Die indirekte Immunfluoreszenz auf Gefrierschnitte von Mäusemilchdrüse

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Proteine, die von Interesse sind, während der Stillzeit im Brustgewebe der Maus zu lokalisieren. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich der Zellbiologie zu beantworten, z. B. wo die Snap-Proteine, die an der Sekretion des Mittelprodukts beteiligt sind, während der Stillzeit in den Brustepithelzellen der Maus lokalisiert sind. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass Sie schnell und einfach die Position von Proteinen in einem bestimmten Gewebekontext beobachten können.

Nach der Euthanasie legen Sie die Maus auf den Rücken, befeuchten Sie den Bauchbereich mit Ethanol und trocknen Sie sie dann mit einem Papiertuch ab. Ziehen Sie dann mit einer Pinzette die Bauchhaut zwischen den beiden Hinterbeinen nach oben und machen Sie mit einer scharfen Schere einen einen Zentimeter langen Schnitt durch die Haut. Beginnend mit diesem ersten Schnitt schneiden Sie die Haut bis zum Hals und ziehen Sie dann die Haut vom Bauchfell weg.

Stecken Sie jeweils eine Seite der Haut fest und dehnen Sie jede Seite straff. Als nächstes schieben Sie mit einem sterilen Tupfer die Bauch- und Leistendrüsen von der Haut weg und präparieren sie vom Bauchfell weg. Legen Sie das präparierte Brustgewebe auf eine mit Eis gekühlte Präparierplatte.

Entfernen Sie abschließend den Lymphknoten, der sich an der Verbindung von Bauch- und Leistendrüsen befindet, mit einem Skalpell. Schneiden Sie das Gedächtnisgewebe in etwa drei Kubikmillimeter große Fragmente und spülen Sie diese Fragmente sofort in PBS aus. Um so viel Milch wie möglich zu entfernen, trocknen Sie die Fragmente schnell auf einem Papiertuch und legen Sie sie dann für 10 bis 15 Minuten in eine eiskalte PBS-Lösung mit 4%para Formaldehyd auf Eis.

Um das Gewebe nach der Fixierung sanft zu fixieren, spülen Sie die Brustfragmente schnell mit eiskaltem PBS ab und tauchen Sie die Fragmente dann 16 bis 48 Stunden lang bei vier Grad Celsius in eiskaltes PBS mit 40 % Saccharose. Beschriften Sie die Kryoformen aus Kunststoff vorsichtig und füllen Sie sie dann zu einem Drittel mit der optimalen Schnitttemperatur bei Raumtemperatur. In jede Form wird ein Fragment mit zwei bis drei Kubikmillimetern Brustgewebe gegeben und mit zusätzlicher Masse bedeckt.

Frieren Sie anschließend die Verbindung mit der optimalen Schnitttemperatur und die Probe ein, indem Sie die Formen auf die Oberfläche eines Flüssigstickstoffbads legen, bis die gesamte Form undurchsichtig wird. Lagern Sie die Blöcke im Gefrierschrank bei minus 80 Grad Celsius, bis die Proben geschnitten sind. Stellen Sie die Temperatur des Kryostaten auf minus 26 Grad Celsius ein und warten Sie, bis sich die Temperatur stabilisiert hat.

In der Zwischenzeit legen Sie die zu schneidenden Blöcke so in den Kryostaten, dass sie sich auf minus 26 Grad Celsius ausgleichen können. Auch. Halten Sie den gefrorenen Gewebeblock während des gesamten Schnittvorgangs eingefroren.

Kühle zusätzlich die Rasierklinge, den Schnitt. Stützen Sie die Abrollsicherung und die Bürste auf minus 26 Grad Celsius ab, indem Sie sie für mindestens 10 Minuten in den Kryostaten legen. Platzieren Sie außerdem eine Objektträgerbox in den Kryostaten, um die Objektträger während der Herstellung der Schnitte aufbewahren zu können.

Während diese Gegenstände abkühlen, beschriften Sie die positiv geladenen Objektträger, die zum Sammeln der Gewebeschnitte und zum Halten bei Raumtemperatur verwendet werden, ordnungsgemäß. Entferne als Nächstes eine Probe aus der Form. Bedecken Sie die Oberfläche einer Metallgewebescheibe mit einer Verbindung mit optimaler Schnitttemperatur bei Raumtemperatur und drücken Sie die gefrorene Probe darauf.

Setzen Sie die nasse Halterung in den Kryostaten ein und lassen Sie sie mindestens 15 Minuten abkühlen. Setzen Sie nach dem Abkühlen die Nasshalterung in den Scheibenhalter des Kryostaten ein und stellen Sie die Schnittdicke auf fünf bis sechs Mikrometer ein. Passen Sie anschließend die Position der Abrollsicherung an, indem Sie das Eindeckmedium schneiden, bis sich die Scheiben gleichmäßig und korrekt bilden.

Sobald die Einstellungen korrekt sind, führen Sie Gewebeschnitte durch, indem Sie das Rad in einer kontinuierlichen, gleichmäßigen Bewegung drehen. Benutze eine Bürste, um den Abschnitt zu greifen und über die Bühne zu manövrieren. Holen Sie die Gewebeschnitte nacheinander heraus, indem Sie die Glasleuchte über den Schnitt halten und sie langsam nach unten abwinkeln, bis der Gewebeschnitt den Objektträger berührt.

Zeichnen Sie mit einem hydrophoben Barrierestift einen Kreis um das auf dem Objektträger befestigte Gewebe. Lassen Sie den Kreis etwa eine Minute lang bei Raumtemperatur trocknen. Ziehen Sie dann mit einem Permanentmarker eine Linie um die Gewebeabschnitte auf der Rückseite des Objektträgers.

Als nächstes hydratisieren wir die Gewebeabschnitte, indem wir sie einige Minuten lang bei Raumtemperatur mit einem Tropfen PBS bedecken. Fixieren Sie dann die Gewebeschnitte, indem Sie sie 10 bis 15 Minuten lang mit frisch zubereiteter 3%iger PARAFORM-Aldehydlösung in PBS bedecken. Dann durchdringen Sie sie in PBS mit 0,05% Saponin für 10 bis 15 Minuten.

Als nächstes inkubieren Sie sie in PBS mit 3 % Rinderserumalbumin für mindestens 30 Minuten bei Raumtemperatur nach der Antigenentnahme. Bei Bedarf spülen Sie die Gewebeschnitte mit PBS und inkubieren Sie sie dann in PBS mit 3 % Serumalbumin für mindestens 30 Minuten bei Raumtemperatur. Als nächstes entfernen Sie die Blockierungslösung und bei 30 bis 50 Mikrolitern des in PBS verdünnten Primärantikörpers mit 2%BSA, so dass jeder Gewebeabschnitt vollständig bedeckt ist. Geben Sie das gleiche Volumen des Verdünnungsmittels allein auf einen Gewebeschnitt, um eine Negativkontrolle durchzuführen.

Legen Sie die Objektträger dann am nächsten Tag über Nacht bei vier Grad Celsius in eine befeuchtete Box. Waschen Sie die Gewebeabschnitte gründlich 10 Minuten lang mit PBS bei Raumtemperatur und wiederholen Sie dies mindestens viermal. Verdünnen Sie den entsprechenden Sekundärantikörper in PBS mit 2%BSA gemäß den Anweisungen des Herstellers und geben Sie dann 30 bis 50 Mikroliter dieser Lösung auf alle Gewebeschnitte.

Inkubieren Sie die Schnitte eineinhalb Stunden lang bei Raumtemperatur. Waschen Sie dann die Gewebeschnitte nochmals gründlich mit zimmerwarmem PBS für 10 Minuten und wiederholen Sie dies mindestens viermal. Als nächstes färben Sie die neutralen Lipide in den Schnitten, indem Sie das Gewebe in 30 bis 50 Mikrolitern A PBS-Lösung, die drei Mikrogramm pro Milliliter boda P 4 93, 5 0 3 enthält, 10 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren.

Nach der Inkubation spülen Sie die Gewebeschnitte schnell zweimal mit PBS-Gegenfärbung, der Kern-DNA mit 30 bis 50 Mikrolitern einer PBS-Lösung, die drei mikromolare DPI enthält, für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Gewebeabschnitte zweimal mit PBS, bevor Sie die Objektträger montieren. Entfernen Sie zur Beobachtung PBS und geben Sie einen Tropfen Einbettmedium auf jeden Gewebeschnitt.

Legen Sie dann eine Seite eines Deckglases schräg gegen den Objektträger, um den äußeren Rand des Flüssigkeitstropfens zu berühren, und senken Sie dann den Deckel langsam ab, um Luftblasen zu vermeiden. Lassen Sie die Flüssigkeit einige Minuten lang zwischen dem Objektträger und dem Deckglas verteilen und entfernen Sie dann das überschüssige Eindeckmedium mit einem Papiertuch. Versiegeln Sie den Deckglas mit Nagellack auf dem Objektträger und lagern Sie die Gewebeschnitte bei vier Grad Celsius.

Stellen Sie abschließend die Abschnitte wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben dar. Diese Bilder zeigen die Lokalisation von Kain in der Milchdrüse der laktierenden Maus. Am 10. Tag der Laktation in Gegenwart oder Abwesenheit von Jungtieren während des Säugens scheinen sich die Kaine hauptsächlich in der apikalen Region anzusammeln.

Darüber hinaus zeigt die konfokale Mikroskopie, dass Kaine auch in geringerem Maße an der basalen Seite der epithelialen sekretorischen Zellen vorhanden sind, wenn auch in Gegenwart von Jungtieren, wenn die Milchsekretion verlangsamt wird, Kaine auch unter der apikalen Plasmamembran akkumuliert erscheinen und deutlich auf der basalen Seite des Gedächtnisses beobachtet werden. Epithelsekretorische Zellen Butyrophilin, rot dargestellt, ist eines der Hauptproteine, die mit Milch, Fett, Kügelchen und Milch assoziiert sind. Dieses Transmembranprotein ist hauptsächlich an der apikalen Plasmamembran der sekretorischen Zellen des Brustepithels lokalisiert und befindet sich daher an der Oberfläche der Milchfettkügelchen, nachdem es von knospenden Unmastered freigesetzt wurde.

Der Besuch kann in acht bis 10 Stunden durchgeführt werden, wenn er richtig durchgeführt wird. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, sich während des Immunnachweisverfahrens von Licht fernzuhalten. Andere Methoden, wie z.B. der ImmunoGold-Nachweis mittels Transmissionselektronenmikroskopie, können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen wie die subzelluläre Lokalisierung des interessierenden Proteins nach seiner Entwicklung zu beantworten.

Diese Technik ebnete Forschern auf dem Gebiet der Zellbiologie den Weg, um die Lokalisierung von Proteinen in normalen und pathologischen Geweben bei verschiedenen Spezies zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Gewebeverteilung eines Proteins von Interesse unterstützen können. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Tieren, Regionen und einigen Instrumenten äußerst gefährlich sein kann, und dass bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Handschuhen und das Arbeiten unter einer Dunstabzugshaube getroffen werden sollten.