Ganze Berge Kennzeichnung von Cilia im Hauptriechsystem der Mäuse

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine Methode zur Visualisierung von Ziliarproteinen im olfaktorischen System von Mäusen im Gesicht bereitzustellen. Dazu wird zunächst ein Urinschädel parallel zur Nahtlinie gespalten. Der zweite Schritt besteht darin, das Riechepithel, das die Nasenscheidewand bedeckt, vorsichtig freizulegen.

Als nächstes wird das olfaktorische Epithel von allen Verbindungen zum Kopf isoliert und auf einen selbstklebenden Glasobjektträger übertragen. Der letzte Schritt ist eine kurze Fixierung und schonende Behandlung während der Färbung des Gewebes. Letztendlich wird die Immunfluoreszenzmikroskopie eingesetzt, um die Proteinlokalisierung in der Riechklia nachzuweisen.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie Kryo-Schnitten ist die schnelle Vorbereitung. Geben Sie zusätzliche Details an, wenn Sie Proteine in der Celia von olfaktorischen sensorischen Neuronen analysieren. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Präparierschritte schwer zu erlernen sind, da die Ziliarstrukturen leicht beschädigt werden können, was zu inkonsistenten Ergebnissen führt.

Beginnen Sie mit dem frisch geköpften Mauskopf. Beginnen Sie die Dissektion, indem Sie die Haut entfernen, um den Schädel und die Nase mit dem Papiertuch freizulegen. Wischen Sie restliches Blut und Gewebe ab.

Dann präparieren Sie den Unterkiefer und die Frontzähne daneben, um das Septum vom Oberkiefer in der Größe zu trennen, den Rückenknochen beidseitig, ein bis zwei Millimeter parallel zur Nahtlinie. Spalten Sie dann mit einem einzigen Schnitt die Nase, ohne das Septum zu berühren. Entfernen Sie vorsichtig alle Knochenreste und Enden, wodurch das Septum freigelegt wird.

Entfernen Sie nun das Nasenbein mit der gebogenen Spitze der Pinzette und führen Sie die Spitze zwischen Epithel und Nasenbein ein. Üben Sie einen leichten Druck auf den Knochen aus und heben Sie ihn an, um den Knochen zu entfernen und Zugang zum Septum aus beiden Hohlräumen zu erhalten. Entfernen Sie vorsichtig den restlichen Oberkiefer.

Ist das Tier älter als P 28, muss nun auch die Spitze des Stirnknochens, die die Riechkolben bedeckt, entfernt werden. Das olfaktorische Epithel hat eine gelbe Farbe, während das angrenzende Atemwegsepithel weiß ist und auf ihm ist die Bewegung von Celia zu sehen, die mit einer feinen Federschere entlang der Grenze zwischen diesen Epithelen geschnitten wurde. Verlängern Sie dann den Schnitt, um das Septum von der ventralen Verbindung zum Vulnerknochen zu trennen.

Schneiden Sie dann entlang der Grenze zwischen dem Septum und der Lamina cosa des Seth. Beginnen Sie damit, einen selbstklebenden Glasobjektträger auf den Rand einer Petrischale zu legen, die mit Ringerlösung gefüllt ist. Tauchen Sie die Hälfte des Objektträgers mit den Zinken der Pinzette ein.

Den Siebbeinknochen mit dem Riechepithel vorsichtig in die Schale übertragen. Verwenden Sie nicht die Pinzettenspitzen. Fassen Sie nun mit einer Pinzette die senkrechte Platte des Siebbeinknochens.

Mit der zweiten Pinzette. Ziehe das Epithel vorsichtig von einer Seite des Septums ab, indem du die Spitze zwischen die Platte und das Epithel schiebst und abhebst. Das Epithel sollte mit der Ziliarseite nach oben positioniert bleiben, falls das Epithel umklappt und sich aufrollt.

Identifizieren Sie die Ziliarseite, indem Sie die Form des Abrollgewebes vergleichen. Mit diesem, ohne die Ziliarseite zu berühren. Greife das Epithel am Rand und ziehe es auf den Glasschieber.

Drehen Sie nun das Septum und schälen Sie das Epithel von der anderen Seite ab. Sobald sich beide Epithelstücke auf dem Objektträger befinden, nehmen Sie den Objektträger aus der Schale. Saugen Sie dann mit einem Papiertuch die Lösung, die das Taschentuch umgibt, ab.

Nach dem Trocknen zeichnest du mit einem Flüssigblocker einen Kreis um das Taschentuch. Tragen Sie nun 150 Mikroliter Fixiermittel indirekt auf das Gewebe auf und warten Sie 10 Minuten. Diese kurze Zeit wird Cecilia fixieren und für eine Vielzahl von Antikörpern wirken.

Das gesamte Epithel wird jedoch nicht fixiert, so dass es kurz nach der Färbung abgebildet werden muss. Nach 10 Minuten Fixierung die fixierte Lösung vorsichtig absaugen, ohne das Gewebe durch unnötige mechanische Kräfte zu stören. Waschen Sie das Taschentuch zweimal mit PBS.

Tragen Sie die Lösungen niemals direkt auf die empfindliche Klia auf. Tragen Sie dann den Blockierungspuffer auf und lassen Sie das Gewebe eine Stunde lang bei Raumtemperatur inkubieren. In der Zwischenzeit wird der Primärantikörper in einem Blockierungspuffer in der entsprechenden Konzentration aufgelöst und fünf Minuten lang zentrifugiert, um alle Ausfällungen zu entfernen. Nach der Blockierung tragen Sie die Primärantikörperverdünnung auf das Epithel auf und legen Sie den Objektträger in eine befeuchtete Box.

Setzen Sie die Box auf vier Grad um und lassen Sie sie über Nacht inkubieren. Am nächsten Tag. Verwenden Sie drei fünfminütige Waschungen mit PBS, um den überschüssigen Primärantikörper zu entfernen.

Tragen Sie dann den Sekundärantikörper auf, der wie der Primärantikörper vorbereitet ist. Lassen Sie das Gewebe eine Stunde lang bei Raumtemperatur inkubieren. Nun sollte es nach einer Stunde immer im Dunkeln bleiben.

Verwenden Sie drei Waschgänge mit PBS, um die überschüssigen Antikörper zu entfernen. Entferne nun den Kreis aus Flüssigblocker mit einer Rasierklinge oder einem Papiertuch. Waschen Sie das Epithel ein letztes Mal fünf Sekunden lang mit destilliertem Wasser.

Montieren Sie dann das Gewebe in ein Anti-Fade-Einbettreagenz und visualisieren Sie es so schnell wie möglich. Unter Verwendung der beschriebenen Gesichtspräparation des olfaktorischen Epithels wurde die Ausprägung von Kiel zwei, einem Molekül, das nachweislich eine Rolle bei der Axonführung im olfaktorischen System spielt, eindeutig untersucht, dass Kiel zwei zur Celia lokalisiert ist. In einer Untergruppe von sensorischen Neuronen in Kryoschnitten desselben Gewebes war die Lokalisation von Kyl zwei schwer zu erkennen.

Ein weiteres Protein wurde dann untersucht: der Geruchsrezeptor M-O-R-E-G, von dem bekannt ist, dass er eine starke ziliäre Lokalisation aufweist, wie in Kryoschnittpräparaten deutlich zu sehen ist. Mit dem MASE-Ansatz ist es möglich, einzelne Celia mit Neuronen zu identifizieren, die den Rezeptor exprimieren. Dies stellt eine außergewöhnliche Detailverbesserung gegenüber der Kryosektion dar.

Es war auch möglich, die Lokalisation von Proteinen in verschiedenen Altersstadien zu betrachten, wie z.B. im pränatalen Stadium. Wenn Sie dies bei der Vorbereitung von Gesichtsgewebe verwenden, rechts. Bei diesem Eingriff ist zu beachten, dass jegliches entbehrliche Berühren und Abdrücken des Epithels vermieden werden muss, um die fragilen Ziliarstrukturen zu erhalten.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie eine reproduzierbare oder schnelle Vorbereitung für eine cholfaktorische CLIA des gesamten Mount durchführen können, um eine zusätzliche Perspektive auf das olfaktorische Epithel zu erhalten.