Aufbau und Charakterisierung von UTI und CAUTI in einem Mausmodell

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine zuverlässige Methode zur Etablierung von Harnwegsinfekten oder Harnwegsinfektionen und katheterassoziierten Harnwegsinfektionen oder CA a UTI I im Mausmodell aufzuzeigen und die Infektionen zu beurteilen. Dies wird erreicht, indem zunächst die bakteriellen Inokula, der Katheter und die Nadel richtig vorbereitet werden. Als nächstes werden die Harnwege der Maus intravesikal, geimpft und katheterisiert.

Dann werden das Harnwegsgewebe und die Katheter entnommen, um die Infektion zu beurteilen. Schließlich wird die Infektion quantifiziert, indem das Bakteriengewebe, die Urin- und Katheterlast und/oder die intrazelluläre Bakteriengemeinschaft oder IBC-Bildung bestimmt wird. Letztendlich werden die KBE-Enumeration und die laxe Färbung verwendet, um die Etablierungspersistenz und den Schweregrad der Harnwegsbesiedlung in einem Mausmodell zu zeigen.

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, ein zuverlässiges Modell zur Nachahmung menschlicher Harnwegsinfektionen zu entwickeln, um kritische Schritte in der Pathogenese von TI aufzudecken. Dieses Modell hat zur Entwicklung neuartiger Behandlungen und Therapeutika für Harnwegsinfektionen beigetragen. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Inokulation, Identifizierung und Beurteilung intrazellulärer Bakteriengemeinschaften schwer zu erlernen ist, da die Manipulation der Harnröhre und des Blasengewebes nicht intuitiv ist.

Zu Beginn fädeln Sie etwa einen Zoll PE 10-Schlauch auf den Schaft einer 30-Gauge-Nadel. Über Nacht UV-sterilisieren und bakterielles Inokulum vorbereiten. Gemäß dem Textprotokoll auf einem sterilisierten Arbeitsplatz werden bis zu 0,9 Milliliter des vorbereiteten bakteriellen Inokulums in eine Ein-Milliliter-Spritze aufgezogen.

Befestigen Sie die vorbereitete sterile Inokulumnadel mit PE-Schlauch auf der Spritze und schneiden Sie den Schlauch mit einer sterilen Schere auf eine Länge von einem Millimeter ab. Nachdem Sie eine weibliche Maus gemäß dem Textprotokoll betäubt haben, legen Sie sie auf den Rücken auf ein Papiertuch und spreizen Sie die Beine. Befestigen Sie einen Nasenkonus an der Maus und sorgen Sie für eine kontrollierte Zufuhr von Iso-Fluor.

Palpieren Sie die Blase sanft ab, um das Wasserlassen zu induzieren und sicherzustellen, dass die Blase vermieden wird, und verwenden Sie ein 100%iges Ethanoltuch, um den periurethralen Bereich zu reinigen. Tupfen Sie die Spritzenspitze der Impfnadel mit der Spitze zuerst in das chirurgische Gleitmittel. Führen Sie dann die Impfnadel etwa 12 Millimeter in die Harnröhre ein und drücken Sie den Spritzenkolben vorsichtig an, um 50 Mikroliter der Bakterienlösung in die Platte zu geben.

Um Urin zu sammeln, vor oder nach der Infektion, halten Sie die Maus vorsichtig fest, indem Sie den Schwanz festhalten und ihn auf eine flache, erhöhte Oberfläche legen, z. B. die Oberseite eines Mäusekäfigs. Halten Sie ein steriles 1,5-Milliliter-Röhrchen unter die Harnröhre der Maus und drücken Sie sanft auf den Rücken der Maus in der Nähe des Schwanzes, um Druck auf die Blase auszuüben. Fange den Urin in der Tube auf.

Nach der Vorbereitung der seriellen Verdünnung des Urins und der Kultivierung über Nacht werden die Völker gezählt, um das C-A-U-T-I-Protokoll durchzuführen. Beginnen Sie damit, ein sieben Millimeter langes Stück PE 10 Schlauch und ein fünf Millimeter langes Stück Silikonschlauch wie z.B. reil zu schneiden. Entfernen Sie die Kappe einer 30-Gauge-Nadel und verwenden Sie den PE 10-Schlauch, um die Nadel bis zur Basis einzufädeln.

Führen Sie dann den Silikonschlauch auf das PE 10 auf. Um den Katheter zu implantieren, befestigen Sie die Katheternadel an einer leeren Ein-Milliliter-Spritze. Schneiden Sie ein einen Zoll großes Stück Paraform ab und geben Sie einen Tupfer chirurgisches Gleitmittel darauf.

Nachdem Sie die Maus betäubt haben, legen Sie die Maus auf den Rücken auf ein Papiertuch und befestigen Sie einen Nasenkonus, um Fluor abzugeben. Palpieren Sie die Blase vorsichtig ab, um das Wasserlassen zu induzieren und sicherzustellen, dass eine Blase vermieden wird. Verwenden Sie dann ein 100%iges Ethanoltuch, um den periurethralen Bereich zu reinigen.

Verwenden Sie anschließend eine 10%ige Povidon-Jodlösung und einen Applikator mit Wattespitze, um den periurethralen Bereich zu desinfizieren, und tupfen Sie die Spitze der Impfnadel in das chirurgische Gleitmittel. Führen Sie dann den Katheter in die Harnröhrenöffnung ein. Sobald Sie in Gebrauch sind, schieben Sie den PE-Schlauch in Richtung Blase, wodurch der kleinere Silikonkatheter in der Blase abgelagert wird.

Entfernen Sie dann sofort die Nadel, während der Sieben-Millimeter-Schlauch noch befestigt ist. Nachdem Sie das bakterielle Inokulum der EFA vorbereitet haben, verwenden Sie es, um die Blase zu impfen und das Tier in seinen Käfig zurückzubringen, bevor Sie die bakterielle Belastung gemäß der folgenden Demonstration bestimmen. Sobald das Tier eingeschläfert wurde, legen Sie es auf den Rücken und verwenden Sie 70%iges Ethanol, um den Bauch zu besprühen, die Maus zu sezieren, die Blase und dann die Nieren in dieser Reihenfolge zu entnehmen, und legen Sie die Organe in separate Fünf-Liter-Röhrchen, die ein XPBS enthalten.

Wenn die Maus katheterisiert ist, entfernen Sie den Katheter aus der Blase und legen Sie ihn in einen separaten Schlauch. Nach der Homogenisierung der Organe, der Vorbereitung der seriellen Verdünnung und der Kultivierung über Nacht mit LB-Beleaten werden die Kolonien für die IBC-Zählung gezählt. Legen Sie die Blase nach der Ernte in eine silikonbeschichtete Vertiefung einer Sechs-Well-Platte mit PBS und schneiden Sie sie mit einer Schere in zwei Hälften.

Spreizen Sie die Blase mit kleinen Metallstiften, die an den äußersten Rändern angebracht sind, vorsichtig, so dass das Lumen nach oben zeigt und die maximale Menge an Urothel freiliegt. Nach der Durchführung der XI-Färbung, wie im Textprotokoll beschrieben, beobachten Sie IBCs, die unter einem Präpariermikroskop als blaue Punkte erscheinen. Die hier gezeigten Daten stellen eine akute Harnwegsbesiedlung durch das prototypische Hochzystitis-Isolat UTI 89 dar.

In dieser Abbildung ist die vier Wochen nach der Inokulation von C3-HHEN-Mäusen auftretende KBE mit zwei mal 10 bis sieben KBE von U UTI I 89 dargestellt. Unter diesen experimentellen Bedingungen entwickeln 20 bis 50 % der infizierten Mäuse eine chronische Zystitis, während die restlichen 50 bis 80 % der Mäuse die Infektion abklingen lassen. Die IBC-Quantifizierung ist ein informatives Maß für die bakterielle Belastung während der akuten Zystitis, und hohe IBC-Spiegel korrelieren mit dem Risiko, an einer Infektion zu erkranken. chronische Blasenentzündung. Wie hier mit LAE-Becyase-Färbung zu sehen ist, erscheinen IBCs als blau-violette Punkte auf dem Urothel, die im C3-HHEN-Hintergrund gezählt werden können. Pro Blase sind durchschnittlich etwa 50 IBCs zu sehen.

Die hier gezeigten Daten stammen aus einem Blasenimplantat-Mausmodell von CA A UTI und repräsentieren 24-Stunden-Infektionen mit dem EPHA-Listenstamm OG one rf. Wenn man mal 10 bis zu den sieben CFUs von OG einem RF intravesikal in eine nicht bepflanzte Blase inokuliert, beginnt die Infektion um 24 HPI zu verschwinden und wird durch 3D PI aufgelöst. Umgekehrt führt OG one RF, das in eine implantierte Blase geimpft wird, zu einer Besiedlung sowohl des Katheters als auch der Blase mit einer zehnfach höheren Besiedlung bei 24 HPI als bei nicht gepflanzten Blasen. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Techniken wie Konfokal- und Elektronenmikroskopie verwendet werden, um die IBC-Bildung und die bakterielle Lokalisierung weiter zu bewerten.

Nach ihrer Entwicklung ließ diese Technik eine Welle vieler Forscher auf dem Gebiet der Harnwegsinfektionen verblassen, um bakterielle Virulenzfaktoren und Wirtsreaktionen bei Mäusen zu erforschen, die die menschliche Pathogenese rekapitulieren.