Name: Kultur und Co-Kultur von Maus Eierstöcke und Eibläschen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 41 s
Description: Erfahren Sie die Primärkultur und Ko-Kultur von Maus-Eierstöcken und Eibläschen zur Untersuchung der Follikelentwicklung und Interaktionen. Diese Methode ermöglicht physiologische Entwicklung in vitro.

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Die Arbeit wurde durch den MRC-Zuschuss G1002118 finanziert.

Alle Tier Arbeit wurde in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Instituts unter Lizenz von der britischen Home Office (Projektlizenznummer PPL 60/1726 und 60/4026) durchgeführt. Hinweis: Haus Tiere gemäß UK gesetzlichen Anforderungen in einem 14 Stunden Licht und 10 Stunden Dunkelheit Photoperiode. Verhaltenstierversuche mit Wildtyp-Mäusen C57BL6J, Tau-GFP-Mäuse, die ubiquitäre Expression des grün fluoreszierenden Proteins (GFP) 8 und Thy1-YFP Mäusen mit gelegentlichen Ausdruck gelb fluoreszierendes Protein (YFP) in einer Untergruppe von neuronalen Zellen 9 haben: sowohl transgenen Linien wurden auf einem C57BL6J Hintergrund gezüchtet. 1. Arbeitsbedingungen und die Vorbereitung der Instrumente <ol><li> Führen Sie alle Medienherstellung, Gewebe Dissektionen und Kulturarbeit in einer Sterilbank, um die Sterilität zu gewährleisten: diese die Anforderungen der Beigabe von Antibiotika in Medien vermeidet. </li><li> Immer erlauben Medien / Kulturplatten / Embryo Gerichte ins Gleichgewichtfür mindestens 1 Stunde in einem 37 ° C-Ofen (dissection Medium / Embryo Geschirr) oder 37 ° C, 5% CO 2 Inkubator (Kulturmedium und Platten), vor der Verwendung. </li><li> Genießen Glaspipetten in 0,1% Lösung von Rinderserumalbumin (BSA) für etwa eine Stunde, und dann trocknen lassen. Ziehen Pipetten in der Flamme eines Bunsenbrenners, Biegen der Glas wie Sie dies tun, um fein gezeichneten gebogenen Glaspipetten zu produzieren. Nachdem die Pipette gezogen wird, machen einen sauberen Schnitt mit einem Glasschneider. Ofen bei 160 ° C sterilisieren etwa 45 min. HINWEIS: Im Kaufhaus in dieser Glaspipetten werden benötigt, um die Eierstöcke und die Follikel zu übertragen. </li></ol> 2. Herstellung von Dissection und Kultur Medien <ol><li> Bereiten Dissektion Medium. <ol><li> Man löst 3 mg / ml BSA in Leibowitz L15 Medium und durch einen 0,2 &amp; mgr; m Poren, 25 mm Durchmesser Filter sterilisieren. </li></ol></li><li> Neonatal Eierstock Kultur. <ol><li> Medium für neonatale Eierstock Kultur vorzubereiten, machen 1 ml Medium für Bildung und Kulturh Ovar, die kultiviert wird. Man löst 3 mg / ml BSA in α-Minimal Essential Media (&amp; agr; MEM), und durch einen 0,2 &amp; mgr; m Poren, 13 mm Durchmesser filtersterilisieren in ein steriles Röhrchen. </li><li> Um Platten für neonatale Eierstock Kultur vorzubereiten, 1 ml der Neugeborenen-Eierstock Kulturmedium in jede Vertiefung (ein Eierstock pro Vertiefung) einer 24-Well-Platte. Mit einer sterilen Uhrmacher Pinzette, legen Sie eine Polycarbonatmembran über dem Medium in jedem Well, glänzende Oberfläche auf. UV sterilisieren Membranen vor der Verwendung. </li></ol></li><li> Follikel-Kultur. <ol><li> Medium für Follikel Kultur vorzubereiten, zu ergänzen, α-Minimal Essential Media mit 1 IU / ml rekombinantes humanes Follikel-stimulierendes Hormon, 5 ug / ml Ascorbinsäure und 5% v / v Serum von erwachsenen weiblichen Mäusen erhalten. Filter sterilisiert durch einen 0,2 &amp; mgr; m Poren, ø 13 mm-Filter in ein steriles Röhrchen. </li><li> Filter sterilisieren Silikonöl durch einen 0,45 &amp; mgr; m Poren, Durchmesser 25 mm Filter, in ein steriles Röhrchen. </li><li> Um pla vorbereitentes, werden 30 &amp; mgr; l Tröpfchen der Follikel Kulturmedium in jede Vertiefung einer nicht-Gewebekultur behandelten 96-Well-Mikrotiter-Rund-Well-Platte, die nur die obere Reihe jeder Platte (damit Follikel in neuen Zeilen pro Tag über bewegt werden Die Kulturzeit). Sorgfältig überlagern Medium mit 70 ul sterilisiertes Silikonöl, bis mittlere Verdunstung zu verhindern. </li></ol></li><li> Follikel-Ovar Co-Kultur. <ol><li> Bereiten Medium für Eierstock-Follikel-Co-Kultur wie für Follikel Kultur in Schritt 2.3.1, aus denen 1 ml Medium für jeden Follikel-Eierstock Co-Kultur aufgebaut. </li><li> Zur Herstellung von Platten, 1 ml Medium in jede Vertiefung einer Platte mit 24 Vertiefungen. Mit einer sterilen Uhrmacher Pinzette, legen Sie eine Nucleopore Membran oben auf dem Medium in jedem Well, glänzende Oberfläche auf. UV sterilisieren Membranen vor der Verwendung. </li></ol></li></ol> 3. Neonatal Ovar Dissection und Kultur <ol><li> Zeigen 1 ml Dissektion Medium in jedem sterilen Glas Embryo Gericht. </li> &lt;li&gt; Cull neonatalen Maus Jungtieren zwischen postnatalen Tag 0 und 5 Jahren, Keulung durch Enthauptung nach britischen Innenministeriums Vorschriften. </li><li> Fassen Sie die Haut, welche die Bauchwand unter Verwendung eines Paares von feinen Sezierung einer Pinzette und machen einen großen Einschnitt in der Haut und Körperwand. Ziehen Sie die Schnittführung, so dass die gesamte Unterleib ausgesetzt ist. Die Blase ist in der Regel in diesem Stadium angeschwollen und punktiert werden, um Dissektion einfacher. </li><li> Bewegen Sie den Mut, aus dem Weg mit Uhrmacher Pinzette. Folgen der Uterushörner von der Harnblase bis zu der Niere auf jeder Seite. Der Eierstock ist knapp unterhalb der Niere an der Spitze der Gebärmutter und wird als Cloud-ähnliche Struktur unter einem Binokular angezeigt. </li><li> Fassen Sie den Eierstock vorsichtig mit Uhrmacher Zangen, und verwenden Sie eine Schere, um ihre Anbringung an der Gebärmutter zu durchtrennen. Übertragen Sie das Paar Eierstöcke in Embryo Schalen mit vorgewärmten Dissektion Medium. </li><li> Führen Sie die Fein Dissektion der Eierstöcke unter Dissektionsmikroskop auf einem beheizten stage (37 ° C). Verwenden Sie Insulin Nadeln zu schneiden Sie die Bursasack und überschüssiges Material einschließlich der Eileiter, bis nur noch der Eierstock bleibt. </li><li> Übertragen Sie jede Eierstock in die Vertiefung einer Kulturplatte in Schritt 2.2.2 oben hergestellt, mit einem fein gezeichneten gebogenen Glaspipette, ein Eierstock oben auf jeder Membran (siehe 1A). Kultur in einem 37 ° C, 5% CO 2 -Inkubator. </li><li> Ändern Sie jeden zweiten Tag das Medium. Mit einer Pipette auf 50% des Mediums in jeder Vertiefung für vorge vergast frisches Medium austauschen: Platz am Rand des Brunnens mittel die Pipettenspitze zu vermeiden, die Membran zu stören. </li><li> Pflegen Kulturen für bis zu 6 Tage. </li><li> Am Ende der Kultur, Gefriert Medium und zu beheben oder Einfrieren Eierstöcke nach einer kurzen Waschung in PBS, je nach Bedarf. <ol><li> Fix Ovarien in Bouins Fixativ für 90 min für die histologische Analyse, oder in 10% neutral gepuffertem Formalin für 90 min für immunhistologische Analysen. Schnellfrosteierstöcken, indem Gewebe inein Polypropylenrohr, indem das Röhrchen in Trockeneis für 5-10 Minuten vor dem Einfrieren bei -70 ° C für die nachfolgende Protein oder mRNA-Extraktion. </li></ol></li></ol> 4. Follikel Dissection und Kultur <ol><li> Cull 19-23 Tage alte weibliche Mäuse und zu isolieren, die Eierstöcke. Befeuchten Sie das Fell mit 70% Ethanol, bevor Sie irgendwelche Einschnitte. Halten Sie die Haut mit glatten Enden Zangen und machen einen großen Bauchschnitt mit Dissektion Schere, durchdringt sowohl die Haut und die Körperwand. </li><li> Bewegen Sie den Darm aus dem Weg mit einem feineren Satz von Dissektionsinstrumente und suchen Sie die Gebärmutter. Folgen der Gebärmutter bis Ovars, der unterhalb der Niere auf jeder Seite befindet. </li><li> Gently Greifen der Eierstock mit einem Paar Uhrmacher Zangen, trennen Eierstöcke Befestigung an der Gebärmutter mit feinen Sezierung Schere. Vermeiden Sie sammeln zu viel von der Eierstock-Fettpolster. Sammeln Sie die Eierstöcke und die Überführung in ein Embryo Schalen mit vorgewärmten Dissektion Medium. </li><li> Rebewegen Sie den Eierstock Bursa mit Insulin Nadeln wegschneiden die Bursasack und überschüssiges Material einschließlich der Eileiter, bis nur noch der Eierstock bleibt. Etwa die zu halbieren jedes Ovar mit Insulin Nadeln. </li><li> Jede Eierstock-Hälfte vorsichtig in ein individuelles Uhrenglas, das 1 ml Dissektion Medium zu übertragen. Cover jede Uhrglas mit einem Glasobjektträger um die Verdampfung des Mediums zu verhindern und Sterilität zu gewährleisten. </li><li> Shop Uhrengläser mit Ovar Hälften in einem 37 ° C heißen Ofen, bis sie benötigt, aber die Durchführung der nächsten Sektion Schritt so schnell wie möglich. Verwerfen Gewebe auf diese Weise für mehr als eine Stunde gelagert. </li><li> Über Uhrglas, die einen Eierstock die Hälfte auf eine 37 ° C erhitzt Mikroskoptisch in einer Sterilbank. Rund sezieren Eierstock in große Stücke mit zwei Insulin-Nadeln, um spät vorge Antralfollikeln identifizieren wie folgt: diese werden 2-3 Schichten von Granulosazellen enthalten und einen Durchmesser von etwa 180 bis 200 &amp; mgr; m. </li><li> Manuelles sezieren jegliche identified Follikel mit einem Insulin Nadel und eine 30 x 0,25 mm Akupunkturnadel, die in einem Nadelhalter befestigt ist. Seien Sie vorsichtig, um die meisten der umliegenden Stroma zu entfernen, aber um eine Beschädigung der Basalmembran der Follikel (siehe Abbildung 1B). </li><li> Verwenden Sie einen fein gezeichneten gebogenen Glaspipette sorgfältig über seziert Follikel in einen Auffang Uhrglas, die vorgewärmte Dissektion Medium. Achten Sie darauf, Follikel innerhalb der dünnen Kalibers Abschnitt Pipette halten, um nicht zu verlieren Follikel. </li><li> Messen Follikel genau mit einem kalibrierten Okular-Strichplatte in einem Binokular ausgestattet. </li><li> Wählen Follikel für die Kultur, wenn sie 190 ± 10 um im Durchmesser messen. Weitere wählen nur gesund, Kugel Follikel für Kultur; diese werden durchlässig sein, ohne dunkle atretischen Bereichen und eine intakte Basalmembran, zusammen mit etwas befestigt thekalen Gewebe: werfen Sie alle Follikel, die nicht passen diese Beschreibung. Es wurde eine Ausbeute von 10-15 Follikel pro Eierstock ist gut. </li><li> Verwenden Sie einen fein gezeichneten gebogenen Glaspipette, um eine einzelne Follikel in die Vertiefung einer Platte erfunden, wie in Schritt 2.3.3 zu übertragen. Vorsichtig die Follikel im Boden der Vertiefung (und nicht in der oberen Ölschicht). Kultur in einem 37 ° C, 5% CO 2 -Inkubator. </li><li> Kultur Follikel für bis zu 6 Tagen, bewegen Follikel in einen Brunnen mit frischem Medium jeden Tag. <ol><li> Bereiten Sie die nächste Zeile in der 96-Well-Platte wie in Plattenherstellung in Schritt 2.3.3. Rückstellplatte in den Inkubator für mindestens eine Stunde, um ein Gleichgewicht zu ermöglichen. Übertragen Follikel an die frische Brunnen des Mediums, mit einem fein gezeichneten Glaspipette. </li><li> Wenn zu irgendeinem Zeitpunkt in der Kultur Follikel für zwei Tage, bevor sie in frisches Medium belassen werden, legen jedes Follikel in einem Minimum von 60 &amp; mgr; l (anstatt 30 &amp; mgr; l) Tröpfchen von Follikel Kulturmedium. </li></ol></li><li> Um Daten über das Wachstum der Follikel zu sammeln, messen Follikel täglich, mit einem eyepiece Strichplatte in einem Binokular ausgestattet. Die Ölschicht wird Messungen Follikeldurchmesser verzerren, so erarbeiten die Kalibrierungskoeffizienten für das Set-up. </li><li> Am Ende der Kultur, Einfrieren Medium und fixieren oder Gefriert Gewebe für eine anschließende Analyse, wie in Schritt 3.10 oben. </li><li> Follikelstimulierendes Follikel Co-Kultur. <ol><li> Kultur zwei Follikel zusammen, um Wechselwirkungen zwischen Follikel zu untersuchen. Kultur wie oben, jedoch legen zwei Follikel Seite-an-Seite, in Kontakt sind, in einem Brunnen. </li><li> Platzieren 100 ul Tröpfchen Follikel Kulturmedium in jede Vertiefung einer nicht-Gewebekultur behandelten 96-Well-Mikrotiter-Flach-Well-Platte überlagert Medium mit 100 &amp; mgr; l sterilisiertes Silikonöl. Follikel an die frische Brunnen wie in Schritt 4.13 oben übertragen Sie nicht, sondern beauftragen Sie einen feinen Gel-Spitze des Mediums ändern 50% jeden zweiten Tag. </li><li> Um Gewebe Ursprung innerhalb der Co-Kultur zu identifizieren, Follikel Kokultur jeweils von einem anderen genetischen Quelle, beispielsweise one aus dem Eierstock eines Wildtyp-Maus, und das andere aus dem Eierstock einer Maus mit ubiquitären Expression von GFP. Bei der Verwendung von GFP oder YFP Gewebe minimieren Exposition von Gewebe, um so viel wie möglich Licht, während der Kultur, und durch die Fixierung / Verarbeitungsschritte danach. HINWEIS: Es ist normal, dass sich die beiden Follikel in einem einzigen, &quot;Zwei-Follikel&quot; Einheit wachsen (siehe Abbildung 1C). </li></ol></li></ol> 5. Follikel-Eierstock-Co-Kulturen <ol><li> Sezieren Eierstöcke und Follikel wie in den Abschnitten 3 und 4 oben. </li><li> Platzieren einer neonatalen Ovar auf einer Membran, einer Platte, wie in Schritt 2.4.2 oben hergestellt. Vorsichtig einen einzigen Follikel in Kontakt mit einem Pol der neonatalen Eierstock, mit einer fein ausgezogenen gekrümmten Glaspipette. Kultur in einem 37 ° C, 5% CO 2 -Inkubator für bis zu 5 Tage. </li><li> Um zwischen dem Ursprungsgewebe innerhalb der Co-Kultur zu unterscheiden, verwenden Eierstöcke und Follikel aus zwei verschiedenen sources, beispielsweise eine von einer Wildtyp-Maus und einer von einer Maus mit ubiquitären Expression von GFP. </li><li> Ersetzen 500 ul Medium täglich, wie in Schritt 3.8 vor, jedoch unter Verwendung von Follikel-Kulturmedium. Während Co-Kultur, die Follikel wird oft vom Ovar (1D) eingekapselt. </li><li> Am Ende der Kultur, Einfrieren Medium und fixieren oder Gefriert Gewebe für eine anschließende Analyse, wie in Schritt 3.10 oben. </li></ol> 6. Fixierung, Immunzytochemie und Imaging von kultivierten Gewebe <ol><li> Am Ende der Kultur, waschen Gewebe in PBS und Transfer zum 100 ul (Follikel) oder 1 ml (Eierstock) von 10% neutral gepuffertem Formalin, und befestigen Sie 1 Stunde lang auf Eis. Bewegen sich durch 3 Waschungen mit 1x PBS bei 4 ° C. </li><li> Für Immunzytochemie auf Follikel Übertragung zwischen den Wells einer 96-Well-Mikrotiter-Rund-Well-Platte mit einer fein ausgezogenen gekrümmten Glaspipette, wobei jede Vertiefung mit verschiedenen Waschungen oder Behandlungen. </li><li> Für Immunzytochemie auf ovaries (oder Eierstock-Follikel-Co-Kulturen), Einbettung in 4% Agarose-Gel und Abschnitt 50 um unter Verwendung einer vibrotome. Schwimmer Abschnitte in die Vertiefungen einer Platte mit 24 Vertiefungen zu Waschungen oder Behandlungen anzuwenden, das Entfernen mit einer Pipette. </li><li> Für die Bildgebung: übertragen Agarose Abschnitte Flachglasobjektträger und montieren mit Montageträger; oder Übertragung Follikel (oder Follikel Follikel-Komplexe), um den Hohlraum Glasobjektträger und montieren mit nicht-härtendes Eindeckmittel. Bild Proben mit einem konfokalen Mikroskop. </li></ol>

<ol><li>Brien, M. J., Pendola, F. L., Eppig, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+revised+protocol+for+in+vitro+development+of+mouse+oocytes+from+primordial+follicles+dramatically+improves+their+developmental+competence%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Reprod%22%5BJournal%5D)">A revised protocol for in vitro development of mouse oocytes from primordial follicles dramatically improves their developmental competence.</a> Biol. Reprod. 68 (5), 1682-1686 (2003).</li>
<li>Fortune, J. E., Yang, M. Y., Muruvi, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+earliest+stages+of+follicle+development%3A+follicle+formation+and+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Soc.+Reprod.+Fertil.+Suppl%22%5BJournal%5D)">The earliest stages of follicle development: follicle formation and activation.</a> Soc. Reprod. Fertil. Suppl. 67, 203-216 (2010).</li>
<li>McLaughlin, M., Kinnell, H. L., Anderson, R. A., Telfer, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+phosphatase+and+tensin+homologue+%28PTEN%29+in+human+ovary+in+vitro+results+in+increased+activation+of+primordial+follicles+but+compromises+development+of+growing+follicles%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Hum.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Inhibition of phosphatase and tensin homologue (PTEN) in human ovary in vitro results in increased activation of primordial follicles but compromises development of growing follicles.</a> Mol. Hum. Reprod. 20 (8), 736-744 (2014).</li>
<li>Morgan, S., Lopes, F., Gourley, C., Anderson, R. A., Spears, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cisplatin+and+doxorubicin+induce+distinct+mechanisms+of+ovarian+follicle+loss%3B+imatinib+provides+selective+protection+only+against+cisplatin%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Cisplatin and doxorubicin induce distinct mechanisms of ovarian follicle loss; imatinib provides selective protection only against cisplatin.</a> PLoS One. 8 (7), e70117(2013).</li>
<li>Murray, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Follicular+growth+and+oocyte+competence+in+the+in+vitro+cultured+mouse+follicle%3A+effects+of+gonadotrophins+and+steroids%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Hum+Reprod%22%5BJournal%5D)">Follicular growth and oocyte competence in the in vitro cultured mouse follicle: effects of gonadotrophins and steroids.</a> Mol Hum Reprod. 14 (2), 75-83 (2008).</li>
<li>Baker, S. J., Srsen, V., Lapping, R., Spears, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+effect+of+follicle-follicle+interactions+and+declining+follicle-stimulating+hormone+on+murine+follicle+health+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Combined effect of follicle-follicle interactions and declining follicle-stimulating hormone on murine follicle health in vitro.</a> Biol. Reprod. 65 (4), 1304-1310 (2001).</li>
<li>Campbell, L., Trendell, J., Spears, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+cells+migrating+from+the+thecal+layer+of+ovarian+follicles%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Identification of cells migrating from the thecal layer of ovarian follicles.</a> Cell Tissue Res. 353 (1), 189-194 (2013).</li>
<li>Pratt, T., Sharp, L., Nichols, J., Price, D. J., Mason, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cells+and+transgenic+mice+ubiquitously+expressing+a+tau-tagged+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cells and transgenic mice ubiquitously expressing a tau-tagged green fluorescent protein.</a> Dev. Biol. 228 (1), 19-28 (2000).</li>
<li>Feng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).</li>
<li>Maiani, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reply+to%3A+cisplatin-induced+primordial+follicle+oocyte+killing+and+loss+of+fertility+are+not+prevented+by+imatinib%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Reply to: cisplatin-induced primordial follicle oocyte killing and loss of fertility are not prevented by imatinib.</a> Nat. Med. 18 (8), 1172-1174 (2012).</li>
<li>Spears, N., Bruin, dr, Gosden, J. P., G, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+establishment+of+follicular+dominance+in+co-cultured+mouse+ovarian+follicles%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Reprod.+Fertil%22%5BJournal%5D)">The establishment of follicular dominance in co-cultured mouse ovarian follicles.</a> J. Reprod. Fertil. 106 (1), 1-6 (1996).</li>
<li>Desmeules, P., Devine, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+the+ovotoxicity+of+cyclophosphamide+metabolites+on+cultured+mouse+ovaries%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol.+Sc%22%5BJournal%5D)">Characterizing the ovotoxicity of cyclophosphamide metabolites on cultured mouse ovaries.</a> Toxicol. Sc. 90 (2), 500-509 (2006).</li>
<li>Tagler, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promoting+extracellular+matrix+remodelling+via+ascorbic+acid+enhances+the+survival+of+primary+ovarian+follicles+encapsulated+in+alginate+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Promoting extracellular matrix remodelling via ascorbic acid enhances the survival of primary ovarian follicles encapsulated in alginate hydrogels.</a> Biotechnol. Bioeng. 111 (7), 1417-1429 (2014).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Wir beschreiben hier verschiedene Kultursysteme, die genutzt werden, um die Entwicklung der Maus Eibläschen in vitro zu unterstützen, unter Verwendung von Voll Neugeborenen Eierstöcke nur die frühesten Follikelstadien, individuelle präantralen Eibläschen und auch Co-Kulturen der beiden Gewebe enthalten werden. Kultur der Neugeborenen Maus Eierstöcke unterstützt frühen Eierstockentwicklung, insbesondere Follikelwachstum Initiierung bis zur sekundären Follikel Bühne. Ein Bereich von Alter von neugeborenen Mäusen können für diese Kulturen verwendet werden, je nach den Entwicklungsstadien von Interesse. Wenn die Eierstöcke von neugeborenen Mäusen erhalten wird Follikelbildung sein im Gange, aber noch nicht abgeschlossen: Kultur wird fort Follikelbildung gefolgt von Follikelwachstum zumindest teilweise zu unterstützen. Alternativ (zu welcher Zeit Follikel Bildung ist bereits) Verwendung von Ovarien von Mäusen etwa vier bis fünf Tage alten Kultur der Ergebnisse in einer größeren Anzahl von ursprünglichen und wachsende follikel 12. Vorteilhafte Aspekte der hier beschriebenen speziellen Verfahren umfassen die Verwendung von schwimmenden Polycarbonatmembranen, die größer ist die Sauerstoffversorgung des Gewebes, und die Kultur in einem sehr basischen Medium, das nur aus &amp; agr; MEM und BSA zu ermöglichen, wobei die Verwendung von nicht definierten Zusatzstoffen wie Serum. Kultur ganzer Ovarien scheint nicht unterstützt Entwicklung jenseits der sekundären Follikel Stufe mit anschließender Entwicklung eine Änderung der Technik, wie beispielsweise die Zerlegung von Follikel-Granulosazellen Komplexe aus der kultivierten neonatalen Ovar 1 erfordern. Späteren Stadien der Follikel-Entwicklung in vitro durch Sezieren individuelle, intakte Ende vorge Antralfollikel, der präovulatorischen Phase Kultur unter Beibehaltung ihrer dreidimensionalen Struktur gezüchtet werden können entwickelt werden. Die Verwendung von intakten Follikel für diese Kulturtechnik hält die Beziehung zwischen den verschiedenen Komponenten, wie follikuläre in vivo auftritt. This Kultursystem kann verwendet werden, um Eizellen, die Befruchtung und die anschließende Entwicklung des Embryos unterstützen kann erhalten werden. Befruchtungs Oocyten können aus Maus neonatalen Ovarien Verwendung einer anfänglichen Kulturprotokoll viel wie hier beschrieben, gefolgt von einer zweiten Stufe, während der Oozyten-Granulosazellen Komplexe in vitro 1 gezüchtet, erhalten werden. Andere Systeme ziemlich heute häufig verwendet werden, umfassen Kultur Follikel oder Eierstockgewebe, das in einem Material, wie Alginat Hydrogels eingekapselt wurde, zu unterstützen (siehe beispielsweise Tagler et al. 13). Das Schwergewicht der Verfahrensentwicklung ist es nun, Kulturtechniken für die Eierstöcke und die Follikel größeren Säugetieren zu verbessern, mit dem langfristigen Ziel der Gewinnung befruchtungs Oozyten von Primordialfollikeln aus einer Reihe von Spezies, einschließlich Menschen. Zu einem beliebigen Zeitpunkt, Säugereierstöcke enthalten Follikel in einer Reihe von Entwicklungsstadien, mit Zusans zwischen Follikel beeinflussen deren Regulation. Dieser Aspekt der Funktion der Eierstöcke ist wenig bekannt und schwer zu in vivo zu untersuchen. Die hier beschriebene endgültige Methode verwendet Co-Kultur-Systeme, um die Entwicklung von verschiedenen Stadien der Follikel in vitro zu unterstützen. Bei Bedarf können eine oder beide Gewebe können in vivo oder in vitro vor der Co-Kultur vorbehandelt werden. Co-Kultur-Systeme, wie dies eine ideale Weise, in der Follikel-Follikel-Wechselwirkungen zu untersuchen, zum Beispiel, wie wächst Antralfollikeln beeinflussen Primordialfollikel Becken, Aspekte ovarian Biologie, die schwierig erwiesen haben bis jetzt untersucht. Ganze Eierstock Kulturtechniken sind relativ einfach, auch wenn sorgfältig seziert und wird benötigt, um ein versehentliches Gewebeschäden zu vermeiden. Dissektion der einzelnen Follikel ist eine spezialisierte Technik und erfordert wiederholte Praxis vor Follikel an der richtigen Stufe kann aus dem Eierstock intakt und unbeschädigt seziert werden. Es ist kritischsorgfältig sezieren einzelne Follikel oder Schäden während der Präparation Protokoll aufrechterhalten können in Follikel-Tod während der anschließenden Kulturzeitraums führen. Wo Follikel werden direkt in die Vertiefung der Mikrotiterplatten ist es wichtig, nur nicht-Gewebekultur-behandelten Kunststoffe, zu minimieren Plattieren unten von Thekazellen auf die Kunststoff: bei der Gewebekultur behandelten Kunststoffprodukte verwendet wird, wird die Follikel zum Befestigen Boden der Vertiefung und Bruch, wie sie wachsen. Für alle Co-Kulturarbeit muss das Gewebe direkt in Kontakt miteinander gebracht werden. Die vorstehend zur Verwendung in der Follikel Kulturtechnik detailliert Medium enthält den Zusatz von Mausserum. Es ist möglich, die Maus-Serum mit fetalem Rinderserum ersetzt, sondern nur gelegentlich Chargen solcher Seren voll unterstützen Follikelentwicklung zu der präovulatorischen Phase mit Chargenprüfung erforderlich, um geeignete Quellen zu identifizieren. Batch-Prüfung von FSH ist auch ratsam, die Internationale Units, mit dem FSH Korrelat Follikelwachstum in vitro untersucht nur grob. Wenn Follikelrupturen routinemäßig während des Kulturzeitraums auftritt, sollten Sie sie ersetzen Lager Ascorbinsäure mit einer frischen Charge. Die Techniken erfordern nicht besonders spezialisierte Ausrüstung außer Sezieren Mikroskope und Gewebekultur-Inkubatoren, obwohl die Verwendung einer Steril und guter steriler Technik ermöglichen die Eibläschen, in Abwesenheit von Antibiotika als in den hier beschriebenen Verfahren kultiviert werden. Dies kann hilfreich sein, um jede mögliche nachteilige Wirkung von Antibiotika auf den Oozyten zu vermeiden, insbesondere wenn sie folgende Kultur befruchtet werden. Wo es nicht möglich ist, in einer sterilen Umgebung zu arbeiten, ist es ratsam, Antibiotika zur Präparation und Kulturmedien hinzuzufügen.

Die Säugetier-Eierstock der lebenslange Versorgung mit Eizellen einer Frau, die jeweils in einem Ovarialfollikel enthalten zusammen. Die Follikel sind vor der Geburt auf dem Rast gebildet, Ur-Phase: sobald die Follikel-Pool aufgebaut ist, gibt es einen kontinuierlichen und schrittweisen Bewegung der Follikel aus dem Ur in den wachsenden Follikel Pool. Da Follikel beginnen zu wachsen, entwickeln sie sich durch die primäre, sekundäre, präantralen und antralen Stufen, bis sie die präovulatorischen oder Graaf, Stadium zu erreichen. Nur Oozyten aus Follikeln präovulatorischen haben die volle Entwicklungskompetenz, in der Lage, die embryonale Entwicklung zu tige Unterstützung, wenn befruchtet. Der Eierstock ist seit langem bekannt, um in einer hoch physiologischer Weise in vitro zu entwickeln. Dies dürfte darauf zurückzuführen sein, jedes Ovarialfollikel die erforderlich sind, um eine Eizelle aus dem unreifen Stadium (an welcher Stelle es nicht in der Lage, seine Reifeteilung abgeschlossen ist) bis hin zu T-Zellen unterstützt, die in ihmer entwicklungs zuständigen Stufe (an welcher Stelle es voll unterstützen die Beendigung der Meiose, die Befruchtung und die Entwicklung der resultierenden Embryo tige). Die physiologische Natur des Eierstocks Entwicklung in vitro hat die breite Verwendung von Eierstock Kulturtechniken geführt. Folglich wird in-vitro-Verfahren sind verwendet worden, um die Regulation der Entwicklung Ovar, Eierstock- Pathologie (zum Beispiel, dass der polyzystischen Ovarien, PCOS), zu prüfen, wie die Eierstöcke / Oozyten durch Chemikalien beeinflusst, und auch mit dem konkreten Ziel untersuchen Erhalt befruchtungs Eizellen aus primordialen Follikeln. Bisher hat die letztere erreicht nur mit Maus Ovarialgewebe 1, obwohl Kulturtechniken unter Verwendung von großen Follikeln Säugetieren, einschließlich Menschen, haben sich in den letzten Jahren 2,3 verbessert. Wir beschreiben hier verschiedene Kulturmethoden mit der Maus Eierstockgewebe. Die erste method verwendet Ganz neonatalen Mauseierstöcken, und unterstützt die Bildung und die frühe Entwicklung der Primordialfollikel 4. Das zweite System unterstützt das Wachstum von einzelnen, intakten Follikeln vom späten präantralen zum preovulatory Stufe; mit dieser Technik können Follikel einzeln paar 5,6 kultiviert werden, oder. Schließlich beschreiben wir eine Co-Kultursystem, die Kombination der ersten beiden Techniken in einer Methode, die Untersuchung der Wechselwirkung zwischen wachsenden und primordialen Eierstockfollikeln 7 erlaubt. Kultur einzelner intakt Eibläschen ermöglicht Follikelwachstum, um der täglichen Follikel Messungen während der Kulturzeit bestimmt werden, während die Mittelanalyse ermöglicht Untersuchung der Follikel / Eierstock Hormonproduktion. Weitere Tissue Analysen können durch eine Sammlung von Follikel oder Eierstockgewebe am Ende der Kultur erreicht werden kann, für die histologische / immunhistologische Analysen oder für die Weiterverarbeitung beispielsweise zu erhalten,mRNA oder Proteinen.

<table><tbody><tr><td>Leibowitz L15</td><td>Invitrogen</td><td>11415049</td><td></td></tr><tr><td>&alpha; MEM</td><td>Invitrogen</td><td>22571020</td><td>Geliefert als Natriumbicarbonat gepuffert (2.200 mg/L)</td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9418</td><td>Für das Seziermedium</td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3311</td><td>Für Kulturmedium</td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2153</td><td>Zum Beschichten von Glaspipetten</td></tr><tr><td>Mausserum</td><td>-</td><td>-</td><td>Bei der Herzpunktion ist</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>häufig eine Chargenuntersuchung erforderlich. Make-up-Stammlösung von 1IU/10&micro; l in &alpha; MEM und bei -20 °C lagern.</td></tr><tr><td>Ascorbinsäure</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4034</td><td>Nachfüllbestand von 5mg/ml in &alpha; MEM und bei -20 °C lagern.</td></tr><tr><td>Silikonöl</td><td>VWR</td><td>630064V</td><td>Dow Corning Silikonöl 200/50cS</td></tr><tr><td>Spritzenvorsatzfilter (25 mm, 0,2 & Mikro; m)</td><td>Greiner</td><td>16532K</td><td>Celluloseacetat-Filter zur Filterung größerer (> 5 ml) Volumen des Mediums.</td></tr><tr><td>Spritzenvorsatzfilter (13 mm, 0,2 & Mikro; m)</td><td>Iwaki</td><td>3032-013</td><td>Celluloseacetat-Filter zum Filtern kleinerer (< 5 ml) Volumina von Medium</td></tr><tr><td>Spritzenvorsatzfilter (25 mm, 0,45 & Mikro; m)</td><td>Iwaki</td><td>2053-025</td><td>Celluloseacetat-Filter zum Filtern von Öl.</td></tr><tr><td>Sterile Röhrchen</td><td>Greiner</td><td>187261</td><td></td></tr><tr><td>24-Well-Platte</td><td>Greiner</td><td>662160</td><td></td></tr><tr><td>96-Well-Platte mit rundem Boden</td><td>Iwaki</td><td>3875-096</td><td>Nur nicht mit Gewebekulturen behandelte Platten verwenden</td></tr><tr><td>96-Well-Well-Wells mit flachem Boden</td><td>Iwaki</td><td>3860-096</td><td>Nur mit Nicht-Gewebekulturen behandelte Platten</td></tr><tr><td>verwenden Whatman Nukleoporenmembranen</td><td>Camlab</td><td>WN/110414</td><td>Verwenden Sie glänzende Oberfläche nach oben, Polycarbonat, 13 mm Durchmesser, 8,0 & Mikro; m Porengröße</td></tr><tr><td>Insulinnadeln</td><td>BD medizinisches Zubehör</td><td>037-7606</td><td>0,33 mm (29 G) + 1 ml</td></tr><tr><td>Embryoschalen aus Glas</td><td>VWR</td><td>720-0579</td><td>Vor Gebrauch sterilisieren, dann erwärmen.</td></tr><tr><td>Glaspipetten</td><td>Fisher Scientific</td> 10209381 <td>vor Gebrauch BSA-beschichtet.</td><td></td></tr><tr><td>Gelspitzen</td><td>AlphaLabs</td><td>LW1103</td><td></td></tr><tr><td>Akupunkturnadeln</td><td>Acumedic LTD</td><td>30 mm x 0,25 Typ C</td><td></td></tr><tr><td>Bouin' s Fixiermittel</td><td>Sigma Aldrich</td><td>HT10132-1L</td><td></td></tr><tr><td>Formalinlösung, neutral gepuffert, 10%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>HT5014-120ml</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml Polypropylen Tuben</td><td>Greiner BioOne</td><td>616201</td><td></td></tr></tbody></table>

kultur und co-kultur von maus eierstöcke und eibläschen

Culture and Co-Culture of Mouse Ovaries and Ovarian Follicles

Die Säugereierstocks der Follikel, die jeweils Follikel bestehend aus einer einzelnen Eizelle durch somatische Granulosazellen umgeben, zusammen innerhalb eines Basalmembran umschlossen. Eine endliche Pool der Follikel wird während der Embryonalentwicklung, bei der Eizellen in Meiosehemmung bilden eine enge Verbindung mit abgeflachten Granulosazellen und bildet Primordialfollikel gelegt. Mit oder kurz nach der Geburt, enthalten Säugetier die Eierstöcke ihre lebenslange Versorgung mit Primordialfollikel, von dem Zeitpunkt an gibt es einen stetigen Freisetzung von Follikel in den wachsenden follikulären Pool. Der Eierstock ist besonders geeignet, um die Entwicklung in vitro, mit Follikel wächst in einem sehr physiologische Art und Weise in der Kultur. Diese Arbeit beschreibt die Kultur ganzer neonatalen Ovarien enthaltenden Primordialfollikeln und die Kultur einzelner Ovarialfollikel, ein Verfahren, das die Entwicklung der Follikel aus einem unreifen bis zur preovu unterstützen kannRegelungsstufe, nach dem ihre Eizellen in der Lage, die Befruchtung in vitro unterzogen werden. Die hier vorgestellte Arbeit nutzt Kultursystemen zu bestimmen, wie die Eierstöcke durch Exposition gegenüber externen Verbindungen betroffen. Wir beschreiben auch ein Co-Kultursystem, die Untersuchung der Wechselwirkungen, die zwischen den reifenden Follikel und der nicht-wachsenden Pool von Primordialfollikeln auftreten können.

Abbildung 1 zeigt Bilder der Eierstöcke und der Follikel zu Beginn und während der Kulturverfahren. Abbildung 2 zeigt repräsentative Ergebnisse von Neugeborenen Eierstöcke (hier, Eierstöcke von neugeborenen Welpen) auf reproduktionstoxische Stoffe während Kultur ausgesetzt. Neonatal Ovarien wurden 6 Tage am Tag 2 der Kultur kultiviert wird, und auf ein Chemotherapeutikum ausgesetzt, Cisplatin oder Doxorubicin. Am Ende der Kultivierung wurden die Eierstöcke befestigt, für die Histologie verarbeitet und Ovarien dann untersucht, um die Anzahl von gesunden und ungesunden Eierstockfollikeln 4 bestimmen. Alternativ kann eine schnelle Beurteilung der frühen wachsenden Follikel aus der Kultur von Eierstock-Fragmente erhalten werden, unter Verwendung der Eierstöcke einer Maus, einer Eizelle, fluoreszierenden Markierung 10 exprimieren. In der Kultur der einzelnen Follikel, Follikelwachstum kann durch tägliche Messungen während der Cul ermittelt werdentur Periode, Fig. 3 zeigt repräsentative Ergebnisse der Follikelwachstum in Gegenwart oder Abwesenheit der Gonadotropin Hormone kultiviert follikelstimulierendes Hormon (FSH) und luteinisierendes Hormon (LH) 5. Follikelstimulierendes Follikel oder Follikel-Ovar Cokultur verwendet werden, um Wechselwirkungen zwischen den Follikeln zu untersuchen. In Abhängigkeit von dem Gewebe und Verarbeitung, können Bilder mit Hellfeld-, Fluoreszenz- oder konfokalen Mikroskopen erhalten werden, Fig. 4 zeigt repräsentative Ergebnisse von Bildern von solchen Co-Kulturen, einer Prüfung der verschiedenen in Follikel-Follikel Kommunikation beteiligten Zelltypen, einschließlich Endothel- und neuronalen Zellen 7. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/52458/52458fig1highres.jpg" width="650" /> Abbildung 1: (A) Mikroskopische Aufnahme eines Neugeborenen Eierstock von einer Maus am Tag der Geburt erhalten, platziert<html> auf einer Polycarbonatmembran. (B): Mikroskopische Aufnahme von frisch präpariert gesunde Ovarialfollikel, mit den meisten der umliegenden Stroma-Gewebe seziert entfernt. (C) Mikrophotographien der Co-Kultur von zwei Follikel im Laufe der ersten drei Tage der Kultur, welche den engen Kontakt zwischen den beiden Follikel als Kultur Erlös (Ci entwickelt: am ersten Tag der Kultur; Cii: zweiten Tag der Kultur; CIII : dritten Tag der Kultur). Nach zwei Tagen der Kultur von Spears et al wiedergegeben. 11 (D) Mikroskopische Aufnahme cokultiviert präantralen Follikel und Neugeborenen Eierstock. Bild zeigt die Follikel immer vom Ovar gekapselt. Pfeil zeigt präantralen Follikel. Bild von Dr. Federica Lopes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52458/52458fig1highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a> Abbildung 2 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 52.458 / 52458fig2.jpg &quot;/&gt; Figur 2: Wirkung der Chemotherapeutika Cisplatin und Doxorubicin neonataler kultivierten Ovarien Cisplatin und Doxorubicin Beides führt zu Verlust von Follikel Gesundheit und einer Verringerung Follikel Zahlen.. (A) Cisplatin; (B) Doxorubicin: (i) Prozentsatz der ungesunden Follikel (clear); und (ii) der Anzahl der Follikel (schattiert) in jedem Eierstock. Bars bezeichnen Mittelwert ± SEM; n = 5 für alle Gruppen, Sterne bezeichnen signifikante Unterschiede im Vergleich zur Kontrolle (* p &lt;0,05, ** p &lt;0,01 *** p &lt;0,001). Von Morgan et al wiedergegeben. 4 <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/52458/52458fig3.jpg" width="400" /> Abb. 3: Die Wachstumsraten der Follikel zu unterschiedlichen Gonadotropin Umgebungen ausgesetzt Werte sind Mittelwerte ± SEM (n ≥16 für jede Gruppe). Pfeil zeigt den Beginn antral Bildung in allen Gonadotropin Gruppen. Von Murray et al wiedergegeben. 5 <img alt="4" src="/files/ftp_upload/52458/52458fig4highres.jpg" width="650" /> Abbildung 4: Bilder aus der Follikel Follikel und Eierstock-Follikel-Co-Kulturen, welche Follikel Follikel Wechselwirkungen (A) konfokale mikroskopische Aufnahme eines grün fluoreszierenden Proteins (GFP) Follikel und eine Wildtyp (WT) Follikel nach der Co-Kultur (. hier weiß dargestellt GFP-Expression), mit Prozessen von der gezeigten GFP Follikel, die sich über dem WT Follikel. (B) Querschnitt durch eine GFP / WT Follikel komplexen folgenden Co-Kultur, die zeigen, dass GFP-Prozessen (grün) von der benachbarten Follikel liegen neben der Basalmembran des WT Follikel. (C) Neonatal WT Eierstock nach Kultur mit einem Pre-antralen GFP-exprimierenden Follikel, die zeigen, dass GFP-Zellen und zelluläre Prozesse (grün) haben migriertdurch die Eierstock interstitum des Neugeborenen Eierstock. (D) GFP / WT Follikel Komplex, Endothelzellen, durch Expression von endothelialer Zellmarker CD31 (rot) dargestellt. (E) GFP / WT Follikel Komplex, der Nervenzellen, durch Expression von neuronalen Marker Tubulin beta III gezeigt (siehe hier als rot oder gelb, wenn doppelt markierten mit GFP, grün). (F) YFP / WT Follikel Komplex, in dem YFP bezieht sich auf von einem Thy1-YFP-Maus, die gelegentlich Expression gelb fluoreszierendes Protein Follikel (YFP: gelb) in einer Untergruppe von neuronalen Zellen 9, die zeigen, dass Neuronen aus dem YFP Follikel erstrecken. Bars 50 um (A, B, D), 100 um (C, E, F), 100 um (Einschub in A), 10 um (Einschub in C), 15 &amp; mgr; m (siehe Einschub in D). Von Campbell et al reproduziert werden. 7 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52458/52458fig4highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um eine größere Version dieses fi sehen</a>Abbildung.

Dieses Protokoll beschreibt die Primärkultur / Co-Kultur von Maus-Eierstockgewebe, mit Eierstöcke von neugeborenen Mäusen und individuelle Eibläschen von präpubertären Mäusen. Die Kulturtechniken unterstützt Entwicklung in einer hoch physiologischer Weise ermöglicht Untersuchung der Wirkung von äußeren Mitteln an den Eierstöcken und der Wechselwirkungen zwischen Follikeln.

Kultur und Co-Kultur von Maus Eierstöcke und Eibläschen

The mammalian ovary is composed of ovarian follicles, each follicle consisting of a single oocyte surrounded by somatic granulosa cells, enclosed together ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, neugeborene Eierstöcke oder einzelne Eierstockfollikel in vitro zu kultivieren. Dies wird erreicht, indem zunächst Eierstöcke von weiblichen Tieren des geeigneten Alters nach Abkühlung präpariert werden. Der zweite Schritt besteht in der Vorbereitung des Gewebes, einschließlich der feinen Dissektion einzelner Eierstockfollikel mit Akupunkturnadeln.Anschließend werden die neugeborenen Eierstöcke oder einzelnen präantralen Follikel mit regelmäßiger Nährstoffversorgung kultiviert, und der letzte Schritt besteht darin, das Gewebe für die histologische oder molekulare Analyse zu fixieren oder einzufrieren. Letztendlich unterstützt das Kultursystem die Entwicklung auf hochphysiologische Weise und kann verwendet werden, um die Regulation der Entwicklung ovarieller Follikel zu untersuchen sowie Wechselwirkungen zwischen primordialen und wachsenden ovariellen Follikeln zu erforschen. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass intakte ovarielle Follikel während ihrer Entwicklung unterstützt werden und dabei ihre dreidimensionale Struktur beibehalten, ohne dass Stützmatrizen erforderlich sind.Mit dieser Methode können zentrale Fragen im Bereich der Ovarbiologie beantwortet und außerdem die Wirkungen toxischer Substanzen wie Chemotherapeutika oder Medikamente auf den Eierstock und somit auf die weibliche Fertilität untersucht werden. Die Idee zur gleichzeitigen Kultivierung von Ovarfollikeln unterschiedlichen Alters – und damit unterschiedlicher Entwicklungsstadien – entstand im Rahmen einer Diskussion darüber, wie der Einfluss wachsender Follikel auf den Ruhebestand der primordialen Follikel untersucht werden könnte. Vivian Allison, eine Technikerin aus dem Labor, sowie Allison Murray, die viele Jahre als Postdoktorandin im Labor tätig war, werden die Technik gemeinsam mit Steph Morgan und Lisa Campbell demonstrieren. Beide haben wesentliche Aspekte der Technik mitentwickelt, um die Pipetten für dieses Protokoll zu ziehen.Erhitzen und biegen Sie Glaspipetten über einer Flamme und schneiden Sie sie mithilfe eines Glasstichers sauber durch. Anschließend sterilisieren Sie die gebogene Glaspipette bei 160 Grad Celsius für etwa 45 Minuten. Es bedarf einiger Übung, um die richtige Krümmung der Pipette für Ihre Technik zu erreichen.Schneiden Sie die Pipette immer mit einem Glasstecher, damit kein scharfkantiges Glas entsteht. Außerdem sollten Sie sicherstellen, dass das Ende den richtigen Durchmesser für Ihr Gewebe aufweist. Sterilisieren Sie das Dissektionsmedium, das aus Leibovitz L-15-Medium mit BSA besteht, durch einen 0,2-Mikron-Filter mit einem Durchmesser von 25 Millimetern, um die Kultur von neonatalen Eierstöcken zu sterilisieren.Das Medium durch einen weiteren 0,2-Mikron-Filter mit einem Durchmesser von lediglich 25 Millimetern leiten und in einem sterilen Röhrchen auffangen. Anschließend je ein Milliliter des neonatalen Mediums in jede Vertiefung einer 24-Loch-Platte geben und eine Membran auf die Oberfläche des Mediums in jeder Vertiefung übertragen.Das Follikelkulturmedium wird ebenso wie das Ovar-Kulturmedium filtratsterilisiert. Anschließend muss auch Silikonöl filtratsterilisiert werden. Danach bereiten Sie 96-Well-Kulturplatten vor, indem Sie entlang der oberen Reihe Tropfen mit je 30 Mikroliter Follikelmedium auftragen.Überlagern Sie diese Vertiefungen vorsichtig mit 70 Mikrolitern Silikonöl. Alternativ benötigt die Follikel-Follikel-Kokultur 100 Mikroliter Medium mit einer Auflage von 100 Mikrolitern Silikonöl. Bereiten Sie anschließend die Follikel-Ovar-Kokulturplatten mit einem Milliliter Medium pro Vertiefung und einer sehr sorgfältig platzierten, UV-sterilisierten Nukleoporenmembran vor.Überführen Sie zunächst ein Milliliter Dissektionsmedium in jede sterile Glasembryoschale. Nachdem Sie die neugeborenen Welpen im Alter von null bis fünf Tagen markiert haben, fassen Sie mit feinen Pinzetten die Haut, die die Bauchdecke bedeckt, und schneiden Sie die Haut und die Körperwand ein. Öffnen Sie diesen großen Einschnitt, um die Bauchhöhle freizulegen.Die Harnblase ist in diesem Stadium normalerweise voll gefüllt und kann punktiert werden, um die Dissektion zu erleichtern. Mit einer Uhrmacherpinzette schieben Sie die Eingeweide beiseite. Verfolgen Sie dann auf jeder Seite die Uterushörner von der Harnblase bis zum Nierenbereich.Der Ovar ist eine wolkige Struktur, die sich direkt unterhalb der Niere am oberen Ende des Uterus befindet. Greifen Sie den Ovar vorsichtig an und schneiden Sie ihn mit einer Schere vom Uterus ab.Nachdem beide Eierst&ouml;cke herauspr&auml;pariert wurden, &uuml;berf&uuml;hren Sie sie in Schalen, die mit warmem Dissektionsmedium gef&uuml;llt sind. Verwenden Sie ein Dissektionsmikroskop mit einem auf 37 Grad Celsius beheizten Objekttisch, um die Eierst&ouml;cke mit Insulin-Nadeln zu pr&auml;parieren. Entfernen Sie den basalen Sack und &uuml;bersch&uuml;ssiges Material, einschlie&szlig;lich der Eileiter, bis nur noch das Eierstockgewebe &uuml;brig ist.Überführen Sie dann jedes Ovar mithilfe einer gebogenen Pipette in eine Vertiefung einer vorbereiteten Platte. Legen Sie ein Ovar auf jede Membrankultur; das Gewebe wechselt alle zwei Tage die Hälfte des Mediums, bis zu sechs Tage lang. Beim Mediumwechsel platzieren Sie die Pipettenspitze am Rand der Vertiefung, um die Membran nicht zu stören. Nach der Kultivierung können die Ovarien eingefroren, fixiert oder für die Histologie bzw. Immunchemie aufbewahrt werden.Nachdem die Eierst&ouml;cke &auml;lterer M&auml;use in einer Schale mit warmer Dissektionsl&ouml;sung gesammelt wurden, entfernen Sie die Eierstock-Basa. Verwenden Sie Insulin-Nadeln, um den basalen Sack und &uuml;berstehendes Material, einschlie&szlig;lich der Eileiter, abzutrennen, bis nur noch der Eierstock &uuml;brig ist. Anschlie&szlig;end schneiden Sie die Eierst&ouml;cke mit den Nadeln in zwei H&auml;lften und &uuml;berf&uuml;hren vorsichtig jede H&auml;lfte in ein separates Uhrglas, das ein Milliliter Dissektionsl&ouml;sung enth&auml;lt.Bedecken Sie die Uhrgläser mit einem Objektträger und lagern Sie sie so bald wie möglich im Ofen für bis zu einer Stunde. Arbeiten Sie unter einem Mikroskop mit beheiztem Objekttisch in einer laminarer Luftströmung abgeschirmten Haube und dissezieren Sie die Eierstöcke mit Insulin-Nadeln in große Stücke, um späte präantrale Follikel zu identifizieren. Die präantralen Follikel enthalten zwei bis drei Schichten von Granulosazellen und haben einen Durchmesser von etwa 180 bis 200 Mikrometern.Lösen Sie einen dieser Bereiche mit einer Injektionsnadel und einer Akupakturnadel, die von einer Nadelhalterung fixiert wird, heraus, wobei die Basallamina nicht beschädigt werden darf, aber das umgebende S-Stroma vollständig entfernt werden muss. Dies erfordert Übung. Der Follikel benötigt etwas fäkales Gewebe, jedoch nicht zu viel.Außerdem können die Follikel bei zu grober Durchführung der Dissektion beschädigt werden und reißen oder sterben ab. Während der Kultur bereitet der Anwender das Perpet sorgfältig vor, um die Follikel vorsichtig in eine mit Medium gefüllte Uhrglasplatte zu überführen. Halten Sie die Follikel mit einem kalibrierten Okular, das an ein Stereomikroskop angepasst ist, im dünnwandigen Bereich des Perpets.Messen Sie die Follikel. Wenn sie innerhalb von 10 Mikrometern eines Durchmessers von 190 Mikrometern liegen, können sie zur Kultivierung verwendet werden. Verwerfen Sie die anderen Follikel gegenüber den ausgewählten Follikeln.Wählen Sie nur die gesündesten Follikel für die Kultivierung aus. Sie sollten durchscheinend sein, ohne dunklere netzartige Bereiche, eine intakte basale Lamina aufweisen und etwas angeheftetes thekales Gewebe besitzen. Eine gute Ausbeute beträgt 10 bis 15 Follikel pro Ovar. Überführen Sie nun mithilfe einer vorbereiteten gebogenen Pipette diese Follikel in die vorbereitete 96-Well-Kulturplatte. Geben Sie einen Follikel in jedes Well unterhalb der Ölschicht und kultivieren Sie sie. Die Follikel werden bis zu sechs Tage lang täglich kultiviert.Bereiten Sie eine neue Reihe mit Medium vor. Eine Stunde oder später überführen Sie die Follikel in die nächste Reihe mit frischem, equilibriertem Medium oder kultivieren Sie zwei Follikel in einer Vertiefung nebeneinander. Anstelle von Transfers wechseln Sie alle zwei Tage die Hälfte des Mediums mit einer feinen Gel-Pipettenspitze.Für die Follikel-Ovar-Ko-Kultur überführen Sie einen Follikel in ein neonatales Ovar, das auf einer Membran in einer Kulturplatte platziert ist, und positionieren den Follikel vorsichtig neben einem Pol des neonatalen Ovars, sodass sie anschließend in Kontakt miteinander gebracht werden können. Führen Sie diese Kultur bis zu fünf Tage lang durch und erneuern Sie alle zwei Tage 500 µL des Kulturmediums.Die präantralen Follikel werden häufig von den neugeborenen Eierstöcken umhüllt. Während dieser Kultur wurden neugeborene Eierstöcke von Neugeborenen sechs Tage lang kultiviert und reproduktionstoxischen Substanzen ausgesetzt. Am zweiten Kulturtag wurden die Gewebe untersucht, um die Anzahl und Gesundheit der Follikel in verschiedenen Entwicklungsstadien zu bestimmen.Ein untersuchter Toxikant war Cisplatin. Der andere untersuchte Toxikant war Doxorubicin. Ein anderes Experiment untersuchte den Einfluss der gonadotropen Follikel stimulierenden Hormons und des luteinisierenden Hormons auf das Wachstum einzelner Follikel.Doch bei dieser Analyse wurde die Follikelgröße periodisch gemessen, um ihr Wachstum zu dokumentieren. Die Follikel-Kokultur wurde unter Verwendung eines GFP-exprimierenden Follikels und eines Wildtyp-Follikels untersucht, wobei Fortsätze von einem zum anderen reichten. Die immunhistochemische Aufarbeitung dieser Kokultur zeigte, dass sich die GFP-Fortsätze innerhalb des Wildtyps befanden.Die Thekaschicht, wildtypische neugeborene Ovarien wurden ebenfalls mit dem GFP-exprimierenden Follikel kultiviert. In diesem Szenario wanderten die GFP-Prozesse durch das ovarielle Interstitium. Die Kultur neugeborener Ovarien ist eine recht einfache Methode, aber es ist damit zu rechnen, dass einige Zeit benötigt wird, um die Technik der Dissektion intakter, unbeschädigter präantraler Follikel zu beherrschen.Dies ist für ihre ordnungsgemäße Entwicklung unerlässlich. Nach der Follikelkultur können die Oozyten mittels In-vitro-Fertilisation befruchtet werden, woraufhin die Embryonen in pseudoschwangere Weibchen übertragen und lebende Nachkommen erhalten werden können.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

In diesem Video beschreiben wir einen chirurgischen Eingriff, um Eierstöcke von einer neugeborenen Maus zu isolieren.

Isolierung der Eierstöcke von Neugeborenen-Mäusen: Ein chirurgischer Eingriff zur Entnahme eines Eierstockpaares aus einem neonatalen Mausmodell

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um die Follikel in kultivierten Eierstöcken von jungen Mäusen ohne seriellen Schnitt zu quantifizieren. Mit ganzen Organs Immunfluoreszenz und Gewebe löschen, wird körperliche Schneiden mit optischer Schnitt ersetzt. Diese Methode der Probenvorbereitung und Visualisierung Orgel Integrität bewahrt und automatisierte Quantifizierung bestimmter Zellen erleichtert.

Ganze Mount Immunfluoreszenz und Follikel Quantifizierung der kultivierten Maus Eierstöcke

Eierstöcke Gewebekulturen als Modelle der Follikel Entwicklung, Eisprung und Follikel Atresie einsetzbar und regulatorische Mechanismen der Eierstöcke Dynamiken zeigen.

Ovarian Tissue Culture Phänomene in der Maus Eierstock zu visualisieren

In-vitro-Kultur der rindereigenen Ovarialrinde und die Wirkung der ernährungsphysiologischen Stair-Step-Diät auf die ovarielle Mikroumgebung wird vorgestellt. Eierstockkortexstücke wurden sieben Tage lang kultiviert und Steroide, Zytokine und Follikelstadien wurden bewertet. Die Stair-Step-Diätbehandlung hatte eine erhöhte Steroidogenese, was zu einer Follikelprogression in Kultur führte.

Gewebekultur der Rinderovariarinde

Wir beschreiben Methoden zur Kultivierung von Ovarialfollikeln in einer neuartigen gerüstfreien Agaroseform, die die in vitro Gametogenese ergänzen.

Herstellung und Verwendung von anpassbaren Agaroseformen für die gerüstfreie Ovarialfollikelkultur von Mäusen

Wir beschreiben Methoden zur Isolierung somatischer maus-ovarialer Zellen aus einem stroma-angereicherten Anteil des Eierstocks und zur Erzeugung maus-ovarialer somatischer Organoide mittels eines gerüstfreien Ansatzes.

Untersuchung des Ovarialmikroumfelds: Methoden zur Isolierung, 2D-Kultur und organoiden Kultur somatischer Maus-Ovarialzellen

Dieses Protokoll beschreibt Verfahren für die In-vitro-Reifung von Maus-Oocyten, die In-vitro-Fertilisation und die anschließende Embryokultur bis zum Blastozystenstadium.

In-vitro-Reifung, Befruchtung und Kultur von Präimplantationsembryonen der Maus

Ein Protokoll zur Generierung eines Co-Kultursystems, bestehend aus Neuronen, die von induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) abstammen, primären kortikalen Neuronen und Astrozyten wird beschrieben. Dieses Co-Kultursystem ermöglicht den Nachweis der Bildung von synaptischen Kontakten und Schaltkreisen zwischen neuen, iPSC-abgeleiteten Neuronen und bereits vorhandenen kortikalen Neuronen, die Channelrhodopsin-2 exprimieren.

Ein optogenetische Ansatz zur Abschätzung Bildung neuronaler Verbindungen in einer Co-Kultursystem

Die Untersuchung medullärer Thymusepithelzellen in vitro war weitgehend erfolglos, da aktuelle 2D-Kultursysteme das in vivo-Szenario nicht nachahmen. Das hierin beschriebene 3D-Kultursystem - ein modifiziertes organotypisches Hautkulturmodell - hat sich bei der Rekapitulation der mTEC-Proliferation, Differenzierung und Aufrechterhaltung der promiskuitiven Genexpression als überlegen erwiesen.

3D Organotypische Cokulturmodell Unterstützung Mark Thymusepithel Zellproliferation, Differenzierung und Genexpression Promiscuous

Eine vielversprechende Technik, um Gewebe zu generieren baut ohne Verwendung von Matrix an Zellkulturen in simulierter Schwerelosigkeit Zustand ist. Mit einem rotierenden Kultursystem, untersuchten wir Wachstum der Follikel und Eizellreifung Follikel überleben, Morphologie, Wachstums-und Eizelle Funktion unter der Bedingung der simulierten Schwerelosigkeit.

In-vitro- Wachstum der Maus Preantral Follikel in simulierter Schwerelosigkeit

Erfahren Sie die Primärkultur und Ko-Kultur von Maus-Eierstöcken und Eibläschen zur Untersuchung der Follikelentwicklung und Interaktionen. Diese Methode ermöglicht physiologische Entwicklung in vitro.

Kultur und Co-Kultur von Maus Eierstöcke und Eibläschen

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