Name: Manipulation und In-vitro- Ausbau der Xenopus laevis Eizellen, von Intrazytoplasmatische Spermieninjektion gefolgt, um embryonale Entwicklungsstudie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 22 s
Description: Lernen Sie die Manipulation von Xenopus laevis-Oozyten durch Antisense-Oligo- oder mRNA-Injektion zur Untersuchung früher embryonaler Entwicklung. Diese Methode ermöglicht gezielte Gen-Knockdowns und Überexpressionen.

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Wir danken den Mitgliedern des Gurdon-Labors für nützliche Diskussionen. K.M. ist Research Fellow am Wolfson College und wird vom Herchel Smith Postdoctoral Fellowship und der Great Britain Sasakawa Foundation unterstützt. Das Gurdon-Labor wird durch Zuschüsse des Wellcome Trust (RG69899) und des MRC an J.B.G. unterstützt.

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<li>Heasman, J., Kofron, M., Wylie, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta-catenin+signaling+activity+dissected+in+the+early+Xenopus+embryo%3A+a+novel+antisense+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Beta-catenin signaling activity dissected in the early Xenopus embryo: a novel antisense approach.</a> Developmental biology. 222 (1), 124-134 (2000).</li>
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<li>Szenker, E., Lacoste, N., Almouzni, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+developmental+requirement+for+HIRA-dependent+H3.3+deposition+revealed+at+gastrulation+in+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+reports%22%5BJournal%5D)">A developmental requirement for HIRA-dependent H3.3 deposition revealed at gastrulation in Xenopus.</a> Cell reports. 1 (6), 730-740 (2012).</li>
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<li>Halley-Stott, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+nuclear+transplantation+to+Germinal+Vesicle+stage+Xenopus+oocytes+-+a+method+for+quantitative+transcriptional+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Mammalian nuclear transplantation to Germinal Vesicle stage Xenopus oocytes - a method for quantitative transcriptional reprogramming.</a> Methods. 51 (1), 56-65 (2010).</li>
<li>Astrand, C., Belikov, S., Wrange, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+acetylation+characterizes+chromatin+presetting+by+NF1+and+Oct1+and+enhances+glucocorticoid+receptor+binding+to+the+MMTV+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+cell+research%22%5BJournal%5D)">Histone acetylation characterizes chromatin presetting by NF1 and Oct1 and enhances glucocorticoid receptor binding to the MMTV promoter.</a> Experimental cell research. 315 (15), 2604-2615 (2009).</li>
<li>Amaya, E., Kroll, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+generating+transgenic+frog+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">A method for generating transgenic frog embryos.</a> Methods in molecular biology. 97, 393-414 (1999).</li>
<li>Kroll, K. L., Amaya, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+Xenopus+embryos+from+sperm+nuclear+transplantations+reveal+FGF+signaling+requirements+during+gastrulation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Transgenic Xenopus embryos from sperm nuclear transplantations reveal FGF signaling requirements during gastrulation.</a> Development. 122 (10), 3173-3183 (1996).</li>
<li>Smith, S. J., Fairclough, L., Latinkic, B. V., Sparrow, D. B., Mohun, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus+laevis+transgenesis+by+sperm+nuclear+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Xenopus laevis transgenesis by sperm nuclear injection.</a> Nature protocols. 1 (5), 2195-2203 (2006).</li>
<li>Drury, K. C., Schorderet-Slatkine, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+cycloheximide+on+the+%27autocatalytic%27+nature+of+the+maturation+promoting+factor+%28MPF%29+in+oocytes+of+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Effects of cycloheximide on the 'autocatalytic' nature of the maturation promoting factor (MPF) in oocytes of Xenopus laevis.</a> Cell. 4 (3), 269-274 (1975).</li>
<li>Smith, L. D., Ecker, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+oocyte+nucleus+in+physiological+maturation+in+Rana+pipiens%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Role of the oocyte nucleus in physiological maturation in Rana pipiens.</a> Developmental biology. 19 (3), 281-309 (1969).</li>
<li>Miyamoto, K., Pasque, V., Jullien, J., Gurdon, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+actin+polymerization+is+required+for+transcriptional+reprogramming+of+Oct4+by+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+development%22%5BJournal%5D)">Nuclear actin polymerization is required for transcriptional reprogramming of Oct4 by oocytes.</a> Genes & development. 25 (9), 946-958 (2011).</li>
<li>Schneider, P. N., Hulstrand, A. M., Houston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fertilization+of+Xenopus+oocytes+using+the+host+transfer+method%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Fertilization of Xenopus oocytes using the host transfer method.</a> J. Vis. Exp. (45), (2010).</li>
<li>Ishibashi, S., Cliffe, R., Amaya, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+bi-allelic+mutation+rates+using+TALENs+in+Xenopus+tropicalis%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+open%22%5BJournal%5D)">Highly efficient bi-allelic mutation rates using TALENs in Xenopus tropicalis).</a> Biology open. 1 (12), 1273-1276 (2012).</li>
<li>Sakane, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+mutagenesis+of+multiple+and+paralogous+genes+in+Xenopus+laevis+using+two+pairs+of+transcription+activator-like+effector+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Development%2C+growth+%26+differentiation%22%5BJournal%5D)">Targeted mutagenesis of multiple and paralogous genes in Xenopus laevis using two pairs of transcription activator-like effector nucleases.</a> Development, growth & differentiation. 56 (1), 108-114 (2014).</li>
<li>Nakayama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+and+efficient+CRISPR%2FCas9-mediated+targeted+mutagenesis+in+Xenopus+tropicalis%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Simple and efficient CRISPR/Cas9-mediated targeted mutagenesis in Xenopus tropicalis.</a> Genesis. 51 (12), 835-843 (2013).</li>
<li>Guo, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+RNA%2FCas9-mediated+genome+editing+in+Xenopus+tropicalis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Efficient RNA/Cas9-mediated genome editing in Xenopus tropicalis.</a> Development. 141 (3), 707-714 (2014).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Wir hier ausführlich eine neue Methode, um mütterliche Faktoren zum Abbau oder exogene Faktoren vor der Befruchtung überexprimieren. Dieses System erfordert zwei Mikroinjektionen, sondern überspringt die Operation von Fröschen, in der Host-Übertragungsmethode 7,17 verwendet. Es ist optimal, um den Frosch Operation Schritt im Hinblick auf die Pflege der Tiere zu entfernen. Darüber hinaus haben wir nicht zu berücksichtigen, für die Qualität der Gast weiblichen Frösche für die Transferexperimente zu nehmen, was bedeutet, dass wir von einem biologischen Faktor, der den Erfolg der Experimente betrifft loszuwerden. Daher in diesem System die Qualität der Eizellen von PMSG grundiert Frösche erhalten ist ein wichtiger Faktor, der biologischen Schlüssel für erfolgreiche Experimente ist. Die Qualität der Eizellen nach der Entnahme der Eierstöcke oder nach defolliculation beurteilt werden. Wenn irgendeine Abnormalität in diesen Phasen beobachtet wird, ist es optimal, einen weiteren Ovar von neuen Frosches sammeln. Ein weiterer Punkt, wenn man die Qualität der Oozyten zu überprüfen, ist nach Eizellreifung. Wenn weniger als 80% der progesteronE-behandelten Oozyten zeigen Anzeichen von Reife, können Sie nicht in der Lage, die genug Anzahl von Embryonen für weitere Analysen zu erhalten. Die Verwendung von enzymatischen defolliculation statt manuell defolliculation ist auch ein weiterer Vorteil der Verwendung dieses Systems, um die Arbeit für defolliculation reduzieren. Jedoch ist es immer noch möglich, dass eine manuelle defolliculation kann eine besser als der enzymatischen Behandlung. Wie in 3 gezeigt, fast 10% der in vitro gereiften Eizellen können die Schwimm Kaulquappenstadium erreichen. Diese Daten werden aus 13 unabhängigen Experimenten einschließlich der in 8 und neue Injektion Versuche berichtet gesammelt. Host-Übertragungsmethode benötigt 75-150 Oozyten in jeder Behandlung zur Gewinnung von aussagekräftigen Daten, da 30-60% der übertragenen Oozyten können die Neurulastadium 17 zu erreichen. Unsere Methode beginnt normalerweise mit 200-300 Oozyten in jeder Versuchsgruppe seit etwa 40-60% der gespalten Embryonen können die zu erreichenMuskelreaktion Bühne. Diese Daten legen nahe, dass beide Methoden unterstützt eine angemessene Entwicklungsrate. Bisher haben wir erhalten 10 Leben Frösche von Steuer mRNA injiziert und Kontrollantisense-Oligo-injizierten Oozyten mit dieser Technik, was darauf hinweist, dass dieser Ansatz unterstützt die Entwicklung durch Metamorphose. Unsere Oozyte manipulations ICSI Verfahren bietet die Möglichkeit, die Rolle der mütterliche Faktoren in sehr frühen embryonalen Entwicklung zu testen, kurz nach der Befruchtung. Darüber hinaus kann die Überexpression von Chromatin modifizierenden Faktoren vor der Befruchtung ermöglichen es, mütterlichen Chromatin vor der Befruchtung für das Verständnis für die Entwicklung notwendige mütterliche Chromatinzustände umzugestalten. Diese Strategie kann auch gut mit aktuellen Gen-Editing-Systeme wie TALENs (TALEN) 18,19 und CRISPR / CAS9 20,21 da diese schon vor der Befruchtung ausgedrückt werden zu arbeiten. Daher hat unser neuer Ansatz eine potential, für viele Anwendungen in der Zukunft verwendet werden.

Xenopus laevis ist eine weit verbreitete, leistungsfähige Modellorganismus, um die Entwicklung 1 zu untersuchen. Dies liegt daran, Xenopus Eiern ungewöhnlich groß sind (ungefähr 1,2-1,4 mm, im Vergleich zu Säugetier-Gegenstücke etwa 0,1 mm) und reichlich vorhanden. Eier enthalten mütterlich synthetisiert und gespeichert Komponenten, die genug, um die embryonale Entwicklung bis Mitte Blastula Übergang fahren sind (MBT, in der Phase 8-8,5 auftretenden mit 4.000-8.000 Zellen). MBT wird durch zygotischen Genom-Aktivierung, die dann produziert embryonalen Genprodukten Weiterentwicklung direkt verbunden. Zahlreiche Studien zielte darauf ab, mütterliche Faktoren wichtig für die Entwicklung zu identifizieren. Viele Untersuchungen beruhen auf der Injektion von Antisense-Oligonukleotide (Oligos) mit Morpholino-Oligonukleotide in befruchtete Embryonen, wobei Abbau der mütterlichen Proteine ​​können im Gastrula-Stadium 2-4 einzuhalten. Alternativ werden mRNAs befruchteten em injiziertbryonen um Genfunktionen zu stören oder zu Schicksale überexprimiert Proteine ​​zu verfolgen. Jedoch ist die Injektion in die Ein-Zell Embryonen normalerweise nicht beeinflusst Expressionsniveaus von mütterlichen Proteine ​​bei den sehr frühen embryonalen Stadien vor MBT. Heasman und Wylie gründete die Host-Übertragungsverfahren, um dieses Problem zu überwinden, 5. In ihrer Methode werden manuell defollikuliert Oozyten, die mit Antisense-Oligos injiziert und in Wirts Weibchen 6 übertragen. Proteine ​​werden vor der Befruchtung herunterreguliert, so dass die Rollen von regulierte Proteine ​​in frühen embryonalen Entwicklung untersucht werden können. Das mütterliche Abreicherungsverfahren führte zur Identifizierung von mehreren einzigartigen Entwicklungsrollen mütterlicher Proteine, wie in 7 überprüft. In diesem Bericht werden wir ausführlich unsere neu entwickelte Methode, bei der mütterliche Erschöpfung oder Überexpression von mRNA vor der Befruchtung wird ohne manuelle defolliculation und Host-Übertragungs erreicht8. Hand defolliculation erfordert viel Zeit und Host-Übertragungs braucht oft geschickte Techniken und die spezifische Lizenz für Tierchirurgie, wodurch die häufige Verwendung von mütterlichem Erschöpfung Verfahren behindern. Defolliculation und Host-Übertragungs durch enzymatische defolliculation 9,10 und intrazytoplasmatische Spermieninjektion (ICSI) von 11 bis 13 ersetzt sind. ICSI, Eier wurde ursprünglich zur transgenen Fröschen 12 zu produzieren. Sperma und embryonalen Kerne wurden in in vitro gereiften Eizellen Amphibien 11,14,15 transplantiert. Hier zeigen wir unsere Schritt-für-Schritt-Methode, um Spermien in vitro gereiften Eizellen, die waren zu injizieren mit Antisense-Oligos oder pre-mRNA injiziert.

<table><tbody><tr><td>Trächtige Stute Serum Gonadotropin (PMSG) &nbsp;</td><td>MSD Animal Health</td><td>Vm 01708/4309</td><td>PMSG-Intervet 5000iu Pulver und Lösungsmittel zur Herstellung einer Injektionslösung</td></tr><tr><td>Ethyl-3-aminobenzoat-Methansulfonatsalz (MS222)</td><td>Sigma</td><td>A5040</td><td>Für die Anästhesie</td></tr><tr><td>Liberase TM Research Grade</td><td>Roche</td><td>05 401 127 001</td><td>Für die Defollikation von Eizellen. Lagern bei -20&nbsp; &#176;C.</td></tr><tr><td>Drummond Nanoject</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>3-000-205/206</td><td>Für Mikroinjektionsglaskapillaren</td></tr><tr><td></td><td>Alpha Laboratorien</td><td>7" Drummond #3-000-203-G/XL</td><td>Für Mikroinjektion</td></tr><tr><td>Mikropipettenabzieher&nbsp;</td><td>SUTTER Instrument</td><td>Modell D-97</td><td>Für Mikroinjektionen</td></tr><tr><td>UltraPure Agarose</td><td>Invitrogen</td><td>16500-500</td><td>Für in vitro Reifung und ICSI</td></tr><tr><td>14 ml ultraklares Zentrifugenröhrchen&nbsp;</td><td>Beckman Coulter United Kingdom Ltd</td><td>344060</td><td>Für die Spermienreinigung</td></tr><tr><td>OptiPrep Density Gradient Medium (Iodixanol)</td><td>Sigma</td><td>D1556</td><td>Für die Spermienreinigung</td></tr><tr><td>Digitonin</td><td>Sigma</td><td>D141</td><td>Reagenz für die Zellpermeabilisierung</td></tr><tr><td>Shaker</td><td>Hybaid&nbsp;</td><td>HB-SHK-1</td><td>Für die Eizelldefollikulation</td></tr><tr><td>Präpariermikroskop (Stereozoommikroskop)</td><td>ZEISS</td><td>Semi SV6</td><td>Für die Eizellentnahme und Mikroinjektion</td></tr><tr><td>50 &mu; m Porenfilter</td><td>CellTrics</td><td>04-0042-2317</td><td>Für die Spermienreinigung</td></tr><tr><td>Ultrazentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>Optima L-100XP</td><td>Für die Spermienreinigung</td></tr><tr><td>50 ml Zentrifugenröhrchen</td><td>Cellstar Greiner Bio-One</td><td>227261 oder 210261</td><td>Eizellentnahme und Defollikulationsreaktion</td></tr><tr><td>15 ml Zentrifugenröhrchen</td><td>FALCON</td><td>352097</td><td>Für die Spermienreinigung</td></tr><tr><td>90 mm Petri Gericht&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>101VR20/C</td><td></td></tr><tr><td>griffige Zellkulturschale, 60 Zoll x&nbsp; 15 mm</td><td>FALCON</td><td>353004</td><td></td></tr><tr><td>Easy-Grip Zellkulturschale, 35 Zoll x&nbsp; 15 mm</td><td>FALCON</td><td>351008</td><td></td></tr></tbody></table>

manipulation und<em&gt; in-vitro-</em&gt; ausbau der<em&gt; xenopus laevis</em&gt; eizellen, von intrazytoplasmatische spermieninjektion gefolgt, um embryonale entwicklungsstudie

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

Amphibieneier wurden häufig verwendet, um die Embryonalentwicklung zu untersuchen. Die frühe Embryonalentwicklung wird durch maternal gespeicherte Faktoren angetrieben, die sich während der Oogenese ansammeln. Um die Rolle solcher mütterlichen Faktoren in der frühen Embryonalentwicklung zu untersuchen, ist es wünschenswert, ihre Funktionen von Beginn der Embryonalentwicklung an zu manipulieren. Konventionelle Wege der Geninterferenz werden durch die Injektion von Antisense-Oligonukleotiden (Oligos) oder mRNA in befruchtete Eizellen erreicht, die eine Unter- bzw. Überexpression spezifischer Proteine ermöglichen. Diese Methoden benötigen jedoch in der Regel mehr als mehrere Stunden, bis die Proteinexpression beeinflusst ist, so dass die Interferenz der Genfunktionen in den frühen Embryonalstadien nicht wirksam ist. Hier stellen wir ein experimentelles System vor, in dem die Expressionsniveaus von maternalen Proteinen vor der Befruchtung verändert werden können. Xenopus laevis Eizellen, die aus Eierstöcken gewonnen werden, werden durch Inkubation mit Enzymen defollikuliert. Antisense-Oligos oder mRNAs werden im Stadium des Keimvesikels (GV) in defollikulierte Eizellen injiziert. Diese Eizellen werden in vitro im Metaphase-II-Stadium (MII) zu Eizellen gereift, gefolgt von einer intrazytoplasmatischen Spermieninjektion (ICSI). Auf diese Weise können bis zu 10% der ICSI-Embryonen das schwimmende Kaulquappenstadium erreichen, was funktionelle Tests für spezifische Gen-Knockdowns oder Überexpression ermöglicht. Dieser Ansatz kann ein nützlicher Weg sein, um die Rolle maternal gespeicherter Faktoren in der frühen Embryonalentwicklung zu untersuchen.

Embryonalentwicklung ICSI-Embryonen unter Verwendung von in vitro gereiften Eizellen wurde (3A) untersucht. Reifungsgeschwindigkeiten von GV-Oozyten, um den MII Stufe sind variabel und hängt weitgehend von der Qualität der Oozyten. In guten Experimente fast 100% der GV-Oozyten reagieren auf Progesteron und zeigen Anzeichen von Eizellreifung, zuletzt als Eier am MII Stadium. Alle gereiften Eizellen wurden ICSI (7 ohne Oligo-injizierten Oozyten 3A, n = 13 für die Steuerung verwürfelten oligo-injizierten Oocyten und n =) unterzogen und etwa 25% der injizierten Eier abgespalten. Etwa 60% oder 80% des gespaltenen Embryonen aus Steuer oligo-injizierten Oozyten oder nicht injizierten Oozyten erzeugt jeweils erreichte die Blastula / Gastrulastadium. Unter den Blastula / Gastrula Embryonen waren von guter Qualität (fast keine Anzeichen von anomaler Spaltung und Apoptose) etwa die Hälfte der Embryonen in Oligo-Proben injiziert, während 82% der Blastula / Gastrula Embryonen waren von guter Qualität in non-injizierten Proben (3A). Schließlich, 41% und 11% der gespaltenen Embryonen in Oligo-injizierten Proben erreichten die Muskelreaktionen und die Schwimm Kaulquappe Stufen eingesetzt werden, wobei 60% und 29% der gespaltenen Embryonen nicht injizierten Proben war (3A). Diese ICSI-Embryonen werden die Mischung aus normalen und abnormalen Embryonen (3B). Einige von ihnen Metamorphose und zu entwickeln, um Frösche 8 reifen. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die Injektion von Antisense-Oligonukleotide in GV-Oozyten, gefolgt von IVM und ICSI, ermöglicht eine effiziente frühen Embryonalentwicklung. Obwohl die Injektion von Antisense-Oligos selbst abnimmt Embryonalentwicklung, sind wir immer noch in der Lage, genug Embryonen für viele experimentelle Zwecke wie etwa die Überprüfung Entwicklungsraten zu erhalten, RT-PCR, Western-Blot und so weiter. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/52496/52496fig1highres.jpg" /> Feige<html> ure 1: Typische Beispiele für Xenopus laevis Oozyten von guter Qualität oder schlechte Qualität für in-vitro-Reifung Experimente. (A) Ein Beispiel für eine schlechte Qualität Oozyten. Beispielsweise werden Oozyten zeigt fleckige Pigmentierung nicht für nachfolgende Experimente verwendet. Jede Xenopus laevis etwa 1,2-1,4 mm im Durchmesser. (B) Ein teilweise defollikuliert Eizelle. Die rechte Hälfte der Eizelle durch Follikelzellen, die durch das Vorhandensein der Blutgefäße erkennen kann abgedeckt. Ein Pfeil zeigt einen Bereich frei von Follikel-Zellen und in der die Injektionsnadel injiziert wird. (C) Ein Beispiel für gute Qualität Oozyten, die gleich große sind und zeigen, gleichmäßig pigmentierte Tierhalbkugeln mit klaren Kontrast zwischen dem Tier Hemisphäre und der pflanzlichen Hemisphäre. 2496 / 52496fig2highres.jpg &quot;/&gt; Abbildung 2:. Xenopus laevis Oozyten vor und nach der Reifung Nach Eizellreifung, an der Spitze der Tierhälften und Follikelzellen erscheinen klare weiße Flecken sind abgezogen. Jede Xenopus laevis Oozyten ist etwa 1 mm im Durchmesser. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/52496/52496fig3highres.jpg" /> Abbildung 3: Entwicklung der ICSI-Embryonen aus in vitro gereiften Eizellen produziert. (A) Entwicklung von ICSI-Embryonen auf jeder Stufe zusammengefasst. Oocyten injiziert mit Steuer verwürfelten Antisense-Oligonukleotide (Oligo Steuereinspritzung) oder ohne Injektion (non-Injektion), gefolgt von IVM und ICSI. Die entsprechende Anzahl von Embryonen in jeder Stufe oberhalb der Balken dargestellt. Mittelwert ± SEM dargestellt. N = 4-13 unabhängigen Experimenten / verschiedene females. (B) Beispiele für überlebende ICSI-Embryonen. Diese Schwanzknospen-Embryonen wurden in einem Experiment, bei dem etwa 200 Oozyten wurden als Ausgangsmaterial verwendet wird produziert.

Wir beschreiben Methoden zur Manipulation unreifer Eizellen von Xenopus laevis, zur In-vitro-Reifung von Eizellen zu Eizellen und zur intrazytoplasmatischen Spermieninjektion. Dieses Protokoll ermöglicht den Abbau einiger mütterlicher Proteine und die Überexpression von Genen von Interesse während der Befruchtung und ist daher wertvoll, um die Rolle spezifischer Faktoren in der frühen Embryonalentwicklung zu untersuchen.

Manipulation und<em&gt; In-vitro-</em&gt; Ausbau der<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Eizellen, von Intrazytoplasmatische Spermieninjektion gefolgt, um embryonale Entwicklungsstudie

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during ...

Das Ziel des folgenden Experiments besteht darin, mütterliche Proteine, die in Oozyten gespeichert sind, zu reduzieren oder Proteine von Interesse zum Zeitpunkt der Befruchtung von Froscheiern zu überexprimieren. Dies wird erreicht, indem Antisense-Oligos oder mRNA in enzymatisch deregulierte, unreife Oozyten injiziert werden, um ein bestimmtes Protein abzubauen oder zu überexprimieren. In einem zweiten Schritt werden die Oozyten in ein Medium mit Progesteron überführt, das die Reifung der Oozyten zu Eiern induziert.Anschließend wird Sperma in die in vitro gereiften Eizellen injiziert, um den Effekt der Genabschaltung oder Überexpression auf die embryonale Entwicklung zu beobachten. Letztendlich stellt die Entwicklung der mit Oligonukleotiden injizierten Oozyten bis hin zu schwimmenden Kaulquappen den funktionellen Test der Genabschaltung oder Überexpression dar. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Verwendung von Wirtstieren ist, dass wir den chirurgischen Eingriff am Frosch mithilfe standardisierter Protokolle umgehen können.Sammeln Sie ein Präparat über SAC mit gesunden Zellen in einer Neun-Zentimeter-Petrischale, die MBS plus ps enthält. Zerlegen Sie dann den Eierstock in quadratische Stücke von ein bis zwei Zentimetern Breite. Sammeln Sie etwa fünf Milliliter des zerkleinerten Eierstocks mit den Zellen in einem neuen 50-Milliliter-Röhrchen.Spülen Sie die Gewebe anschließend mehrmals mit MBS plus PS und sammeln Sie die Eier in 15 Milliliter frischem MBS plus PS. Geben Sie nun sieben Einheiten Desfoliationsenzym zur Suspension hinzu und inkubieren Sie die Suspension unter sanfter Bewegung, bis die Gewebe zumindest teilweise entlaubt sind. Dies dauert nach der Inkubation mindestens eine Stunde.Füllen Sie das Reagenzglas mit MBS plus Ps, um die Reaktion zu stoppen. Ziehen Sie die Lösung an die Wand des Reagenzglases und nicht direkt auf die Zellen. Lassen Sie die Gewebe absinken und entfernen Sie die Überstände sowie das Reagenz.Kleine, unreife Zellen werden schwimmen und sollten ebenfalls verworfen werden. Wiederholen Sie diesen Waschschritt insgesamt zehn Mal nach den Waschungen. Überführen Sie die Zellen in eine 9 cm große Petrischale mit MBS plus ps.Überführen Sie die Petrischale unter ein Stereomikroskop und halten Sie die Zellen von nun an möglichst bei 16 bis 18 Grad Celsius. Wählen Sie Zellen der Qualität Stufe sechs gemäß der Dumont-Klassifikation mit einer Glaspipette aus, sammeln Sie sie in einer neuen Schale mit MBS plus ps. Eine Zelle guter Qualität sollte eine gleichmäßige Pigmentierung in der animalen Hemisphäre aufweisen und eine klare Trennung zwischen der animale und der vegetativen Hemisphäre zeigen.Sie sollten außerdem alle etwa die gleiche Größe aufweisen, was einem Durchmesser zwischen 1,2 und 1,4 Millimetern entspricht. Sammeln Sie etwa zwei bis 300 Zellen pro Injektion, insgesamt etwa 1000 Zellen pro Experiment. Die Qualität der O-Stelle ist entscheidend für den Erfolg.Falls die Oside während der Vorbereitung eine Auffälligkeit aufweisen, empfehle ich, einen Eierstock aus einer anderen Gruppe zu verwenden und erneut zu beginnen. Zum Vorbereiten der Injektion des Antisense-Oligos stellen Sie den Metallkolben eines Mikroinjektors auf die tiefste Position und setzen eine mit Öl gefüllte Glaskapillare auf den Metallkolben auf. Unter einem Stereomikroskop schneiden Sie die Nadelspitze mit einer kleinen chirurgischen Schere ab.Erstellen Sie eine möglichst kleine Spitze. Als Nächstes Laser. Ein Streifen Paraform auf der Mikroskopbühne und darauf drei Mikroliter Nukleinsäurelösung mit je einem Mikrogramm pro Mikroliter geben.Füllen Sie damit die Spitze der Nadel. Wenn Luft eingeschlossen wird, sollte die Öffnung vergrößert werden. Machen Sie nun eine sichtbare Markierung an der Injektionsnadel etwa einen halben Millimeter von der Spitze entfernt.Danach fortfahren, indem zunächst eine Zelle injiziert wird; einen bereich ohne Follikelzellen suchen, an dem die Nadel eindringen kann. Die Spitze entlang der äquatorialen Grenze ansetzen, wobei auf den Mittelpunkt unterhalb der Keimblase gezielt wird. Gleichzeitig die Zelle mit einer Pinzette auf der gegenüberliegenden Seite fixieren.Verwenden Sie nun die Fußschaltersteuerung, um die Lösung zu spritzen, und injizieren Sie zwischen 4,6 und 9,2 Nanogramm Antisense-Oligos oder zwischen 250 Pikogramm und 13,8 Nanogramm Messenger-RNA. Nachdem alle Zellen injiziert wurden, überführen Sie sie in das Inkubationsmedium und lassen Sie sie mehrere Tage inkubieren, damit Veränderungen in dem Proteasom stattfinden können.Überführen Sie die Zellen später mit einem minimalen Mediumvolumen in sechs Zentimeter große Agarose-beschichtete Petrischalen, die fünf bis acht Milliliter Reifungsmedium enthalten. Lassen Sie die Zellen anschließend 16 Stunden in diesem Medium entwickeln, bevor Sie sie mit Spermien injizieren. Für dieses Protokoll muss ein gefrorener Spermienbestand vorbereitet werden.Nach 16-stündiger Inkubation zur Reifung dem Textprotokoll folgen. Die Zellen sehr vorsichtig in eine sechs Zentimeter große, mit Eigelb beschichtete Petrischale mit MBS plus PS überführen, um sie abzuwaschen. Falls die Zellen unsachgemäß behandelt werden, können sie sich vor der Ixy spontan aktivieren.Zählen Sie nun die reifen Zellen und suchen Sie nach weißen Stellen, die darauf hinweisen, dass die Keimbläschenblase der Zelle zerfallen ist. Wenn weniger als 80 % in Ordnung sind, sind sie insgesamt nicht gesund genug, um das Ixy-Verfahren zu überstehen. Fortfahren.Füllen Sie eine neue Petrischale mit Injektionsmedium und übertragen Sie nach einer halben Stunde vorsichtig alle Zellen in die Schale. Fahren Sie fort, indem Sie die reifen Zellen mit der Spermienlösung unter Verwendung der gleichen Injektorvorbereitung wie für Oligos injizieren. Ideal sollten sich ein oder zwei Spermien pro 4,6 Nanoliter in der Injektionslösung befinden.Um diese Injektionslösung zu testen, stellen Sie Tropfen der DPI-Lösung mit 0,3 Mikrogramm DPI pro Milliliter her und injizieren 4,6 Nanoliter in diese Tropfen. Anschließend zählen Sie die Anzahl der Spermien in jedem Tropfen mittels Fluoreszenzmikroskopie. Nach Bestätigung der Spermienkonzentration injizieren Sie die Zellen mit 4,6 Nanolitern der Spermienlösung.Stellen Sie sicher, dass die Zeit für die Injektion der Lösungen konstant bleibt, und injizieren Sie die Oozyten gleichmäßig mit minimalem Pausieren zwischen den Injektionen. Wechseln Sie nach jeweils 100 Injektionen die Spermienlösung. Nachdem alle reifen Oozyten injiziert wurden, sollte die Petrischale vier bis fünf Stunden lang inkubiert und anschließend untersucht werden.Für Embryonen, die eine Furchung durchlaufen haben, sind die Furchungsfurchen möglicherweise nicht so deutlich wie bei normal befruchteten Embryonen; überführen Sie alle gefurchten Embryonen in Inkubationsmedium und lassen Sie sie über Nacht inkubieren. Am nächsten Tag sollten die überlebenden Embryonen in 0,1 XMMR zur embryonalen Entwicklung von ixy-Embryonen überführt werden. Die Verwendung in vitro gereifter Oozyten wurde in guten Experimenten untersucht, wobei fast 100 % der Oozyten mit Keimbläschen zeigen eine Reaktion auf Progesteron und Anzeichen der Reifung.Etwa 25 % durchliefen eine Furchung. 60 bis 80 % der gefurchten Embryonen erreichten das Blastula-Gastrula-Stadium, und ungefähr ein Drittel davon erreichte das schwimmfähige Kaulquappenstadium. Die ixy-Embryonen waren eine Mischung aus normalen und abnormalen Embryonen, was zeigt, dass die Injektion des Antisense-sogo in keimbläschchenhaltige Zellen, gefolgt von IVM und Dixie, eine frühe embryonale Entwicklung ermöglichte.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man mütterliche Proteine vor der Faktorisierung manipuliert.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Mikroinjektion von Xenopus laevis Oozyten

Die Befruchtung der Xenopus Oozyten Über den Host-Transfer-Methode

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Mittels konfokaler Analyse<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Um Modulatoren der Wnt und Shh Morphogen Gradienten Untersuchen

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Manipulation und In-vitro- Ausbau der Xenopus laevis Eizellen, von Intrazytoplasmatische Spermieninjektion gefolgt, um embryonale Entwicklungsstudie (Video) | JoVE Journal

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