Die Messung der Aktivität in der Larven Drosophila Activity Monitor

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Larvenaktivität ohne den Einsatz komplizierter Videoanalysesoftware zu analysieren. Dies wird erreicht, indem ausgewählte Larven zunächst in einen Netzfilter überführt werden, um Schmutz zu entfernen. Anschließend werden die einzelnen Larven in Untersuchungsröhrchen überführt, wo sie durch Schneckenstopfen gesichert werden, die in einen Drosophila-Aktivitätsmonitor oder eine Muttervorrichtung eingeführt werden.

Nach drei bis fünf Minuten Eingewöhnung werden die Aufzeichnungen aus dem DAM-System zur Analyse entnommen. Letztendlich können die von den Muttertieren gemessenen Larvenbewegungen verwendet werden, um verschiedene Aktivitätsparameter für einen bestimmten Genotyp zu analysieren. Ein Vorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden ist, dass sie automatisiert und objektiv ist.

Obwohl es für routinemäßige Aktivitätsmessungen einfach genug ist, verfügen viele Labore bereits über die notwendige Ausrüstung, die leicht für den Einsatz an Larven angepasst werden kann. Das Verfahren wird von Aiden McFarlin, einem Studenten aus meinem Labor, demonstriert. Dieses Protokoll verwendet ein M-Gerät mit fünf Mehrstrahl-Drosophila-Aktivitätsmonitoren oder einen Muttertier.

Um den Damm einzurichten. Verbinden Sie zunächst den Monitor über das CAB-Six-Telefonkabel mit der Netzteil-Schnittstelleneinheit oder der PSIU. Schließen Sie dann die PSIU an eine Steckdose an.

Ein grünes Licht zeigt eine entsprechende Verbindung an. Drittens, verbinden Sie die PSIU über ein USB-Kabel mit einem Computer zur Datenaufzeichnung. Installieren und öffnen Sie nun das Programm DAM-System MB one V six X auf dem Rechner.

Beim Öffnen der Software beginnt sie automatisch mit der Datenaufzeichnung in der Softwaresteuerung. Stellen Sie für den Damm das gewünschte Aufzeichnungsintervall ein. Wählen Sie die Einstellungen und klicken Sie dann über oder unter der Option für das Leseintervall, um verschiedene Zeiträume auszuwählen, in denen die Daten gespeichert werden sollen.

Es gibt eine Vielzahl weiterer Parameter, die unter Einstellungen und unter Ausgabedatentyp festgelegt werden können. Jeder Parameter bietet eine einzigartige Analyse der Larvenaktivität im Röhrchen. Es wird empfohlen, dass alle Parameter vor der Datenerfassung ausgewählt werden.

Wenn Sie sich nicht sicher sind, welchen Parameter Sie für diesen Assay messen möchten, bereiten Sie ein Fläschchen mit Futterlarven für jeden Genotyp vor, der für den Assay vorgesehen ist. Verwenden Sie eine Standardumgebung und fliegendes Futter, um die Untersuchungsröhrchen vorzubereiten. Gießen Sie eine 4%ige Schneckenlösung bis zu einer Tiefe von 1,5 Zentimetern in eine Petrischale.

Dies wird zum Pfropfenmaterial für das Analyseröhrchen, das zu dicht ist, um darin eingegraben zu werden. Stellen Sie anschließend sicher, dass die Schläuche sauber und frei sind, indem Sie sie mit heißem Wasser auswaschen. Erhitzen Sie anschließend eine Quetschflasche mit 100 Millilitern Wasser in der Mikrowelle für 10 bis 15 Sekunden oder bis Kondenswasser auftritt.

Drehen Sie dann die Flasche um und drücken Sie die warme, feuchte Luft vorsichtig in das Analyseröhrchen. Wenn eine dünne Kondensatschicht an der Wand des Rohrs erscheint, ist es ausreichend feucht. Nehmen Sie dann die Gelscheibe aus der Schale und legen Sie sie auf eine Netzoberfläche, an der sie nicht fest haftet.

Um die Larven zu sammeln, bereiten Sie einen Netzfilter vor, indem Sie Nylongewebe in Siebdruckqualität über einen Trichter spannen. Befestigen Sie das Netz mit einem Gummiband am Trichterhals und positionieren Sie den Trichter in einem Becherglas. Schöpfen Sie nun einen Spatel voll mit Futter mit Futterlarven aus der Kulturflasche und geben Sie diese in den Netzfilter.

Waschen Sie das Futter mit Zimmertemperatur und Leitungswasser von den Larven ab, einzelne Larven können mit einem Pinsel vom Netz abgeholt werden. Übertragen Sie die Larven etwa 1,5 Zoll in ein feuchtes Untersuchungsröhrchen. Versiegeln Sie dann das Rohr, indem Sie es mit einer Schnecke verstopfen.

Dies geschieht, indem ein Ende der Tube zweimal in das Gel gedrückt wird und das andere Ende. Sobald der Druck einen der beiden Stopfen am gegenüberliegenden Ende herausdrückt, während die Rohre geladen sind, setzen Sie sie in den Damm ein. Passen Sie dann die Position jedes Rohrs so an, dass sich das Tier nicht außerhalb der Reichweite der Sensoren bewegen kann.

Befestigen Sie dann die Schläuche mit einem Ring aus Kitt am Gerät. Zeichnen Sie die LAVAS-Aktivität in einem 20-Grad-Inkubator auf, um ungenaue Messwerte zu vermeiden, die aufgrund von Schatten, Leuchtstofflampen oder Temperaturschwankungen im Labor auftreten können. Im Inkubator.

Verwenden Sie während der Aufnahme LED-Beleuchtung, die nicht fluoreszierend ist. Lassen Sie die Larven vor dem Sammeln von Daten fünf Minuten lang akklimatisieren. Es kann sinnvoll sein, einen Versuch ohne Tiere durchzuführen, um sicherzustellen, dass die Lichtverhältnisse die DAM-Sensoren nicht auslösen.

Starten Sie nach fünf Minuten die vorkonfigurierte DAM-Software, um die Aufzeichnung zu starten. Der Assay kann 30 Minuten lang ohne zusätzliche Kondensation oder Nahrung fortgesetzt werden. Es ist wichtig, dass vor der Aufzeichnung der Aktivitätsparameter, der für die Analyse bestimmt ist, unter Einstellungen ausgewählt wurde.

Wenn diese Option nicht ausgewählt ist, steht diese Aktivität nicht für die Post-hoc-Analyse zur Verfügung. Nachdem die gewünschte Aufzeichnungszeit abgeschlossen ist, schließen Sie die DAM-Software, werden die Daten automatisch im Datenordner des dam-Systems gespeichert. Übertragen Sie die Datendatei in einen separaten Ordner, damit sie später verarbeitet werden kann.

Die Analyseröhrchen können zur Wiederverwendung mit kochendem Wasser gereinigt werden. Um die Rohdaten in ein verständliches Format zu bringen, öffnen Sie die Anwendung zum Scannen von DAM-Dateien und wählen Sie aus. Wählen Sie den Eingabedatenordner aus, wählen Sie dann den Datenordner und die gewünschte Datei aus und wählen Sie die Option Scannen.

Wählen Sie abschließend die Bin-Länge für den gewünschten Lesezeitraum aus. Dadurch werden die Rohdaten in vom Bediener festgelegten Parametern organisiert. Wählen Sie nun den Ausgabedatentyp aus, um die gewünschte Bewegungseinstellung zu analysieren.

Wenn die Bin-Länge größer ist als das ausgewählte Leseintervall des Systems, gehen Sie unter das Menü "Zusätzliche Messwerte" und wählen Sie die Option "Zwei Summe in Bins" auswählen. Speichern Sie anschließend die Datei unter einem entsprechenden Namen in demselben Ordner, in den die Rohdaten übertragen wurden. Öffnen Sie die gespeicherte Datei mit einem Standard-Tabellenkalkulationsprogramm.

Je nach analysiertem Datentyp muss die Tabelle unterschiedlich gelesen werden. In der Regel wird zur Messung von Bewegungen oder Zählungen der Zeitraum der Studie numerisch aufgezeichnet, während jede einzelne Leseröhre einen bestimmten Buchstaben erhält. Normalerweise stellen die Spalten K bis Z die Schlitze für die Analyseröhrchen dar, und die Zeilen stellen die gesammelten Datenpunkte dar.

Wenn z. B. Züge 20 Minuten lang erfasst wurden, wird in einer Minute in den Intervallen der Durchschnitt der 20 Zeilen ermittelt, um die durchschnittliche Anzahl von Zügen pro Minute und andere Messungen zu berechnen. Eine Temperaturreaktionsstudie an Larven des dritten Stadiums des Stammes W 1 1 1 8 wurde mit dem Überwachungsgerät durchgeführt, um Unterschiede in der Fortbewegung der Larve und der Fortbewegung zu erkennen. Bei sieben verschiedenen Temperaturen wurde jede Larve 20 Minuten lang analysiert.

Offensichtlich wurden die Larven deutlich aktiver, als sich die Umgebung erwärmte. Zum Vergleich wurde eine hypoaktive Mutante des Stammes W 1 1 18 getestet, die als inaktiv bezeichnet wurde. Die Analyse zeigte, dass inaktive Larven signifikant weniger mobil waren als eine Kontrolle, um die Nachweisgrenzen des Assays zu testen.

Es wurde ein Vergleich der Larven in verschiedenen Stadien durchgeführt, obwohl sie bei den Sternlarven viel kleiner als ein Drittel waren. Die Aktivität der ersten und zweiten in Sternlarven war in der Tat nachweisbar und messbar, wenn man die Veränderungen der Aktivität mit der Zeit im Gerät untersuchte. Es zeigte sich, dass die Aktivität der dritten in Sternlarven in jeder Minute des 20-minütigen Assays relativ konstant blieb.

Sobald dieses Protokoll beherrscht wird, bietet es eine genaue, einfache und kostengünstige Methode zur Bewertung grundlegender Parameter der Larvenaktivität unter einer Vielzahl von experimentellen Bedingungen.