In vivo und ex vivo Ansätze für Eierstockkrebs Metastatische Colonization von Milky Punktstrukturen in Peritoneal Fettgewebe Studieren

Wir skizzieren ein Protokoll, das sowohl in vivo als auch ex vivo Ansätze zur Untersuchung der Besiedlung von peritonealem Fettgewebe, insbesondere des Omentums, bei Eierstockkrebs implementiert. Darüber hinaus stellen wir ein Protokoll zur Quantifizierung und Analyse von Immunzellstrukturen im Omentum vor, die als Milchflecken bekannt sind und Metastasen des Peritonealfettgewebes begünstigen.

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Verwendung von Standardtechniken zur Quantifizierung der Besiedlung von peritonealen Fettdepots bei Eierstockkrebs zu demonstrieren. Dies wird durch intraperitoneale Injektion von Eierstockkrebszellen in Mäuse erreicht, nachdem die Mäuse zu bestimmten Zeitpunkten getötet wurden. Peritoneale Fettdepots werden identifiziert und aus den Mäusen isoliert.

Schließlich wird die Anzahl der Eierstockkrebszellen, die in spezifischen Fettdepots vorhanden sind, mittels Durchflusszytometrie quantifiziert. Zusätzlich zu mechanismusbasierten Studien kann die Besiedlung von Eierstockkrebszellen auch in ex vivo Co-Kultur untersucht werden, gefolgt von geeigneten quantitativen und/oder molekularen Analysen. Letztendlich ermöglichen diese in vivo und ex vivo Ansätze die Untersuchung von Prozessen, die an der Besiedlung von Peritonealfett mit Eierstockkrebszellen beteiligt sind, mit qualitativen oder quantitativen Methoden.

Der Hauptvorteil dieses Ansatzes besteht darin, dass wir in der Lage sind, Standardtechniken zu implementieren, um spezifische Schritte bei der metastasierenden Besiedlung des Peritonealfettgewebes mit ovt-Krebs zu bewerten. Die Auswirkungen der Technik erweitern die Metastasenprävention. Insbesondere ermöglicht es die Identifizierung von Wechselwirkungen zwischen Krebszellen und der Mikroumgebung, die das Wachstum von Eierstockkrebszellen innerhalb von Immunzellen regulieren, die als Milchflecken bekannt sind.

Im Allgemeinen wird es für Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, hilfreich sein, Erfahrung im Umgang mit Mäusen zu haben. Obwohl intraperitoneale Injektionen scheinbar unkompliziert sind, kann das Fehlen einer guten Technik zu ungenauen Daten führen. Darüber hinaus erfordert die Dissoziation des Gewebes in Einzelzellsuspensionen Übung und sorgfältige Planung vor Beginn des Experiments.

Bei dieser speziellen Technik müssen die Tiere nicht unter Narkose stehen. Führen Sie diese Technik gemäß den genehmigten Protokollen an lebenden Tieren durch. Geben Sie 500 Mikroliter der fluoreszenzmarkierten Einzelzellsuspension in die Spritze.

Geben Sie dann die Spritze in eine sterile 25-Gauge-Nadel mit Deckel, um die Zellscherung vor der Injektion zu reduzieren. Halten Sie die Maus mit der anderen Hand fest, fassen Sie sie am Nacken und halten Sie den Schwanz mit der Handfläche und dem Zeigefinger fest. Fixieren Sie dann das linke Hinterbein zwischen Ring- und kleinem Finger, um eine Traumatisierung der Bauchorgane zu vermeiden.

Halten Sie die Maus gut fest, damit sie sich während der Injektion nicht bewegen kann. Stellen Sie sich eine Linie quer durch den Bauch vor und lokalisieren Sie einen Punkt auf der rechten Seite des Tieres und in der Nähe der Mittellinie. Der Eintrittspunkt ist kranial zwei und leicht medial der letzten Brustwarze.

Bereiten Sie sich darauf vor, die Nadel auf der rechten Seite der Maus einzuführen, um den Blinddarm zu vermeiden und das Risiko einer Durchstichung des Darms zu verringern. Führen Sie die Nadel im unteren seitlichen Bereich des Bauches der Maus bis zu einer Tiefe von etwa 0,5 Zentimetern ein. Ziehen Sie den Kolben zurück, um sicherzustellen, dass die Nadel nicht in ein Blutgefäß oder andere Bauchfellorgane eingedrungen ist.

Wenn keine Flüssigkeit angesaugt wird, injizieren Sie die Probe mit langsamem, gleichmäßigem Druck. Ziehen Sie dann die Nadel zurück und setzen Sie die Maus wieder in ihren Käfig ein. Verschließen Sie die Spritze nicht, bevor Sie sie in den Behälter für scharfe Gegenstände werfen.

Opfern Sie die Mäuse zu bestimmten Zeitpunkten nach der Injektion für die Entnahme lebenswichtiger Organe. Wie im Textprotokoll beschrieben, stellt die Entnahme von Bauchfellfettdepots die Entnahme innerer Organe dar. Machen Sie einen Mittellinienschnitt in der Nähe des Leistenpapus durch die Peritonealwand, um die inneren Organe freizulegen und das omentale Fett zu entfernen.

Legen Sie den omentalen Pankreaskomplex frei, indem Sie die Milz aus der Bauchhöhle mit einer Pinzette für das Gonadenfett verlängern. Heben Sie mit einer Pinzette das Gonadenfett an, das die Eierstöcke umgibt, und entfernen Sie es, indem Sie die Gewebeverbindungen durchtrennen. Sofort. Legen Sie die Taschentücher in eiskaltes PBS.

Entfernen Sie anschließend das Gebärmutterfett, indem Sie das Gebärmutterfett, das die Gebärmutterhörner umgeben, mit einer Zange anheben und die Gewebeverbindungen durchtrennen, bevor Sie das Gewebe sofort in eiskaltes PBS legen. Bei der Gewinnung des Mesenterialfetts wird die Verbindung zwischen dem Dünndarm und dem Pylorus durchtrennt. Fassen Sie das freie Ende des Dünndarms mit einer Pinzette fest und schälen Sie es langsam vom Mesenterialfett ab.

Lösen Sie das Mesenterialfett mit einer Präparierschere aus der Mesenterialwurzel. Legen Sie die Taschentücher dann sofort in eiskaltes PBS. Um schließlich das Pleo-Pfortaderfett zu entfernen, heben Sie das distale Ende der Milz mit einer Pinzette an, um das dünne Fettband des Gewebes freizulegen, das den Hilum der Milz mit der Bauchspeicheldrüse verbindet.

Entfernen Sie das Pleo-Portalfett, indem Sie es zuerst aus der Bauchspeicheldrüse lösen und dann vorsichtig von der Milz abtrennen. Legen Sie dann sofort das Gewebe in PBS, um mit dem Gewicht zu beginnen. Ordnen Sie das gesamte Fettgewebe dem Omentum zu.

Das Gewebe wird in separate fünf Milliliter-Röhrchen überführt, die 1,5 Milliliter serumfreie ECCOs, modifiziertes Eagles-Medium oder DMEM und 0,1 % Rinderserumalbumin enthalten. Bündeln Sie die Gewebe, die von drei unabhängigen Mäusen entnommen wurden, um eine ausreichende Ausbeute an Zellen für die Durchflusszytometrie zu gewährleisten. Als nächstes hacken Sie das Gewebe mit einer chirurgischen Schere und fügen Sie 1,5 Milliliter serumfreies DMEM mit 0,4% Kollagenase hinzu.

Inkubieren Sie die Gewebesuspension 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius mit Rotationsmischen als optionalem Schritt. Dissoziieren Sie das Gewebe weiter durch Kauen. Übertragen Sie in diesem Fall die Gewebekollagenase-Suspension in einen Mikromagen oder -beutel und kauen Sie 10 Minuten lang auf niedriger Stufe und drehen Sie die Ausrichtung der Beutel nach fünf Minuten.

Filtern Sie anschließend die Proben durch einen Nylon-Netzfilter, um große Ablagerungen zu entfernen. Entnehmen Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 250 mal G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius und verwerfen Sie die überstehende Fraktion. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 100 Mikrolitern PBS in Kombination mit 900 Mikrolitern Ammoniumchlorid, Kaliumlyse, Puffer und inkubieren Sie eine Minute lang bei Raumtemperatur.

Zentrifugieren Sie dann die Zellen erneut wie zuvor und verwerfen Sie den Überstand nach der Reanimation, suspendieren Sie das Zellpellet in 250 Mikrolitern eiskaltem PBS-Filtrieren Sie die Proben durch ein 60-Mikron-Nylonnetz, um eine Einzelzellsuspension zu gewährleisten. Spülen Sie dann den Filter mit 250 Mikrolitern eiskaltem PBS grow und bereiten Sie fluoreszenzmarkierte Zellen und Reanimationen vor. Suspendieren Sie bei einer Konzentration von 2 Millionen Zellen pro Milliliter.

Tragen Sie etwa sechs Mikroliter des Gewebeklebers auf die Membran der Kultur auf. Einsetzen und an der Luft trocknen lassen. Waschen Sie die Membran dann zweimal mit sterilem Wasser, um überschüssigen Klebstoff zu entfernen. Bevor Sie die Membranen unter einer Laminarhaube an der Luft trocknen, schneiden Sie das OA vorsichtig aus und befestigen Sie es mit einer sterilen Pinzette an der mit Klebstoff beschichteten Membran

Nachdem Sie das Gewebe eine Minute lang an der Membran haften gelassen haben, geben Sie 500 Mikroliter der Zellsuspension auf jedes Omentum in jedem Kultureinsatz. Füllen Sie dann den Bereich um die Transwell-Kammer mit 2,5 Millilitern DMEF 12 Medien. Inkubieren Sie das OA mit Zellsuspension für sechs Stunden bei 37 Grad Celsius in einer Umgebung mit 5 % CO2.

Entfernen Sie vorsichtig das OA und waschen Sie es mit etwa 10 Millilitern PBS. Visualisieren Sie schließlich fluoreszierende Krebszellherde mit einem geeigneten Fluoreszenzbildgebungssystem. Die relative Lage der peritonealen Fettdepots kann durch grobe anatomische Dissektion dargestellt werden.

Hier sehen Sie einen genaueren Blick auf das Pleo-Portal und das omentale Fettgewebe. Hier sind die relativen Größen der exzidierten Fettdepots dargestellt. Milchige Flecken werden bei omentalem und Pleo-Portalabei mit Hilfe der Standard-Histologie beobachtet.

Gezeigt werden quantitative Ergebnisse aus der Flussanalyse verschiedener Bauchfettdepots. Die Gating-Kriterien für die Analysen sind hier dargestellt. Als Negativkontrolle wurden Ideate-Elternzellen verwendet.

Omentale Gewebepräparate enthielten eine signifikante Population von TD-Tomaten-positiven Zellen im Verhältnis zum Uterusmesentär- und Gonadenfett. Bei der quantifizierten Durchflusszytometrie werden die Daten als mittlere Faltungsänderung, Zunahme der positiven Ereignisse von TD-Tomaten im Vergleich zu PBS-injizierten Mäusen in vivo und ex vivo Besiedlung von OA durch SKV drei, IP eins GFP-Eierstockkrebszellen ist hier dargestellt. Die Fluoreszenzbildgebung von ganzer OA zeigte ähnliche Besiedlungsmuster der Lokalisierung von Krebszellen sowohl in in vivo als auch in ex vivo Assays.

Die histologische Untersuchung dieser Gewebe bestätigte das Vorhandensein von Krebszellen, die an den milchigen Flecken lokalisiert waren. Schließlich bestätigt der immunhistochemische Nachweis von Cytokeratin, das von SKO V drei IP 1 GFP-Zellen exprimiert wird, diese histologischen Befunde. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, peritoneales Fettgewebe zu identifizieren und sorgfältig zu entfernen und eine Kontamination durch andere Gewebetypen zu verhindern, die dann die quantitativen Daten aus der Durchflusszytometrie verzerren.

Zweitens ist es wichtig, daran zu denken, meine Stämme für die betreffende Studie auszuwählen. Die Technik kann verwendet werden, um Interaktionen von gut etablierten Ovarialkarzinomzelllinien in der Omentum-Mikroumgebung zu identifizieren, die für die Metastasenbildung wichtig sind. Es kann auch verwendet werden, um das maligne Potenzial von Zelllinien zu bewerten, die frühe Läsionen in den Eileitern modellieren.