Automatisierte Messung von Lungenemphysem und Klein Airway Remodeling im Zigarettenrauch ausgesetzten Mäuse

Ziel dieses Verfahrens ist es, COPD, wie chronische Lungenerkrankungen in der Lunge von Mäusen, die Zigarettenrauch ausgesetzt sind, zu quantifizieren. Dazu werden die Mäuse zunächst sechs Monate lang Zigarettenrauch oder Luft ausgesetzt. Als nächstes wird die Lungenfunktionsprüfung an den Mäusen mit einem Nagetierbeatmungsgerät durchgeführt.

Dann wird die Lunge auf einen festen Druck aufgeblasen, entfernt und in 10%igem Formalin fixiert. Schließlich wird mehr Informationssoftware verwendet, um die Luftraumgröße an kiemengefärbten Lungenabschnitten und der extrazellulären Matrix der kleinen Atemwege, der Dicke der Proteinschicht oder von Masons Trichomen gefärbten Lungenabschnitten zu messen. Letztendlich wird die Messung der Luftraumvergrößerung in der Lunge von Mäusen, die dem Zigarettenrauch ausgesetzt waren, auf standardisierte, unvoreingenommene und automatisierte Weise durchgeführt.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie z. B. der Messung des mittleren linearen Abfangs oder des destruktiven Index, besteht darin, dass dieses Protokoll weniger zeitaufwändig durchzuführen ist, weniger anfällig für Beobachterverzerrungen ist und die heterogene Natur der Pathologie bei Mäusen effektiver erfasst, da es die Krankheit in ganzen LOBs und/oder beiden Lungen analysieren kann. Nachdem Sie die Mäuse Zigarettenrauch ausgesetzt und sie gemäß dem Textprotokoll betäubt haben, rasieren Sie die Haut vor der Luftröhre und verwenden Sie eine Lösung auf Jodbasis, gefolgt von Ethanol, um den Bereich mit einer Schere zu desinfizieren. Machen Sie einen Schnitt in der Mittellinie durch die Haut und das Unterhautgewebe vor der Luftröhre und verwenden Sie eine Pinzette, um die Sterno-Schilddrüsenmuskulatur zu trennen.

Um die Luftröhre freizulegen, führen Sie eine zwei Zoll lange Seidennaht hinter der Luftröhre durch und induzieren Sie eine Trachealschere, um eine Tracheotomie an der vorderen Seite der Luftröhre durchzuführen. Führen Sie dann eine 18-Gauge-Kanüle in die Tracheotomie ein. Induzieren Sie die Naht, um sie über die Trachealkanüle an Ort und Stelle zu halten.

Verbinden Sie die Maus mit dem Y-Schlauch des Adapters des Beatmungsgeräts und initiieren Sie die mechanische Beatmung mit einem Atemzugvolumen von 10 Millilitern pro Kilogramm und einer Atemfrequenz von 150 Atemzügen pro Minute. Als nächstes blasen Sie die Lunge auf eine Gesamtlungenkapazität oder TLC von dreimal pro Volumenverlauf auf. Um die inspiratorische Kapazität oder ic zu messen und die Ektase der Lunge zu reduzieren, führen Sie eine einfrequente erzwungene Oszillation durch, manövrieren und beurteilen Sie den dynamischen Widerstand, RRS, Elastin ERS und Compliance CRS des Atmungssystems.

Führen Sie dann eine Breitbandfrequenz, eine erzwungene Oszillation durch, manövrieren Sie und messen Sie den zentralen Atemwegswiderstand, den RN-Gewebewiderstand, das G-Gewebe, das Elastin H und das Verhältnis G über H. Zeichnen Sie schließlich die quasi-statische Nachgiebigkeit CST während der Volumendruckströmungsmanöver auf. Wiederholen Sie jedes dieser Manöver fünfmal, bis konsistente Messwerte erzielt werden. Aufblasen auf TL C3 mal zwischen jedem wiederholten Satz.

Notieren Sie den Mittelwert für jeden Parameter für jede Maus. Nehmen Sie die Maus aus dem Beatmungsgerät und nachdem Sie sie gemäß dem Textprotokoll eingeschläfert haben. Schneiden Sie das Zwerchfell durch, öffnen Sie den Thorax in der Mittellinie und entfernen Sie die vorderen Rippen, um die Lunge freizulegen.

Präparieren Sie die Haut und das Unterhautgewebe um die Luftröhre herum und führen Sie zwei zwei Zoll lange Seidennähte hinter der Luftröhre durch. Sobald die Lungeninflation durch eine bronchoalveoläre Lavage quantifiziert wurde und die Luft aus dem Verabreichungsset für die Lungeninflation gespült wurde, verbinden Sie das intravenöse Verabreichungsset mit der Trachealkanüle. Öffnen Sie das Ventil und lassen Sie PBS durch die Schwerkraft in die Lunge fließen, bis sich die Lunge vollständig aufgebläht hat.

Machen Sie einen Knoten mit der Naht distal der Trachealkanüle. Heben Sie die Luftröhre mit einer Pinzette an und schneiden Sie sie proximal zum Knoten. Anschließend wird das Bindegewebe hinter der Luftröhre und der Lunge präpariert.

Entfernen Sie vorsichtig die Lungen und legen Sie sie in ein Röhrchen mit 10% Kochsalzlösung. Gepufferte Formel in. Fixieren Sie die Lunge über Nacht bei Raumtemperatur, bevor Sie sie zweimal mit PBS waschen.

Betten Sie die Lunge in Paraffin ein und schneiden Sie fünf Mikrospuren dicke Abschnitte. Verwenden Sie dann Kiemenfleck, um die Abschnitte zu färben, und stellen Sie sie wie im Textprotokoll beschrieben dar. Um Bilder für die Scion-Bildanalyse vorzubereiten, starten Sie das Scion-Bild und laden Sie die Makros, wie im ergänzenden Teil des Textprotokolls angegeben, wählen Sie das offene Hellfeldbild ein Makro aus, um eine TIFF-Datei auszuwählen, und öffnen Sie sie.

Verwenden Sie Bildbearbeitungswerkzeuge, um das Bild vorzubereiten. Wählen Sie für die Analyse die Pinselfarbe aus, indem Sie am unteren Rand des LUT-Fensters auf Schwarz oder Weiß klicken. Klicken Sie dann auf das Pinselwerkzeug, um die Pinselgröße zu ändern.

Doppelklicken Sie auf das Pinselwerkzeug und geben Sie eine entsprechende Pinselgröße ein. Verwenden Sie das Pinselwerkzeug, um Bereiche, die keine Lufträume oder Alveolarwände sind, als Luftraum oder Gewebe zu behandeln, indem Sie Bronchien und Gefäße schwarz malen, damit sie als Gewebe analysiert werden. Um die mittlere Kabellänge des Luftraums zu messen, wählen Sie die Makrokabellänge air two aus.

In diesem Schritt wird das Graustufenbild in ein Binärbild konvertiert, das nur einen Schwellenwert für schwarze oder weiße Pixel aufweist. Das Binärbild, indem Sie in die Nähe der Bildmitte klicken und die Maus nach oben oder unten ziehen. Um den Schwellenwert anzupassen, klicken Sie ein zweites Mal mit der Maus, um den Wert zu übernehmen.

Passen Sie den Schwellenwert an, um die Dicke der Alveolarwände auf die gleiche Dicke wie in den Originalbildern zu bringen. Es ist entscheidend, den Schwellenwert nicht zu unterschreiten und dadurch Brüche in den Alveolarwänden zu erzeugen, die im Originalbild nicht vorhanden sind, was zu künstlich hohen Stranglängenwerten führt. Beobachten Sie ein Fenster, in dem Sie aufgefordert werden, den Schwellenwert des Binärbilds erneut festzulegen, und setzen Sie das Makro bis zum Schwellenwert fort oder brechen Sie es ab.

Beantworten Sie erneut die Eingabeaufforderung mit dem Grund und wählen Sie die Schaltfläche OK aus. Beobachten Sie das durch Makros generierte horizontale und vertikale Rasterfenster mit Linien im Abstand von fünf Pixeln. Das Programm misst die Länge der horizontalen vertikalen Linien, die den Luftraum überlappen.

Speichern Sie die Datei in einem beliebigen Ordner unter dem Standardnamen. Dazu gehört ein Dateiformat, an das C LA TXT für die Länge des Luftraumkabels angehängt wird. Auf diese Weise können Excel-Berichtsmakros die Datei finden.

Um die Berichte zu analysieren, öffnen Sie den X Excel-Bericht TWENTYX XLS. Wählen Sie das Multi-Makro CL m, um Messungen der Alveolarschnurlänge für mehrere Ordner zu melden, die Bildern von mehreren Mäusen aus dem Dateifenster entsprechen. Wählen Sie jeweils einen Ordner aus, indem Sie den Ordner markieren und dann OK auswählen.

Beachten Sie bei der Auswahl jedes Ordners das entsprechende Arbeitsblatt, in dem Statistiken für jede CL-txt-Datei angezeigt werden. Gefolgt von Statistiken für Kabellängendaten, die aus allen Dateien kombiniert wurden, öffnen Sie die Datei alle CL, um Daten aus allen Arbeitsblättern anzuzeigen. Benennen Sie abschließend die Tabelle um und speichern Sie sie.

Der Standarddateiname ist der Name des übergeordneten Ordners, an den c xls angehängt ist. Hier ist ein Ausschnitt aus einer gut aufgeblähten Lunge zu sehen. Die Makrophagen in den Alveolarräumen sind weiß und die Gefäße und Bronchien sind schwarz gefärbt.

Als nächstes wird das Bild in ein binäres Bild konvertiert, das unter Verwendung des Originalbildes einem Schwellenwert unterzogen und dann so invertiert wird, dass alle Pixel im Alveolenraum schwarz sind und oder Pixel in den Bereichen der Lunge, die keine Alveolen sind, weiß sind. In diesen Abbildungen sind die vertikalen und horizontalen Alveolarstranglängen dargestellt, die das Software-Makro generiert. Dieses Experiment zeigt, dass C 57 schwarze sechs Wildtyp-Mäuse, die Rauch ausgesetzt waren, eine 23%ige Zunahme des alveolären Luftraums im Vergleich zu alters- und geschlechtsangepassten Wildtyp-Mäusen aufweisen, die der Luft ausgesetzt waren.

Lungenfunktionstests zeigen geringfügige Linksverschiebungen in den Druckvolumenschleifen, die einen moderaten Verlust des elastischen Rückstoßes der Lunge widerspiegeln, was mit dem milden Emphysem übereinstimmt, das sich bei C 37 Black sechs Wildtyp-Mäusen entwickelt, die Zigarettenrauch ausgesetzt sind. Die hier gezeigten sechs Monate sind Bilder von Massen Tri Chrom gefärbten Lungenabschnitten von C 57 schwarz sechs Wildtyp-Mäusen, die sechs Monate lang Luft oder Zigarettenrauch ausgesetzt waren, was eine Zunahme der extrazellulären Matrix-Proteinablagerung um kleine Atemwege in der Zigarette zeigt, Rauch exponierte Tiere Während dieses Verfahrens versuchte. Es ist wichtig, daran zu denken, dass man sich die Lunge nicht einkerbt, wenn man sie nach der Entwicklung aus dem Brustkorb der Mäuse entfernt.

Diese Technik ebnete den Weg für die Suche im Bereich der Lungenerkrankungen, um Signalwege zu erforschen, die zur Pathogenese der chronischen proobstruktiven Lungenerkrankungen bei Mäusen beitragen, und die Wirksamkeit neuartiger Therapien unserer COPD in einem präklinischen Modellsystem zu bewerten.