Manipulation und

Das Ziel des folgenden Experiments besteht darin, mütterliche Proteine, die in Oozyten gespeichert sind, zu reduzieren oder Proteine von Interesse zum Zeitpunkt der Befruchtung von Froscheiern zu überexprimieren. Dies wird erreicht, indem Antisense-Oligos oder mRNA in enzymatisch deregulierte, unreife Oozyten injiziert werden, um ein bestimmtes Protein abzubauen oder zu überexprimieren. In einem zweiten Schritt werden die Oozyten in ein Medium mit Progesteron überführt, das die Reifung der Oozyten zu Eiern induziert.

Anschließend wird Sperma in die in vitro gereiften Eizellen injiziert, um den Effekt der Genabschaltung oder Überexpression auf die embryonale Entwicklung zu beobachten. Letztendlich stellt die Entwicklung der mit Oligonukleotiden injizierten Oozyten bis hin zu schwimmenden Kaulquappen den funktionellen Test der Genabschaltung oder Überexpression dar. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Verwendung von Wirtstieren ist, dass wir den chirurgischen Eingriff am Frosch mithilfe standardisierter Protokolle umgehen können.

Sammeln Sie ein Präparat über SAC mit gesunden Zellen in einer Neun-Zentimeter-Petrischale, die MBS plus ps enthält. Zerlegen Sie dann den Eierstock in quadratische Stücke von ein bis zwei Zentimetern Breite. Sammeln Sie etwa fünf Milliliter des zerkleinerten Eierstocks mit den Zellen in einem neuen 50-Milliliter-Röhrchen.

Spülen Sie die Gewebe anschließend mehrmals mit MBS plus PS und sammeln Sie die Eier in 15 Milliliter frischem MBS plus PS. Geben Sie nun sieben Einheiten Desfoliationsenzym zur Suspension hinzu und inkubieren Sie die Suspension unter sanfter Bewegung, bis die Gewebe zumindest teilweise entlaubt sind. Dies dauert nach der Inkubation mindestens eine Stunde.

Füllen Sie das Reagenzglas mit MBS plus Ps, um die Reaktion zu stoppen. Ziehen Sie die Lösung an die Wand des Reagenzglases und nicht direkt auf die Zellen. Lassen Sie die Gewebe absinken und entfernen Sie die Überstände sowie das Reagenz.

Kleine, unreife Zellen werden schwimmen und sollten ebenfalls verworfen werden. Wiederholen Sie diesen Waschschritt insgesamt zehn Mal nach den Waschungen. Überführen Sie die Zellen in eine 9 cm große Petrischale mit MBS plus ps.

Überführen Sie die Petrischale unter ein Stereomikroskop und halten Sie die Zellen von nun an möglichst bei 16 bis 18 Grad Celsius. Wählen Sie Zellen der Qualität Stufe sechs gemäß der Dumont-Klassifikation mit einer Glaspipette aus, sammeln Sie sie in einer neuen Schale mit MBS plus ps. Eine Zelle guter Qualität sollte eine gleichmäßige Pigmentierung in der animalen Hemisphäre aufweisen und eine klare Trennung zwischen der animale und der vegetativen Hemisphäre zeigen.

Sie sollten außerdem alle etwa die gleiche Größe aufweisen, was einem Durchmesser zwischen 1,2 und 1,4 Millimetern entspricht. Sammeln Sie etwa zwei bis 300 Zellen pro Injektion, insgesamt etwa 1000 Zellen pro Experiment. Die Qualität der O-Stelle ist entscheidend für den Erfolg.

Falls die Oside während der Vorbereitung eine Auffälligkeit aufweisen, empfehle ich, einen Eierstock aus einer anderen Gruppe zu verwenden und erneut zu beginnen. Zum Vorbereiten der Injektion des Antisense-Oligos stellen Sie den Metallkolben eines Mikroinjektors auf die tiefste Position und setzen eine mit Öl gefüllte Glaskapillare auf den Metallkolben auf. Unter einem Stereomikroskop schneiden Sie die Nadelspitze mit einer kleinen chirurgischen Schere ab.

Erstellen Sie eine möglichst kleine Spitze. Als Nächstes Laser. Ein Streifen Paraform auf der Mikroskopbühne und darauf drei Mikroliter Nukleinsäurelösung mit je einem Mikrogramm pro Mikroliter geben.

Füllen Sie damit die Spitze der Nadel. Wenn Luft eingeschlossen wird, sollte die Öffnung vergrößert werden. Machen Sie nun eine sichtbare Markierung an der Injektionsnadel etwa einen halben Millimeter von der Spitze entfernt.

Danach fortfahren, indem zunächst eine Zelle injiziert wird; einen bereich ohne Follikelzellen suchen, an dem die Nadel eindringen kann. Die Spitze entlang der äquatorialen Grenze ansetzen, wobei auf den Mittelpunkt unterhalb der Keimblase gezielt wird. Gleichzeitig die Zelle mit einer Pinzette auf der gegenüberliegenden Seite fixieren.

Verwenden Sie nun die Fußschaltersteuerung, um die Lösung zu spritzen, und injizieren Sie zwischen 4,6 und 9,2 Nanogramm Antisense-Oligos oder zwischen 250 Pikogramm und 13,8 Nanogramm Messenger-RNA. Nachdem alle Zellen injiziert wurden, überführen Sie sie in das Inkubationsmedium und lassen Sie sie mehrere Tage inkubieren, damit Veränderungen in dem Proteasom stattfinden können.

Überführen Sie die Zellen später mit einem minimalen Mediumvolumen in sechs Zentimeter große Agarose-beschichtete Petrischalen, die fünf bis acht Milliliter Reifungsmedium enthalten. Lassen Sie die Zellen anschließend 16 Stunden in diesem Medium entwickeln, bevor Sie sie mit Spermien injizieren. Für dieses Protokoll muss ein gefrorener Spermienbestand vorbereitet werden.

Nach 16-stündiger Inkubation zur Reifung dem Textprotokoll folgen. Die Zellen sehr vorsichtig in eine sechs Zentimeter große, mit Eigelb beschichtete Petrischale mit MBS plus PS überführen, um sie abzuwaschen. Falls die Zellen unsachgemäß behandelt werden, können sie sich vor der Ixy spontan aktivieren.

Zählen Sie nun die reifen Zellen und suchen Sie nach weißen Stellen, die darauf hinweisen, dass die Keimbläschenblase der Zelle zerfallen ist. Wenn weniger als 80 % in Ordnung sind, sind sie insgesamt nicht gesund genug, um das Ixy-Verfahren zu überstehen. Fortfahren.

Füllen Sie eine neue Petrischale mit Injektionsmedium und übertragen Sie nach einer halben Stunde vorsichtig alle Zellen in die Schale. Fahren Sie fort, indem Sie die reifen Zellen mit der Spermienlösung unter Verwendung der gleichen Injektorvorbereitung wie für Oligos injizieren. Ideal sollten sich ein oder zwei Spermien pro 4,6 Nanoliter in der Injektionslösung befinden.

Um diese Injektionslösung zu testen, stellen Sie Tropfen der DPI-Lösung mit 0,3 Mikrogramm DPI pro Milliliter her und injizieren 4,6 Nanoliter in diese Tropfen. Anschließend zählen Sie die Anzahl der Spermien in jedem Tropfen mittels Fluoreszenzmikroskopie. Nach Bestätigung der Spermienkonzentration injizieren Sie die Zellen mit 4,6 Nanolitern der Spermienlösung.

Stellen Sie sicher, dass die Zeit für die Injektion der Lösungen konstant bleibt, und injizieren Sie die Oozyten gleichmäßig mit minimalem Pausieren zwischen den Injektionen. Wechseln Sie nach jeweils 100 Injektionen die Spermienlösung. Nachdem alle reifen Oozyten injiziert wurden, sollte die Petrischale vier bis fünf Stunden lang inkubiert und anschließend untersucht werden.

Für Embryonen, die eine Furchung durchlaufen haben, sind die Furchungsfurchen möglicherweise nicht so deutlich wie bei normal befruchteten Embryonen; überführen Sie alle gefurchten Embryonen in Inkubationsmedium und lassen Sie sie über Nacht inkubieren. Am nächsten Tag sollten die überlebenden Embryonen in 0,1 XMMR zur embryonalen Entwicklung von ixy-Embryonen überführt werden. Die Verwendung in vitro gereifter Oozyten wurde in guten Experimenten untersucht, wobei fast 100 % der Oozyten mit Keimbläschen zeigen eine Reaktion auf Progesteron und Anzeichen der Reifung.

Etwa 25 % durchliefen eine Furchung. 60 bis 80 % der gefurchten Embryonen erreichten das Blastula-Gastrula-Stadium, und ungefähr ein Drittel davon erreichte das schwimmfähige Kaulquappenstadium. Die ixy-Embryonen waren eine Mischung aus normalen und abnormalen Embryonen, was zeigt, dass die Injektion des Antisense-sogo in keimbläschchenhaltige Zellen, gefolgt von IVM und Dixie, eine frühe embryonale Entwicklung ermöglichte.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man mütterliche Proteine vor der Faktorisierung manipuliert.