaktionen.

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Autoren haben nichts offenzulegen.

Das Protokoll zu Tierversuchen, die Grundlagen und Ziele der Forschung durchzuführen, von der University of Southern California Institutional Animal Care und Verwenden Ausschuss eingereicht und genehmigt wurden. Das Protokoll für die Einrichtung von Primärkulturen von de-identifizierte menschliche Speiseröhre Proben wurde von der University of Southern California Institutional Review Board genehmigt. 1. Besorgen Sie Maus oder Mensch Ösophagus <ol><li> Erhalten Maus Ösophagus: <ol><li> Euthanize die 8-12 Tage alten Maus mit 2% Isofluran Inhalationsdosis durch Genickbruch folgte. </li><li> Pin das Tier sich mit Bauch nach oben und benetzen die Bauchseite mit 70% Ethanol. Mit einer Pinzette greifen und heben Sie die Haut anterior der Harnröhrenöffnung mit einer Pinzette. Verwenden Sie gerade Standard-OP-Schere entlang der ventralen Mittellinie von der Harnröhrenöffnung bis zum Kinn geschnitten. Achten Sie darauf, nur die Haut geschnitten. &lt;/ Li&gt; <li> Einen Einschnitt von der Harnröhrenöffnung nach unten auf das Knie auf beiden Seiten des Tieres, wodurch ein umgekehrtes &quot;Y&quot;. Eine weitere Einschnitt auf beiden Seiten des Tieres entlang der Rippen. </li><li> Die Haut sorgfältig schälen auf beiden Seiten, aus der zugrunde liegenden Bauchfell und den Brustkorb und legte sich an den Seiten. Untersuchen der Brustkorb über der Brusthöhle und das Peritoneum über der Bauchhöhle. <ol><li> Heben Sie das Bauchfell mit einer Pinzette und durchschneiden bis zum Zwerchfell und Brustkorb und zeigte Schere nach oben, um Schäden an Bauch Inhalte zu verhindern. Gently heben Sie den linken Leberlappen, legen das darunterliegende Magen, der Speiseröhre und Magen-Kreuzung und die Bauch Teil der Speiseröhre. </li></ol></li><li> Verwenden autoklaviert chirurgische Scheren durch das Brustbein und Brustkorb entlang der Mittellinie bis zu den Hals Gürtel geschnitten. Punkt Schere nach oben, um eine Beschädigung der thorakalen Inhalte zu verhindern. Voll den Inhalt des ExposesBrusthöhle durch Ziehen des Brustkorbs zu den Seiten. </li><li> Das Herz und die beiden Lungenlappen vorsichtig entfernen. Absorbieren überschüssiges Blut mit Q-Tips. Die Brust-Ösophagus ist ein schmaler, flexibler Schlauch liegen hinter der Luftröhre und anterior der Brustwirbel. HINWEIS: Die Speiseröhre kann schwierig sein, in murinen Neugeborenen identifizieren. Lokalisierung des Ösophagus und Magen-Kreuzung macht Speiseröhren Identifikation unkompliziert. </li><li> Befolgen Sie sorgfältig die Speiseröhre aus dem Magen, sezieren die umliegende Gefäßsystem, Fett und Gekröse den ganzen Weg bis zu der Speiseröhre Ursprung im Halsraum. Chirurgische Schere mit stumpfer Spitze am besten für diesen Zweck. </li><li> Resezieren die gesamte Länge der Speiseröhre und in Hanks &#39;ausgeglichener Salzlösung (HBSS) zur weiteren Verarbeitung weiter unten beschrieben. Entfernen Sie einen Teil des Magens zur Orientierung, wenn gewünscht. HINWEIS: Aufgrund der kleinen Gewebegröße, die Trennung der Muscularis propria von der Muskelist Schleimhaut nicht in murine Neugeborenen Speiseröhre erreichbar und die gesamte Speiseröhre zu Verarbeitung nachfolgend beschriebenen unterzogen. </li></ol></li><li> Erhalten Menschen Ösophagus: <ol><li> Waschen Sie Ösophagusresektion Proben (typischerweise 5 cm oder weniger) mit HBSS und entfernen Sie alle angeschlossenen Bindegewebe, Fett oder Gefäßsystem. </li><li> Resektion eines Teils der Probe und setzen in Formalin für zukünftige histologische Untersuchung, falls gewünscht. </li><li> Trennen Sie die übrigen Schleimhaut aus Basis Muscularis propria durch scharfe Dissektion. </li><li> Geschnitten Schleimhaut in Unterzentimeter Fragmente und unter der nachstehend beschriebenen Protokoll. HINWEIS: Human Speiseröhre Resektionen in PBS für bis zu 6 Stunden vor der Verarbeitung nachfolgend beschrieben gelagert werden. Quelle der Ösophagektomie Proben wird diktieren, Probengröße und Laborabhängig sein. </li></ol></li></ol> 2. Isolieren murinen und humanen Ösophagus-Stromazellen <ol><li> Isolieren der Speiseröhre Stromazellen from murinen und menschlichen Gewebes durch eine Kombination von mechanischen und enzymatischen Verdau. <ol><li> Mechanisch verdauen durch Zerkleinern des Gewebes mit einer Schere und mehrmaligem Waschen mit HBSS. Enzymatisch zu verdauen durch Inkubieren des Gewebes mit 300 U / ml Kollagenase XI und 0,1 mg / ml Dispase, für 25 min (murine Gewebe) oder bis zu 6 Stunden (menschliches Gewebe). Stellen Sie sicher, dass Instrumente zur Zerkleinerung verwendet wurden autoklaviert und sterilisiert. HINWEIS: Kollagenasen sind Enzyme, die Kollagen, eine extrazelluläre Matrix zur Aufnahme von tierischem Gewebe zusammen verantwortlich Protein zu brechen. Kollagenase XI hat hohe Collagenase-Aktivität und hat Erfolg in dieser Isolierungsprotokoll gesehen. Dispase ist ein bakterielles Enzym mit milden proteolytische Spaltaktivität, welche Zellmembran-Aktivität bewahrt und wird in Kombination mit Kollagenase als Sekundärenzym verwendet. </li><li> Zeigen Schleimhautfragmente aus der Maus oder menschlichem Gewebe in 1,7 ml Mikrozentrifugenröhrchen oder 5 ml jeweils erhalten, die HBSS. Mince Gewebe weiterin 2-3 mm große Stücke mit einer Schere mit einem offenen Spitzenbreite, die in ihre Röhrchen passen. Planen Sie ausreichend Zeit, damit für Ösophagus-Schleimhaut-Fragmente an den Boden des Röhrchens sedimentieren. </li><li> Langsam dekantieren HBSS, darauf achten, daß das Gewebe versehentlich zu verwerfen. Ersetzen mit frischem HBSS folgenden durch leichtes Schütteln. Alternativ zu entfernen HBSS mit einer 1 ml Pipette. </li><li> Waschen Gewebe auf diese Weise insgesamt 8 Mal unter leichtem Schütteln in zwischen den Waschgängen so dass genügend Zeit für Speiseröhren Fragmente zwischen jedem Wasch sedimentieren. HINWEIS: Human Tissue mehr benötigen Hacken, dass Neugeborene Mausgewebe. </li></ol></li><li> Inkubieren murinen Gewebe mit 300 U / ml Kollagenase XI und 0,1 mg / ml Dispase für 25 min auf einem Schüttler bei niedriger Geschwindigkeit bei Raumtemperatur eingestellt. <ol><li> Inkubieren menschlichem Gewebe mit 300 U / ml XI Kollagenase und 0,1 mg / ml Dispase für bis zu 6 Stunden, auf einem Schüttler bei niedriger Geschwindigkeit bei Raumtemperatur eingestellt. HINWEIS: Die Verfügbarkeit von menschlichen esophagus variabel ist. Menschen Ösophagusmukosa mit Enzymen für bis zu 6 h führt zu erfolgreichen Generation von Primärkulturen inkubiert. </li></ol></li><li> Nach enzymatische Verdauung, Hackfleisch Gewebe weiter mit Schere und Zentrifuge bei 200 g für 10 min. </li><li> Überstand verwerfen. Übertragen der Pellets, die aus einer gemischten Zellsuspension auf eine 5-ml-Röhrchen und waschen 5mal in Dulbeccos modifiziertem Eagle Medium (DMEM) mit 2% Sorbitol ergänzt um nicht lebensfähige Zellen und Zelltrümmer zu entfernen. </li><li> Samenzellen in 6-Well-Platten und die Kultur in DMEM mit 10% fötalem Rinderserum (FBS), 10 mg / ml Insulin, 10 ug / ml Transferrin, 10 ug / ml Gentamicin und 2 ng / ml epidermaler Wachstumsfaktor (EGF) . Vakuumfilter (0,22 um) Alle Komponenten außer EGF die nach Filtration zugesetzt werden können. Verteilen Zellen aus menschlichen Resektionsproben erhalten unter mehreren Platten mit 6 Vertiefungen, abhängig von der Größe der Resektion. </li><li> Sobald Brunnen sind 80% konfluent, Gang anhaftenden Zellen zu T25-Kolben unsing 0,05% Trypsin / Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA). Neutralisieren mit Medien und Spin bei 400 x g. <ol><li> Bei einem 6 gut Gang zu einem T25-Kolben, Passage-Zellen bei einer 1: 1-Verhältnis. 3-Verhältnis: 2 oder 1: Konfluente T25-Kolben kann zu einem 1 agiert werden. Um den Durchgang von einer T25-Flasche mit einem T75-Kolben, mit einem 1: 1 Verhältnis. Medienwechsel alle 2-3 Tage, unabhängig von dem Behälter. </li><li> Wachsen Zellen bei 37 ºC in einem befeuchteten 5% CO 2 -Inkubator und Kultur in den oben beschriebenen myofibroblast Medien. HINWEIS: Epithelzellen nicht unter diesen Kultur oder Gang Bedingungen zu überleben. Zellen zur Charakterisierung und in den unten beschriebenen Studien verwendet werden, sind zwischen den Passagen 5 und 15. </li><li> Cryo-Erhaltung Zellen in flüssigem N 2 durch Zugabe von 10% Dimethylsulfoxid in die Myofibroblasten Medien. </li></ol></li></ol> 3. Charakterisieren murinen und humanen Ösophagus-Stromazellen <ol><li> Untersuchen Sie die Morphologie der Zellen mit einem inversen Mikroskop. Beachten Sie die spindelförmigeMorphologie der anhaftenden Zellen (Abbildung 1). </li><li> Charakterisierung kultivierten Zellen durch Auswerten der folgenden Zytoskelett-Marker: α-SMA, Vimentin, Desmin und Cytokeratin. Stromazellen mit Myofibroblasten-ähnlichen Phänotyp exprimieren Zytoskelett myofibroblast Marker α-SMA und Vimentin (Abbildung 2). <ol><li> Zur weiteren Unterscheidung kultivierten Stromazellen aus Muskelzellen, für Desmin Immunfärbung. Zur Durchführung des Immunfärbung auf kultivierte Zellen, die Platte 1,5 x 10 4 Zellen in 4-Well-Kammerobjektträgern und wachsen in Myofibroblasten Medien für 24 Stunden. Stromazellen mit Myofibroblasten-ähnlichen Phänotyp wird schwach oder nicht vorhanden Desmin-Expression. Stromalen Zellen fehlt die Expression des epithelialen Marker pan-Cytokeratin (Daten nicht gezeigt). HINWEIS: Bewertung der Kulturen gehört die Bewertung von Zytoskelett Marker durch Immunzytochemie und Zelloberflächenmarker mittels Durchflusszytometrie. Immuncytochemie als primäre Methode zur Charakterisierung als der Ex verwendetpression Profil der Proteine ​​des Zytoskeletts ist einzigartig für den Fibroblasten, Myofibroblasten oder Muskelzelle. Durchflusszytometrie stellt die Reinheit der Kultur durch Auswertung Zelloberflächenexpression von Epithel-, Endothel- und blutbildenden Zellen-Marker. CD90 ist nützlich als Zusatz Verfahren zur Identifizierung von menschlichen Stromazellen, wie es sowohl an menschlichen Fibroblasten und Myofibroblasten ausgedrückt. CD90 ist nicht hilfreich bei der Charakterisierung von murinen Stromazellen, wie es auch von Maus-T-Zellen exprimiert wird. </li></ol></li><li> Nachdem die Zellen erreichen 60% Zusammenfluss gründlich Folien mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und befestigen mit Methanol. Inkubieren Zellen in Methanol für 10 min bei -20 ° C, dann in PBS bei 4 ° C bis zur Verwendung. </li><li> Folgen Sie Standard-Immunfärbung Protokoll. </li><li> Kurz vor dem Aufbringen des primären Antikörpers, blockieren die fixierten Zellen mit 5% goatserum in PBS. Verdünnen Sie primäre und sekundäre Antikörper in 5% Ziegenserum als auch. <ol><li> Für den Nachweis von α-SMA und Vimentin, verwenden Sie dieFolgende Antikörper und Konzentrationen: Mouse mAb zu α-SMA bei 1: 250 Verdünnung und Rabbit pAb zu Vimentin bei 1: 500-Verdünnung. </li><li> Inkubieren mit primärem Antikörper bei Raumtemperatur über Nacht bei 4 ° C, Spülen 3 mal mit PBS und fügen sekundären Antikörper Rhodamin-konjugiertes Ziege-anti-Maus bei einer Verdünnung von 1: 200 und Cy2 konjugierten Ziegen anti Kaninchen bei einer Verdünnung von 1: 1000 für 1 Stunde bei Raumtemperatur. </li><li> Gegenfärbung Kerne mit 4 &#39;, 6-Diamidino-2Phenylindole (DAPI) in einer Konzentration von 1 ug / ml für 1 Minute und dann mit PBS waschen. Analysieren Sie Dias mit einem inversen Mikroskop. </li></ol></li><li> Reinheit der Kulturen durch die Prüfung der murinen und humanen Ösophagus-Zellen, die für blutbildende (CD45) und Endothelzellen (CD31) Zelloberflächenmarker mittels Durchflusszytometrie (Abbildung 3). Charakterisierung menschlicher Zellen durch die Expression von stromalen Zelloberflächenmarker CD90. HINWEIS: CD90 kann nicht verwendet werden, um murine Stromazellen murine T cel identifizierenls drücken auch CD90. <ol><li> Lösen kultivierten Maus Speiseröhren Stromazellen von den Kulturflaschen durch Behandlung mit nicht-enzymatischen Zelldissoziationslösung bei 37 ° C für 10 min, mit FACS-Puffer zweimal gewaschen, gezählt und mit FITC-CD45 und CD31-APC mit relevanten Isotypenkontrollen gefärbten gemäß Standard-Färbeverfahren. </li><li> Sammeln Zellen mittels FACS Calibur und Daten mit FlowJo Software analysieren. Vor dem Färben von Zellen, Antikörper zu optimieren und titriert Konzentrationen mit Isotypkontrollen, normale Maus Milz und Knochenmarkzellen. </li></ol></li></ol>

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<li>Khalil, H., Nie, W., Edwards, R. A., Yoo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+primary+myofibroblasts+from+mouse+and+human+colon+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation of primary myofibroblasts from mouse and human colon tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (80), (2013).</li>
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</ol>

Diese Arbeit wird durch NIH / NCI K08CA153036-01A1 (AS), AGA-General Mills Bell-Institut für Gesundheit und Ernährungsforschung Scholar Award in Gut Physiologie und Gesundheit (AS) und einem Wright Foundation Pilot Award (AS) unterstützt.

Die Techniken zur Primärkultur Generation sind in der Regel ähnlich bei der Verwendung von murinen oder menschlichen Gewebes mit Hacken und Aufschlusszeiten für Gewebegröße angepasst. Unsere Erfahrungen mit murinen Gewebe schlägt vor, dass mit den oben beschriebenen Methoden konsequent in erfolgreiche Etablierung der Primärkulturen führen. Kritische Schritte innerhalb des Protokolls sind die Sterilisation von chirurgischen Geräten und folgenden Norm sterile Techniken der Gewebekultur. Das Alter der Mäuse ist auch ein en...

Epithelial-stromale Wechselwirkungen an der Regulation einer Vielzahl von Gastrointestinaltrakt Funktionen einschließlich Schleimhautregeneration, Reparatur, Fibrose und Karzinogenese 1,2 beteiligt. Diese Wechselwirkungen sind am besten in den Dünndarm und Dickdarm untersucht und kann in ähnlicher Weise eine Rolle bei der Schleimhaut der Speiseröhre Erkrankungen 3. Eine Subpopulation von Darm und Kolon Stromazellen bezeichnet Myofibroblasten wurde gezeigt, dass bei der Vermittlung der Gewebeschädigung, Entzündung teil und Reparatur 4,5. Im distalen Gastrointestinaltrakt werden diese spindelförmige Zellen angrenzend an die Basalmembran an der Grenzfläche zwischen Epithel und Lamina propria und werden als α-SMA und Vimentin positiv definiert, pan-Cytokeratin negativ und schwach positive oder Desmin negativ 5. Die Speiseröhre Stroma wurde nicht konsequent auf zellulärer oder molekularer Ebene charakterisiert. Unsere Arbeit im murinen Speiseröhre demonstrated α-SMA und Vimentin-Zellen in der Speiseröhre Stroma, gelegentlich darunter liegenden zu dem Plattenepithel 6. Epithelial-Stroma-Wechselwirkungen in der Schleimhaut der Speiseröhre Erkrankungen wie Magen- und Speiseröhren vermittelten Verletzung 6 und eosinophile Ösophagitis 3 in Verbindung gebracht. Fibrotischen Strikturen auch eine bekannte Komplikation der Schädigung der Speiseröhre und Stromazellen in der Pathogenese von gastrointestinalen Fibrose in Verbindung gebracht. Isolation dieser Zellen wird dazu beitragen, zu tun, die notwendigen Studien zur gestörten Signalwege zu untersuchen. Diese Vorlage enthält die erforderlichen Primärkulturen von α-SMA positiv, Vimentin positiven Myofibroblasten, dass bestehende Wissenslücken in Bezug auf Signalwege vermitteln, diese Interaktionen angesprochen werden kann etablieren Techniken. Die beschriebene Technik wurde erfolgreich von den Autoren verwendet wird, um primäre murine Colon Myofibroblasten 7 und furthe etablierenr für die Einrichtung von murinen 6 und Menschen Myofibroblasten-ähnlichen Speiseröhren Stromazellen angepasst. Wir beschreiben hier Bedingungen benötigt, um festzustellen und zu charakterisieren diese Kulturen von Maus oder Mensch Ösophagus vor in Zukunft funktionelle Studien verwenden etabliert. Kulturen angebaut und für bis zu 15 Passagen genutzt werden. Isolation und Etablierung von Primärkulturen über die Methoden unten beschrieben erzeugt Stromazellen mit Myofibroblasten Phänotyp; α-SMA, Vimentin positiv und schwach positiv oder negativ für Desmin und Cytokeratin negativ. Dieser Phänotyp unterscheidet sich vom Phänotyp des Ösophagus Fibroblasten, die überwiegend Vimentin ist positiv, α-SMA negativen 3 oder der α-SMA positiv, Vimentin-negativen Phänotyp des Muscularis mucosae 6.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Gewebekulturreagenzien</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H6648</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>GIBCO, Invitrogen</td><td>17105-041</td><td></td></tr><tr><td>Kollagenase XI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9407</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>GIBCO, Invitrogen</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>Sorbit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1876</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F42442</td><td></td></tr><tr><td>Transferrin</td><td>Roche</td><td>10-652-202-001</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin/EDTA</td><td>Corning</td><td>25-052-Cl</td><td></td></tr><tr><td>Epidermaler Wachstumsfaktor</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9644<</td><td></td></tr><tr>td colspan="4">Reagenzien zur Immunfärbung</td></tr> von <tr><td>Ziegenserum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>Maus mAB bis &alpha;-SMA&nbsp;</td><td>abcam</td><td>ab7817</td><td></td></tr><tr><td>Kaninchen pAB zu Vimentin</td><td>abcam</td><td>ab45939</td><td></td></tr><tr><td>Cy2 konjugiertes Kaninchen anti Kaninchen</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>111-225-144</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8417</td><td></td></tr><tr><td>CD31 konjugiert zu eFluor 450</td><td>eBioscience</td><td>48-0319-41</td><td></td></tr><tr><td>CD90 konjugiert zu APC</td><td>eBioscience</td><td>17-0909-41</td><td></td></tr><tr><td>Annexin V und 7AAD</td><td>BD Pharmigen</td><td>559763</td><td></td></tr><tr><td>Maus Fc-Block für CD16/CD32</td><td>BD Pharmigen</td><td>2136662</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Ausstattung</td></tr><tr><td>5 ml Röhrchen</td><td>Eppendorf</td><td>30108310</td><td></td></tr><tr><td>Inverses Mikroskop</td><td>Motic</td><td>AE31</td><td></td></tr><tr><td>Biosicherheitswerkbank und Inkubatoren</td><td>Nuaire</td><td></td><td><a href="http://www.nuaire.com/products/" target="_blank">http://www.nuaire.com/products/</a></td></tr><tr><td>4-Well-Kammer-Objektträger</td><td>Thermo Scientific</td><td>177437</td><td></td></tr><tr><td>Kühlzentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Olympus Vakuum-Filtersystem</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-227</td><td></td></tr><tr><td>Fluoreszenzmikroskop</td><td>Nikon</td><td>Eclipse TE300</td><td></td></tr><tr><td>6-Well-Platten</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>T25 Kolben</td><td>TRP</td><td>90026</td><td></td></tr><tr><td>T75 Kolben</td><td>Corning</td><td>43064</td><td></td></tr><tr><td>Präparierschere</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Präparierzange Sezierzange</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Kendall</td><td>540500</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Software</td></tr><tr><td>Metamorph Software (Molekulare Bauelemente)</td><td>Molekulare Bauelemente</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACSCAlibur</td><td>BD Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACSVerse</td><td>BD Bioscience</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

isolierung von myofibroblasten aus maus und mensch Ösophagus

Isolation of Myofibroblasts from Mouse and Human Esophagus

Murine und menschliche Speiseröhre Myofibroblasten werden über enzymatische Verdauung erzeugt. Neugeborene (8-12 Tage alt) murine Speiseröhre wird geerntet, zerkleinert, gewaschen und bis zur enzymatischen Verdau mit Kollagenase und Dispase für 25 min unterzogen. Menschliche Speiseröhre Resektionsproben aus Muscularis propria und Adventitia befreit und der verbleibende Schleimhaut zerkleinert und einem enzymatischen Verdau mit Kollagenase und Dispase für 6 h unterzogen. Kultivierte Zellen exprimieren α-SMA und Vimentin und Desmin ausdrückliche schwach oder gar nicht. Die Kulturbedingungen sind nicht förderlich für das Wachstum von Epithelzellen, hämatopoietische oder Endothelzellen. Kultur Reinheit wird durch durchflusszytometrische Beurteilung der Zelloberflächenmarker Expression potentieller Gefährdungs ​​hämatopoetischen und Endothelzellen bestätigt. Das beschriebene Verfahren ist einfach und führt zu einer konsistenten Erzeugung nicht hematopoieitc nicht endothelial Stromazellen. Einschränkungen dieser Technik sind inhärent auf die Verwendung vonPrimärkulturen in der Molekularbiologie Studien, dh die unvermeidlichen Schwankungen zwischen den Kulturen in den verschiedenen Mäusen oder Menschen fest gestoßen. Primäre Kulturen sind jedoch ein repräsentativer Reflexion des in vivo-Zustand im Vergleich zu Zelllinien. Diese Verfahren stellen auch Forscher die Fähigkeit zur Isolierung und Kultur Stromazellen aus verschiedenen klinischen und experimentellen Bedingungen, so dass Vergleiche zwischen den Gruppen. Dadurch gekennzeichnet Speiseröhren Stromazellen können auch in funktionalen Studien, die epithelial-stromale Wechselwirkungen in Erkrankungen der Speiseröhre verwendet werden.

Ösophagus-Stroma-Zellen isoliert durch mechanische und enzymatische Verdauung werden zunächst vernickelt und in 6-Well-Platten kultiviert. Untersuchung von Zellen mit einem inversen Mikroskop innerhalb von Stunden nach Plattierung zeigt eine gemischte Zellsuspension lose anhaftenden zum Plattenboden (1A). Im Laufe der nächsten 24 Stunden, sind spindelförmige Zellen, fest haft an den Plattenboden beobachtet Aufnahmen aus der gemischten Zellsuspension (1B) .Diese sprießen Zellen auf das g...

Wir präsentieren ein Protokoll zur Erzeugung von Primärkulturen von murinen und humanen ösophagealen Stromazellen mit einem Myofibroblasten-Phänotyp. Kultivierte Zellen haben eine spindelförmige Morphologie, exprimieren α-SMA und Vimentin und es fehlen epitheliale, hämatopoetische und endotheliale Zelloberflächenmarker. Charakterisierte Stromazellen können in funktionellen Studien zu epithelial-stromalen Wechselwirkungen verwendet werden.

Isolierung von Myofibroblasten aus Maus und Mensch Ösophagus

Murine and human esophageal myofibroblasts are generated via enzymatic digestion. Neonate (8-12 day old) murine esophagus is harvested, minced, washed, ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, primäre Myofibroblasten aus der Speiseröhre von Maus und Mensch zu isolieren. Dies wird erreicht, indem zunächst die gesamte Speiseröhre der Spender-Neugeborenenmaus mit menschlichem Gewebe entnommen wird. Die Schleimhaut wird von der Muscularis propria getrennt.Der zweite Schritt besteht darin, das Tuch zu zerkleinern und mehrmals in HBSS zu waschen. Als nächstes wird das Gewebe mit Kollagenase-Diss verdaut und weiter zerkleinert, wobei die mesenchymalen Zellen zusammen mit dem angehängten Epithel freigesetzt werden. Die heterogene Zellpopulation wird dann in Myofibroblastenmedien kultiviert, in denen Myofibroblasten haften, während Epithelzellen nicht überleben und weggespült werden.Letztendlich werden Immunchemie und Durchflusszytometrie verwendet, um zu bestätigen, dass es sich bei den Zellen in der Primärkultur um Myofibroblasten handelt. Die Verfahren werden von mir, Matthew Gargas, einem Techniker, und Tori, einer Postdoc aus meinem Labor, vorgeführt. Nachdem Sie eine acht bis 12 Tage alte Maus eingeschläfert haben, fixieren Sie die Rückenseite des Tieres und befeuchten Sie die Bauchfläche mit 70% Ethanol.Fassen Sie dann mit einer Pinzette die Haut vor der Harnröhrenöffnung und heben Sie sie an. Schneiden Sie entlang der ventralen Mittellinie von der Harnröhrenöffnung bis zum Kinn. Schneiden Sie nur die Haut ein.Machen Sie dann Schnitte von der Harnröhrenöffnung bis zu den Knien, so dass ein auf dem Kopf stehendes Y entsteht. Nach den Schnitten zu den Knien machen Sie Schnitte auf beiden Seiten des Brustkorbs. Nachdem Sie die Schnitte vorgenommen haben, schälen Sie die Haut vorsichtig ab und legen Sie sie beiseite. Heben Sie nun das Bauchfell an und durchtrennen Sie es bis zum Zwerchfell und Brustkorb.Halten Sie die Schere nach oben gerichtet, um Schäden am intrathorakalen und abdominalen Inhalt zu vermeiden. Heben Sie dann vorsichtig den linken Leberlappen an, um den darunter liegenden Magen, den Magenübergang der Speiseröhre und den abdominalen Teil der Speiseröhre mit einer chirurgischen Schere freizulegen, die entlang der Mittellinie des Brustbeins und des Brustkorbs bis zum Halsgürtel geschnitten ist. Wieder. Halten Sie dabei die Schere abgewinkelt von den darunter liegenden Organen entfernt.Ziehen Sie dann den Brustkorb zur Seite, um den Inhalt der Brusthöhle freizulegen. Entferne nun vorsichtig das Herz und beide Lungenlappen. Verwenden Sie bei Bedarf Baumwollapplikatoren, um die Blutung zu absorbieren.Der thorakale Ösophagus ist ein schmaler, flexibler Schlauch hinter der Luftröhre und vor dem Brustwirbel. Bei Neugeborenen finden Sie den Magenübergang der Speiseröhre, um die Speiseröhre vom Magen aus zu identifizieren. Präparieren Sie stumpf das die Speiseröhre umgebende Gefäßsystem, einschließlich Fett und Mesenteriengewebe, bis zum Ösophagusursprung an der Gebärmutterhalshöhle.Sezieren Sie nun die Speiseröhre in voller Länge und überführen Sie sie auf Wunsch in gekühltes HBSS. Entfernen Sie auch einen Teil des Magens zur Orientierung. Beginnen Sie dieses Protokoll, indem Sie Schleimhautfragmente, die aus Maus- oder menschlichem Gewebe in HBSS gewonnen wurden, in einem 1,7-Milliliter-Mikrofuge-Röhrchen bzw. einem Fünf-Milliliter-Röhrchen zerkleinern.Bei der Gewinnung menschlicher Stromazellen der Speiseröhre ist es wichtig, die Schleimhaut durch scharfe Dissektion von der darunter liegenden Muscularis propria zu trennen. Nun wird das Gewebe in der Tube mit einer feinen Schere weiter in zwei bis drei Millimeter große Stücke geprägt. Nachdem das Sediment des Schleimhautfragments der Speiseröhre langsam dekantiert wurde, dekantieren Sie das HBSS und achten Sie darauf, das Gewebe nicht versehentlich zu verwerfen.Sie können auch eine Pipette mit großer Spitze verwenden, um zusätzliches HBSS zu entfernen. Dann frisches HBSS hinzufügen. Mischen Sie die Tube mit einem sanften Schütteln und lassen Sie das Gewebe absetzen.Sobald es sich gesetzt hat, dekantieren Sie das HBSS erneut und wiederholen Sie diese Wäsche. Treten Sie insgesamt acht Mal auf. Nach den acht Wäschen inkubieren Sie das Gewebe mit Kollagenase 11 und diss das murine Gewebe bis zu 25 Minuten lang auf einem Schaukelschüttler, der auf langsame Geschwindigkeit und Raumtemperatur eingestellt ist.Unter den gleichen Bedingungen wird menschliches Gewebe sechs Stunden lang inkubiert. Nach der Verdauung das Gewebe mit einer feinen Schere noch weiter durchmischen und dann das Gewebe bei 200 g 10 Minuten zentrifugieren. Entsorgen Sie den Überstand und dekantieren Sie das pelletierte Gewebe in ein sauberes 1,7-Milliliter-Röhrchen.Waschen Sie die Zellen dann unter der Gewebekulturhaube fünfmal in DMEM mit 2 % Sorbit, um die nicht lebensfähigen Zellen und andere Ablagerungen zu entfernen. Lassen Sie die Zellen bei jedem Waschen durch die Schwerkraft absetzen und dekantieren Sie die Waschlösung. Nach dem Waschen säen Sie die Zellen in drei Vertiefungen von sechs aus.Gut plattieren und kultivieren Sie sie in vakuumfiltriertem, zugesetztem DMEM. Menschliches Gewebe kann je nach Größe der Probenkultur der Zellen mehr Vertiefungen oder Platten benötigen, bis die Vertiefungen zu 80 % konfluent sind. Geben Sie dann zuerst die Adhärenzzellen in T-25-Kolben und verwenden Sie 0,05 % Trypsin in EDTA, um die Zellen zu entfernen.Fügen Sie dann Medien hinzu, um die Reaktion zu neutralisieren. Sammeln Sie die gelösten Zellen in einem Zentrifugenröhrchen. Dann drehen Sie die Zellen bei 400 G, um sie unter einem Mikroskop zu sammeln.Beobachten Sie die spindelförmige Morphologie der adhärenten Zellen, um die kultivierten Stromazellen von Muskelzellen zu unterscheiden, und färben Sie sie für Desmond immun. Unter Verwendung eines Standardprotokolls werden 15.000 Zellen kurz in vier Vertiefungskammern gefüllt und 24 Stunden lang in Myofibroblastenmedien gezüchtet. Am nächsten Tag fixieren Sie die Zellen und blockieren Sie dann vor dem Auftragen des primären Antikörpers die fixierten Zellen mit 5%Ziegenserum in PBS, sowohl primäre als auch sekundäre Antikörper sollten ebenfalls in 5%Ziegenserum verdünnt werden.Inkubieren Sie mit dem Primärantikörper bei Raumtemperatur oder über Nacht bei vier Grad Celsius. Spülen Sie die Zellen dann nach den Wäschen dreimal mit PBS. Fügen Sie die sekundären Antikörper hinzu und inkubieren Sie die Zellen eine Stunde lang.Bei Raumtemperatur verwenden Sie drei Waschgänge in PBS, um die Sekundärantikörper zu entfernen. Anschließend können die gefärbten Zellen nach den Waschvorgängen analysiert werden. Tragen Sie DPI mit Eindeckmedium und Deckglas auf, um die Reinheit der Speiseröhrenzellen festzustellen.Überprüfen Sie sie auf hämatopoetische und endotheliale Zelloberflächenmarker. Mit Hilfe der Durchflusszytometrie. Züchten Sie eine ausreichende Anzahl in Kulturflaschen, bis sie zum Sammeln bereit sind.Trennen Sie dann die kultivierten Maus-Ösophagusstromazellen mit einer nicht-enzymatischen Zelldissoziationslösung bei 37 Grad Celsius für 10 Minuten. Im Anschluss an ihre Sammlung. Waschen Sie die Zellen zweimal mit Faxpuffer und zählen Sie die Zellen.Färben Sie nun mit einem Standardfärbeverfahren mit CD 45, um Immunzellen zu identifizieren, und färben Sie mit CD 31, um Endothelzellen zu identifizieren, und lassen Sie die Zellen dann durch das Durchflusszytometer laufen. Stromazellen der Speiseröhre wurden durch mechanischen und enzymatischen Verdau isoliert und innerhalb weniger Stunden nach der Beschichtung in sechs Well-Platten kultiviert. Die Zellen befanden sich in einer gemischten Suspension, die lose an der Platte haftete.In den nächsten 24 Stunden keimten spindelförmige Zellen aus der Zellsuspension und hafteten fest am Plattenboden. Diese Zellen bedeckten innerhalb von fünf Tagen die gesamte Vertiefung und behielten ihre Morphologie für mindestens 15 Passagen erfolgreich bei. Dies sind die spindelförmigen Zellen in der Nähe der Kofluenz, Immunfärbung von Primärkulturen von ösophagealen Stromazellen.In Kammerobjektträgern gezüchtete Objektträger zeigten eine reichliche Expression von Myofibroblasten-Zytoskelettmarkern. Die Reinheit der Alpha-, SMA- und Menton-Kultur wurde mittels Durchflusszytometrie bewertet. Für primäre murn-Ösophagusstromazellen wurde eine Vorwärts- und Seitenstreuung etabliert, gefolgt von einem Gating und einer Analyse lebender Zellen auf Zelloberflächenproteine.Primären murn-Ösophagusstromazellen fehlte die Expression von hämatopoetischem CD 45 und die Expression von endothelialen CD 31-Zelloberflächenmarkern. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Primärkulturen von Myofibroblasten aus der Speiseröhre von Mäusen und Menschen etabliert. Ja.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dieses Video zeigt die Isolierung einzelner Myofasern aus entnommenem Maus-Musculus Extensor Digitorum Longus (EDL). Die isolierten Myofasern können kultiviert werden, um die Aktivität von Myofaser-assoziierten Muskelstammzellen zu untersuchen.

Myofaserisolierung: Eine Technik zur Gewinnung einzelner Myofasern aus entnommenen Mausmuskeln Extensor Digitorum longus (EDL)

Isolierung und Kultivierung von Muskelfasern ist der...

Isolation und Kultur der einzelnen Muskelfasern und ihre Satelliten aus adulten Skelettmuskel

Die Myofibroblasten ist ein einfluss Stromazellen des Magen-Darm-Trakt, die wichtige physiologische Prozesse in normalen und Krankheitszustände regelt. Wir beschreiben eine Technik, die für die Isolierung von primären Myofibroblasten aus Maus und menschlichen Dickdarmgewebe, das für die in vitro Experimente verwendet werden können, ermöglicht.

Isolierung von Primär Myofibroblasten aus Maus und Mensch Colon Tissue

Diese Handschrift beschreibt die Herstellung, Charakterisierung und Anwendungsmöglichkeiten eines mittels Tissue Engineering 3D-Ösophagus-Konstrukt von normalen primären humanen Ösophagus-Fibroblasten und Plattenepithelzellen in einem de-cellularized Schweine Gerüst ausgesät vorbereitet. Die Ergebnisse zeigen die Bildung eines reifen geschichteten Epithel ähnlich dem normalen menschlichen Speiseröhre.

Herstellung, Charakterisierung und Einsatzmöglichkeiten von 3D-Tissue-Engineering Menschen Ösophagus-Schleimhaut-Modell

Hier wird ein Protokoll zur Isolierung und Etablierung von primären Fibroblasten/Myofibroblasten (MF)-Kulturen aus gefrorenen Magen-, kleinen Darm- und Dickdarmgewebe-liefernden Zellen mit einem MF-Phänotyp vorgestellt. Diese Zellen exprimieren CD90, α-SMA und Vimentin. MFs können für eine Vielzahl von funktionellen Assays verwendet werden, einschließlich enzymatischer Aktivität und Zytokinproduktion.

Isolierung von CD 90+ Fibroblasten / Myofibroblasten von Human Gefrorene Magen-Darm-Proben

Die Gewinnung einer reinen Population von Fibroblasten ist entscheidend für die Untersuchung ihrer Rolle bei der Wundreparatur und Fibrose. Beschrieben ist eine detaillierte Methode, um Fibroblasten und Myofibroblasten von unverletzten und verletzten Mausherzen zu isolieren, gefolgt von der Charakterisierung ihrer Reinheit und Funktionalität durch Immunfluoreszenz, RTPCR, Fluoreszenz-unterstützte Zellsortierung und Kollagen-Gel-Kontraktion.

Isolierung und Charakterisierung von adulten Herz-Fibroblasten und Myofibroblasten

Dieses Protokoll veranschaulicht 1) die Isolierung und Kultivierung von primären Fibroblasten aus dem adulten Musculus gastrocnemius der Maus sowie 2) die Aufreinigung und Charakterisierung von Exosomen unter Verwendung einer differentiellen Ultrazentrifugationsmethode in Kombination mit Saccharosedichtegradienten gefolgt von Western-Blot-Analysen.

Isolierung und Charakterisierung von Exosomen aus Skelettmuskelfibroblasten

Hier schlagen wir eine Methode vor, um einzelne Muskelfasern in frühen postnatalen Entwicklungsstadien aus dem homozygoten Mutanten Lamin-Mausmodell, einem sehr schweren Modell für Emery-Dreifuss-Muskeldystrophie (EDMD), effizient zu erhalten.

Single Myofiber Isolation and Culture from a Murine Model of Emery-Dreifuss Muscular Dystrophy in Early Post-Natal Development

Hier stellen wir ein Protokoll zur Isolierung des murinen intestinalen Mesenchyms, einschließlich Telozyten, vor. Diese können für verschiedene Anwendungen verwendet werden, z. B. für die Kokultur mit Organoiden aus der Maus oder vom Menschen, um das Wachstum zu unterstützen und die Situation im ursprünglichen Gewebe besser widerzuspiegeln.

Isolierung des murinen intestinalen Mesenchyms, was zu einer hohen Ausbeute an Telozyten führt

Organoid-Fibroblasten-Kokulturen bieten ein Modell zur Untersuchung der In-vivo-Stammzellnische . In dieser Arbeit wird ein Protokoll für ösophageale Organoid-Fibroblasten-Kokulturen beschrieben. Zusätzlich wird die Whole-Mount-Bildgebung verwendet, um die Fibroblasten-Organoid-Interaktion sichtbar zu machen.

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Hier wird ein Protokoll für die Kultivierung von humanen Ösophagus-Organoiden und Luft-Flüssig-Grenzflächenkulturen bereitgestellt. Die Luft-Flüssig-Grenzflächenkultur von Ösophagus-Organoiden kann verwendet werden, um den Einfluss von Zytokinen auf die Epithelbarriere der Speiseröhre zu untersuchen.

Dreidimensionale Zellkulturmodelle zur Untersuchung der Epithelbarriere bei eosinophiler Ösophagitis 

Erfahren Sie die Isolierung primärer Myofibroblasten aus dem Ösophagus von Maus und Mensch mittels Kollagenas-Verdauung. Diese Methode ermöglicht funktionelle Studien epithelial-stromaler Interaktionen.

Isolierung von Myofibroblasten aus Maus und Mensch Ösophagus

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