Blutprobenentnahme aus der laterale Schwanzvene der Ratte

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, den Stress bei der Blutentnahme von Ratten durch Probenahme über die laterale Schwanzvene zu minimieren. Dies wird erreicht, indem die Ratte zuerst zurückgehalten und der Schwanz erwärmt wird. Im zweiten Schritt wird ein Schmetterlingskatheter in eine der erweiterten seitlichen Schwanzvenen eingeführt, dann wird im letzten Schritt das Blut entnommen.

Der Katheter wird entfernt und der Blutfluss aus der Einstichstelle gestoppt. Letztendlich verursacht die Blutentnahme aus der lateralen Schwanzvene bei der Blutentnahme minimalen Stress für die Ratte, wodurch der Einfluss der akuten Stressreaktion auf die Zusammensetzung des Blutes reduziert wird. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Amputation der Schwanzspitze bei der Probenahme aus der lateralen Schwanzvene ist für das Tier weitaus weniger belastend und ermöglicht eine Wiederholung innerhalb der Probenentnahme.

Das Verfahren wird von zwei Mitgliedern meines Labors, Graham Lee, einem Postdoc, und Elia Harmatz, einem Techniker, demonstriert. Befestigen Sie zunächst einen Schmetterlingskatheter an der Spritze und halten Sie den Spritzenschutz über der Nadel, um die Spitze zu schützen. Entnehmen Sie dann ein Volumen Heparin, das etwas größer ist als das Volumen des Blutes, das entnommen wird. Nehmen Sie die Spritze ab und füllen Sie die Spritze mit Luft.

Befestigen Sie die Spritze wieder am Katheter und stoßen Sie alle bis auf Spuren der Heparinlösung aus dem Schlauch, der Nadel und der Spritze aus. Legen Sie dann den Katheter und die Spritze auf eine sterile Oberfläche. Befestigen Sie die Ratte nun schnell in einem sauberen Tuch und achten Sie darauf, dass sich die vier und die Hinterpfoten in einer bequemen Position befinden und die Atmung uneingeschränkt ist.

Befestigen Sie das Tuch mit Klettband. Lassen Sie dann auf einer festen Arbeitsfläche die Ratte von einem Assistenten sanft und fest am Bauch und am Schwanzansatz festhalten, wobei der Schwanz von der Kante der Theke herabhängt, um die Blutprobe zu entnehmen. Als nächstes erweitern Sie die Schwanzblutgefäße in 42 Grad Celsius heißem Wasser für 40 bis 50 Sekunden.

Trocknen Sie dann den Schwanz mit einem Papiertuch ab und drehen Sie den ganzen Körper mit dem Schwanz, um entweder die rechte oder die linke Schwanzvene seitlich der Arterie für Blutungen zu lokalisieren. Markieren Sie einen Abschnitt der Vene im unteren Teil des Schwanzes und wischen Sie den Bereich mit einer antiseptischen 2%igen Chlorhexidinlösung ab. Ziehen Sie anschließend den Kolben der Spritze von null auf etwa 50 Mikroliter zurück, um einen Unterdruck in der Spritze zu erzeugen, und fassen Sie den Schwanz sanft und fest in der Nähe der Spitze, um den Schwanz während der Probenentnahme gerade zu halten.

Führen Sie nun den Katheter langsam in einem flachen Winkel in die Vene ein, etwa fünf Zentimeter von der Spitze des Schwanzes entfernt. Wenn die Vene penetriert ist, fließt Blut in den Katheter, ziehen Sie langsam den Kolben der Spritze zurück, um das gewünschte Volumen mit einer gleichmäßigen Geschwindigkeit von etwa 20 Mikrolitern pro Sekunde zu sammeln. Um den Blutfluss zu erleichtern, fahren Sie mit einem Finger entlang der Vene von der Basis zur Schwanzspitze, während Sie mehr als zwei Zentimeter von der Spitze der eingeführten Nadel entfernt bleiben, um das Blut zu melken.

Wenn das Blut an der ursprünglichen Stelle der Katheterpenetration nicht erfolgreich entnommen werden kann, führen Sie die Nadel weiter oben in der Vene wieder ein. Wenn ein ausreichendes Probenvolumen entnommen wurde, trennen Sie den Katheter und schließen Sie ihn wieder an, um den Druck in der Spritze abzulassen. Ziehen Sie dann die Nadel aus der Vene zurück und üben Sie kurz Druck auf die Einstichstelle aus, um die Blutung zu stoppen, wenn die Blutung aufgehört hat.

Wischen Sie den Bereich mit einer antiseptischen Lösung ab und bringen Sie das Tier in seinen Käfig zurück. Um die Blutprobe zu verarbeiten, saugen Sie die Luft an, um sicherzustellen, dass kein Blut in der Katheternadel verbleibt, und schneiden Sie den Katheterschlauch mit einer Schere direkt über der Nadel ab. Entfernen Sie die Nadel, sammeln Sie dann das Blutplasma und leiten Sie das Blut in Mikrozentrifugenröhrchen mit EDTA aus.

Als Antikoagulans. Schnippen Sie vorsichtig mit dem Röhrchen, um das Antikoagulans im Blut zu mischen, und legen Sie die Proben dann auf Eis. Schleudern Sie innerhalb von 10 Minuten nach der Entnahme das Vollblut herunter und eluieren Sie das Plasma, wobei Sie darauf achten, die roten und weißen Blutkörperchenschichten nicht zu stören, um das Blutserum zu sammeln.

Geben Sie das Blut in Mikrozentrifugenröhrchen ohne Antikoagulans bei Raumtemperatur für bis zu 30 Minuten. Nachdem das Blut geronnen ist, drehen Sie die Sammelröhrchen in einer gekühlten Zentrifuge und eluieren Sie das Serum. Beide Arten von Proben können dann sofort verwendet oder bis zu einem Jahr bei minus 80 Grad Celsius gelagert werden.

Blutplasma, das aus der lateralen Schwanzvene entnommen wird, ergibt, wie gezeigt, eine Plasmaprobe, die durchscheinend und blassgelb aussieht. Wenn eine Hämolyse stattgefunden hat, wird dem Plasma eine rote Färbung verliehen. Eine akute Stressreaktion kann die Zusammensetzung einer Blutprobe schnell verändern.

So steigt beispielsweise die zirkulierende Corticosteronkonzentration innerhalb von 10 Minuten nach der Exposition gegenüber einem Stressor wie in diesem repräsentativen Experiment deutlich an. Wichtig ist jedoch, dass der niedrige basale Corticosteronspiegel, der mit dieser Methode vor der Stressorexposition erhalten wurde, zeigt, dass das Probenahmeverfahren selbst keine signifikante Stressquelle darstellt. Wir empfehlen Ihnen, dieses Verfahren an narkotisierten Tieren zu üben, bis Sie das Einführen der Nadel und die Blutentnahme beherrschen.

Wenn die Technik einmal gemeistert ist, kann sie in fünf Minuten abgeschlossen werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, potenzielle Stressquellen, wie z. B. Umgebungsgeräusche, zu minimieren und den Vorgang so schnell wie möglich abzuschließen.