Untersuchung von Blut Zellpopulationen des Drosophila melanogaster Larva

Drosophila-Blutzellen oder Hämozyten zirkulieren zwischen den ansässigen Stellen und der Zirkulation. In der Larve sind residente (sitzende) Hämozyten in induktiven Mikroumgebungen, den hämatopoetischen Taschen, lokalisiert, während sich zirkulierende Hämozyten frei in der Hämolymphe bewegen. Das Ziel dieses Protokolls ist die standardisierte Isolierung und Quantifizierung dieser beiden verhaltensverschiedenen, aber sich gegenseitig verändernden Hämozytenpopulationen.

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die zirkulierenden und residenten Blutzellpopulationen aus einzelnen Drosophila-Larven zu isolieren und zu quantifizieren. Dies wird erreicht, indem zunächst die zirkulierenden Zyten durch definierte Schnitte in der Körperwand der Larve sanft entlüftet werden. Der zweite Schritt besteht darin, die Population der ansässigen Blutzellen aus den hämatopoetischen Taschen zwischen der Epidermis der Larve und den Muskelschichten zu lösen, was ein Schaben oder Stechen mit einer Nadel oder einem anderen Präparierwerkzeug erfordert.

Alle im Larvenkadaver verbleibenden Hämozyten werden gezählt und die freigesetzten Blutzellen werden auf den Objektträgern abgebildet, wo die Larven seziert wurden. Der letzte Schritt besteht darin, die Bild-J-Analyse durchzuführen, um die freigesetzten Blutzellen zu quantifizieren. Dies ermöglicht eine Berechnung der Anzahl zirkulierender und residenter Hämozyten pro Larve, z.B. den Vergleich von Larven verschiedener Entwicklungsstadien.

Der Fruchtflug Rosala Melone. Augusta war ein hervorragendes Modell, um allgemeine Prinzipien der Immunität und der Entwicklung von Blutzellen zu verstehen. Blutzellen und wirbellose Tiere werden auch Hemos genannt, von denen allgemein angenommen wird, dass sie in der Hämolymphe zirkulieren.

In vielen Entwicklungsstadien und im Erwachsenenalter befindet sich jedoch ein großer Teil der Hämosots tatsächlich in Cecile-Clustern, die in bestimmten Geweben ansässig sind. Neuere Forschungen haben sich auf diese residenten Hämosotenpopulationen, ihre Eigenschaften und Regulation konzentriert, und wir haben eine Methode entwickelt, die es ermöglicht, die residenten und zirkulierenden Blutzellen selektiv aus der Drosophila-Larve zu isolieren. Diese Methode unterscheidet zwischen der zirkulierenden und der ansässigen Bevölkerung und bietet einen automatisierten und reproduzierbaren Ansatz für deren Isolierung und Quantifizierung.

Wir haben diese Methode entwickelt, als wir begannen, die ansässigen Blutzellen in den hämatopoetischen Taschen der Drosophila-Larve zu untersuchen. Wir fanden heraus, dass bei der selektiven Isolierung von residenten und zirkulierenden Hämosots diese beiden Populationen unterschiedliches Verhalten zeigen, z. B. bei der Proliferation. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist hilfreich, da es wichtig ist, sich mit der Position des Bewohners in zirkulierenden Hämozyten vertraut zu machen und zu erfahren, wie man sie selektiv freisetzt.

Die Methode ermöglicht es, Schlüsselfragen in der Entwicklung, der Hämatopoese und der Immunität zu beantworten, z. B. in Bezug auf Signale, die Blutzellen induzieren und deren Lokalisation in den hämatopoetischen Taschen fördern und umgekehrt. In Bezug auf Signale, die Cecile-Hämos in den Kreislauf mobilisieren, z. B. nach einer Immunherausforderung, können Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten haben, die Larven schonend zu behandeln und präzise Schnitte für den Blutungsteil dieses Verfahrens vorzunehmen. Diese Schritte sind entscheidend, um sicherzustellen, dass sich die beiden Populationen nicht vermischen und gleichzeitig freigesetzt werden.

Diese Methode ist sehr nützlich für Drosophila verschiedener Größen und in Sternen und kann an andere Entwicklungsstadien und möglicherweise auch an andere Wirbellose angepasst werden. Um die Larven vom Fliegenfutter zu isolieren, spritzen Sie Wasser in das Fläschchen und spülen Sie die Larven in eine Petrischale. Nehmen Sie die Larven mit einem Pinsel aus der Petrischale und legen Sie sie in Wasser in eine Hohlraumschale.

Übertragen Sie die Larven auf einen Objektträger auf einem kalten Metallblock und wählen Sie unter einem Fluoreszenzmikroskop Larven der gewünschten Größe und des gewünschten Genotyps aus. Die Larven sollten Transgene tragen, die die Zyten durch Expression eines fluoreszierenden Proteins oder eines anderen sichtbaren Zytenmarkers markieren. Legen Sie eine Larve in den ersten Pap-Stift.

Nun, um zirkulierende Zyten zu isolieren, verwenden Sie eine Sektion, eine Schere oder zwei saubere Nadeln, um Schnitte auf der ventralen Seite der Larve zu machen. Um eine Ansiedlung zu vermeiden, schneidet er einen Schnitt am hinteren Ende und einen Schnitt am vorderen Ende der Larve. Stellen Sie sicher, dass die Schnitte an jeder Larve an der gleichen Stelle vorgenommen werden.

Lassen Sie die Larven einige Sekunden lang ohne Druck oder körperliche Erregung bluten. Nach einigen Sekunden heben Sie die Larven vorsichtig mit den Nadeln oder der Pinzette an und legen sie in eine zweite. Gut zu spülen, um den Bewohner seine Zyten freizusetzen.

Setzen Sie die Larven vorsichtig in die nächste Vertiefung um und stecken Sie die Larven mit einer Nadelspitze fest. Verwenden Sie eine andere Nadel, um die durch die Körperwand der Larven sichtbaren Cluster von Zyten aufzubrechen. Vermeiden Sie die Lymphdrüse, während Sie den Bewohner freilassen.

Er cytes. Wählen Sie einen Teil der Larven aus, der in jede Vertiefung gestochen werden soll, und machen Sie dasselbe mit den restlichen Proben. Legen Sie den endgültigen Kadaver auf eine saubere Stelle desselben Objektträgers und verteilen Sie ihn so dünn wie möglich, um den Fokus auf die optischen Schichten zu maximieren.

Zählen Sie die verbleibenden Zyten manuell mit einem Zählzähler. Sobald die Dissektion abgeschlossen ist, wiegen Sie zwischen fünf und 15 Minuten, damit sich die Zellen abgesetzt haben. Vor der Bildgebung wird der Objektträger in einer feuchten Kammer gelagert, um ein Austrocknen zu vermeiden.

Die abgesetzten Zyten auf dem Objektträger werden unter einem Fluoreszenzmikroskop untersucht; Fluoreszenzbilder der abgesetzten Zyten werden für die Single-Well-Methode aufgenommen. Das Bildgebungsfeld sollte für die Fliesenscanmethode die gesamte Vertiefung abdecken. Die Ränder der Vertiefungen werden ausgewählt und die Bilder werden mit einem kommerziellen Mikroskop aufgenommen.

Die resultierenden Bilder der Kachelscan-Software werden dann für die Quantifizierung der Hämo-Stelle analysiert. Die Image J-Software wird gestartet und das Well-Image wird geöffnet. Stellen Sie sicher, dass das Bild acht Bit oder 16 Bit groß ist.

Passen Sie den Schwellenwert an, indem Sie Bild auswählen. Wählen Sie dann Anpassen und Schwellenwert aus. Um das Schwellenwertfenster zu beobachten, aktivieren Sie die Option dunkler Hintergrund und wählen Sie Rot aus.

Stellen Sie dann den unteren Schwellenwert ein. Diese Einstellung ermöglicht es dem Benutzer, die Zellen mit einem roten Punkt zu markieren. Die Zellen, die nicht abgedeckt werden, werden in Graustufen angezeigt.

Starten Sie den Partikelanalysator, um die Zellen zu zählen, auszuwählen, zu analysieren und klicken Sie auf Partikel analysieren. Wählen Sie Overlay-Umrisse aus, um die Algorithmus-Zählung zu sehen, um die Zellzahl zu analysieren, klicken Sie auf OK und beobachten Sie das Zusammenfassungsfenster mit der Zählung Resident, he zyten können mechanisch gestört werden, was zu einer vorübergehenden Zunahme der zirkulierenden Blutzellpopulation führt, um eine Störung zu erreichen. Ganze Larven werden mit Glaskügelchen verwirbelt und dürfen sich für einen definierten Zeitraum erholen, während dessen sich die Zyten in die hämatopoetischen Taschen verlagern.

Dies wird veranschaulicht, indem der Anteil der zirkulierenden Blutzellen vor und nach der Störung quantifiziert wird, und nach der Erholungsphase zur mechanischen Störung der residenten Hämozyten bis zu vier bis acht Larven ausgewählt und in ein zwei Milliliter Mikrozentrifugenröhrchen mit etwa 0,5 Gramm 600 Mikron Glaskügelchen und 0,5 Millilitern Wasser gelegt werden. Wirbeln Sie das Rohr mit der Hand bei einer Geschwindigkeit von 10 für eine Minute vor. Hole die Larven aus den Glasperlen, indem du den Inhalt des Mikrozentrifugenröhrchens in eine Petrischale gibst und die Larven mit einem Pinsel für die Erholungsphase herausnimmst.

Legen Sie die Larven in die zuvor vorbereiteten Petrischalen mit einer dünnen Schicht Fliegenfutter. Inkubieren Sie die Larven 45 Minuten lang, damit die Larven nach der Erholungsphase ihr Hämozytenmuster wieder herstellen können. Fahren Sie mit den Blutungskratzer-Dissektionen fort, wie sie zuvor bei den Kontrolllarven beschrieben wurden, die Hämozyten sind in hämatopoetischen Taschen lokalisiert und bilden seitliche Flecken und dorsale Streifen.

Eine vorübergehende mechanische Störung der Larven führt zu einer dramatischen Zunahme der Population zirkulierender Hämozyten auf Kosten der residenten Hämozyten. Nach der Erholungsphase kehren die Zyten in die hämatopoetischen Taschen zurück. Die Larven können vergrößerte dorsale Gefäß-assoziierte Cluster und Rückenstreifen aufweisen, die vorherrschende Orte der frühen Akkumulation nach der Störung sind.

Die ermittelten Prozentsätze der zirkulierenden Hämozyten wurden mit der Bleed-Scrape-Methode quantifiziert. Diese Methode bietet einen neuen Ansatz für die Erforschung von wirbellosen Blutzellen. Es ermöglicht die Untersuchung der Population der sich selbst erneuernden Blutzellen und anderer Hämozyten, um die Regulation durch lokale Mikroumgebungen und systemische Signale zu verstehen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Zirkulation in residenten Hämos-Installarven selektiv isolieren und quantifizieren können. Einmal gemeistert, kann diese Technik in etwa 15 Minuten pro Larve abgeschlossen werden. Dazu gehören die Freisetzungsbildgebung und die Quantifizierung von Blutzellen. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie Immunchemie und zellbiologische Assays durchgeführt werden, um Fragen wie den Status der Blutzellproliferation, der Differenzierung, des Überlebens oder der Phagozytose zu beantworten.

Während Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, ruhig zu bleiben und zirkulierende Hämozyten mit Vorsicht freizusetzen. Gehen Sie vorsichtig mit den Larven um, um zu vermeiden, dass die ansässigen Hämozyten zusammen mit den zirkulierenden freigesetzt werden.