Name: Isolierung der Exosomen aus dem Plasma von HIV-1-positiven Individuen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-05T15:00:01.000+00:00
Duration: 6 min 46 s
Description: Erfahren Sie die Gradientenmethode zur Isolierung von Exosomen aus HIV-1-positivem menschlichem Plasma. Diese Technik ermöglicht die Analyse von Zytokinen und Chemokinen zur Untersuchung der HIV-Pathogenese.

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Wir danken den folgenden Personen: Jane Chu, Cameron Tran, James Lillard, Mafuz Khan, Masebonang Albert, Ken Rogers und Syed A. Ali. Kateena Addae-Konadu wurde unterstützt durch das UNCF/Merck Graduate Research Fellowship, die American Medical Association Foundation, das CRECD Grant 8R25MD007589-10 und das NIH NIGMS MBRS Grant R25 GM058268. Diese Arbeit wurde unterstützt durch die NIMHD-Zuschüsse 8G12MD007602 und 8U54MD007588, den NIAID-Zuschuss 1R21AI095150-01A1, den Zuschuss der Georgia Research Alliance GRA. VAC08. W und Emory CFAR gewähren P30 A1050409.

Ein allgemeines Diagramm der Exosom Isolierungs- und Reinigungsverfahren ist in Abbildung 1 zur Verfügung gestellt. Das Vollblut wurde von gesunden freiwilligen Spendern und von HIV-positiven Personen, die nicht die antiretrovirale theraoy Teilnahme an der Hoffnung Klinik der Emory University und der ansteckenden Krankheit-Programm von Grady Health System erhalten in Atlanta, Georgia. Diese Studie wurde von der Ethikgremien von Emory University und Morehouse School of Medicine genehmigt. Alle an der Studie beteiligten Personen gaben eine schriftliche und informierte Zustimmung. 1. Herstellung von Exosomen aus Blutplasma <ol><li> Menschliches Blut Erhebung und Verarbeitung <ol><li> Sammeln von 10 ml peripherem Blut durch Venenpunktion in EDTA-Blutsammelröhrchen (enthaltend 18 mg Kalium-EDTA) und vorsichtig umgedreht fünfmal zu mischen. </li><li> Zentrifugieren Blutentnahmeröhrchen bei 1.000 xg für 20 min bei RT pelletiert Blutkörperchen. Verwenden Sie eine sterile Pipettete, die Plasmafraktion (4-5 ml) in einen 25 ml konischen Röhrchen übertragen. Verdünnen des Plasmas mit 10 ml 1 X PBS. Entsorgen Blutzellen (rote Blutkörperchen und weiße Blutkörperchen, die auch als PBMC bekannt) in einem entsprechend gekennzeichneten Behälter für biohazard Abfälle. HINWEIS: Im Fall von nicht-infizierten Spenders Blutproben kann die PBMC für die weitere Verwendung (siehe Verfahren IV.2, unten) reserviert werden. </li><li> Speichern die Plasmaproben bei 4 ° C für kurzfristige (2-3 Tage) oder bei -80 ° C zur Langzeitspeicherung. HINWEIS: Bringen Sie keine gefrorenen Plasmaproben bis 4 ° C vor der weiteren Verarbeitung. </li></ol></li><li> Herstellung von Exosom Fraktion aus Plasma <ol><li> Zentrifuge Plasma bei 10.000 × g für 30 min bei 4 ° C, um Zelltrümmer zu entfernen. Verwenden Sie eine sterile serologische Pipette, um das bereinigte Plasmaüberstand in ein sauberes 25 ml Ultrazentrifugenröhrchen übertragen. Entsorgen Sie das Pellet in dem Behälter für biologischen. </li><li> Zentrifugieren Sie die gelöscht Plasma bei 100.000 × g für 2h bei 4 ° C, um große Vesikel zu entfernen. Entfernen Sie die 100.000 xg Überstand vorsichtig mit einer Pipette, und entsorgen in biohazard Abfälle. Resuspendieren 100.000 xg Pellet in 1 ml 1X PBS in ein sauberes Röhrchen und Inkubation bei RT für 30 Minuten, wirbeln leicht zu lösen und getrennte Teilchen. </li><li> Durch Zugabe von 25 ml PBS waschen Sie die suspendierten 100.000 xg Exosom / Viruspellet. Vorsichtig umdrehen das Rohr fünf Mal zu mischen, dann zentrifugieren wieder bei 100.000 × g für 2 Stunden bei 4 ° C. Entsorgen Sie die PBS-Waschlösung in der biohazard Abfallbehälter. </li><li> Resuspendieren 100.000 xg Pellet in 1 ml 1 X PBS und Inkubation bei RT für 30 min vorsichtiges Schwenken zu lösen und das Pellet. HINWEIS: Wenn es nicht möglich ist, direkt mit dem Iodixanol Gradientenstufe für 1-2 Tage bis zur Iodixanol Gradientenstufe fortzufahren, speichern das Pellet, das Exosomen und Viruspartikel, bei 4 ° C. </li></ol></li></ol> 2. Reinigung von Exosomen <ol><li> Generieren Sie 6% -18% velockeit Steigungen Iodixanol mit einem Zweikammer-Gradientenformer Gerät. <ol><li> Vorzubereiten 6% und 18% Lösungen der Iodixanol-Reagenz in Form einer 60% igen Lösung in Wasser, durch Verdünnung in PBS zugeführt. Pipette 5,5 ml der 18% igen Lösung in die gerührte Kammer und Pipette 5,5 ml einer 6% Lösung in die Reservoirkammer. Schalten Sie den Rührer, öffnen Sie den Wasserhahn und ermöglichen jedem Gradienten in eine 14 ml Ultrazentrifugenröhrchen fließen. HINWEIS: Verwenden Sie entweder sofort oder bereit Gradienten O / N lagern bei 4 ° C vor der Verwendung. </li><li> Sorgfältig Schicht 1 ml der Exosom / Viruslösung auf die Oberseite jeder 11 ml Gradienten. Zentrifuge Gradienten bei 250.000 × g für 2 Stunden bei 4 ° C unter Verwendung eines SW40Ti Schwenkbecherrotor. </li><li> Beschriften Sie zwölf (12) 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Entfernen Sie 1,0 ml von der Spitze des Gradienten und Transfer zum Rohr # 1. Übertragen Sie die verbleibenden 1 ml-Fraktionen in Röhrchen 2-12 der Reihe nach. HINWEIS: Die oberste Fraktion wird daher sein, # 1, die Sumpffraktion, # 12. StErz die Gradientenfraktionen bei 4 ° C. Die gereinigten Exosomen, die in den Fraktionen 1-3 an der Oberseite des Gradienten sein sollten, sind für 3-4 Wochen bei Lagerung bei 4 ° C gelagert. </li></ol></li></ol> 3. Exosom Charakterisierung <ol><li> Acetylcholinesterase (AChE) Aktivitätstest <ol><li> Bereiten 100 mM Substrat Lager durch Mischen Acetylthiocholiniodid 28,9 mg in 1 ml 1X PBS. Shop Substrat Lager bei -20 ° C bis zu 1 Monat. </li><li> Bereiten Sie 10 mM Farbindikator Lager durch Mischen von Benzoesäure 39.6mg und Natriumbicarbonat 15 mg in 10 ml 1X PBS. Shop Farbindikator Lager bei 4 ° C bis zu zwei Wochen. </li><li> Vorbereitung Assayreagenz durch Mischen von 1X PBS, das Substrat und Farbindikator in einem Verhältnis von 100: 2: 5 (zum Beispiel 10 ml 1X PBS + 200 &amp; mgr; l Substrat + 500 ul Farbindikator). </li><li> Dann werden 50 &amp; mgr; l von jedem 1,5 ml Gradientenfraktion Rohr (markiert 1-12 von Verfahren III.3) in die Vertiefungen einer 96-well microtiter Platte. Bereiten Sie zwei Vertiefungen für jeden Gradienten Probe. </li><li> Bereiten Sie eine Reihe von Standards, indem zuerst eine 2000 &amp; mgr; U / ml Schmerz Stock in PBS. Machen elf (11) 2-fach serielle Verdünnungen von diesem Lager, und fügen Sie 50 ul jeder Verdünnung auf eine einzelne Vertiefung einer Mikrotiterplatte, so dass Standard # 1 = 2,000 &amp; mgr; U / ml, # 2 = 1000 &amp; mgr; U / ml, # 3 = 500 &amp; mgr; U / ml, usw. bis # 12 = 0,98 &amp; mgr; U / ml. Die zwölf AchE Standards wird somit zu besetzen eine einzige Reihe von einem 96-Loch-Testplatte. </li><li> Mit 200 ul Assay-Reagenz-Gemisch in jede Vertiefung und inkubiere 20 min (im Dunkeln) bei RT für die Entwicklung des gefärbten Reaktionsproduktes zu ermöglichen. Messen AChE-Aktivität bei einer Wellenlänge von 450 nm unter Verwendung eines Fluoreszenzmikroplattenlesegerät. HINWEIS: Der Prozentsatz an beginnend nach exosome Reinigung verbleibende Material wird durch AchE Assay der fraktionierten Plasma bewertet. </li></ol></li><li> Immunblot-Analyse <ol><li> Separate Proteine ​​in Gradientenfraktionen 1-12 (von Procedure 2.1.3) durch SDS-PAGE auf 4-20% Tris-HCl Fertiggelen bei 100 V x 1 Std. Transferproteine ​​in dem Gel auf eine Nitrocellulosemembran unter Verwendung eines elektro Blotting Übertragungszelle nach den Anweisungen des Herstellers. Lassen Sie die Überweisungen für 12-16 h (O / N) bei 350V auslöschen. </li><li> Entfernen Sie die Membran von der Blotapparatur und waschen in Tris-gepufferte Kochsalzlösung (TBS) für 5 min. Block mit 5% fettfreier Milch in TTBS (TBS mit 0,1% Tween 20) für 1 h bei RT durch Schütteln. </li><li> Inkubieren der Membran mit für Exosomen (CD9, CD45, CD63) oder HIV-1-Capsid-Protein (p24) Primärantikörper in 5% fettfreier Milch unter Schütteln bei 4 ° C für 12-16 h (O / N). Verdünnungen Primärantikörper für Immunoblots von 1: 2,000 -1: 5000. </li><li> Waschen des Blots in TTBS für 20 Minuten, gefolgt von Inkubation mit einer 1: 2000-Verdünnung von Meerrettich-Peroxidase (HRP) -konjugiertem Anti-IgG (sekundärer Antikörper), in 5% fettfreier Milch für 1 h bei RT. 3 mal mit TTBS, 10 min pro Waschgang waschen Sie den Fleck. </li><li&gt; Inkubieren des Blots mit Luminolsubstratlösung Reagens nach den Anweisungen des Herstellers, um ein chemilumineszentes Signal zu erzeugen, aus der HRP-markierte Proteine ​​erkennt den chemilumineszierenden Signals unter Verwendung eines elektronischen Abbildungssystems mit CCD-Kamera. </li><li> Speichern Sie die Bilder als TIFF-Dateien, die in Adobe Photoshop angezeigt werden kann. Führen Densitometrie-Analyse von Bands mit ImageJ Software (National Institutes of Health, Bethesda, MD). </li></ol></li><li> Zytokin-Assay <ol><li> Vor der Zytokin-Assay stören Immunkomplexe, die normalerweise im menschlichen Plasma vorhanden durch Säuredissoziation sind und lysieren die Exosomen von Detergens-Behandlung. Assay beide Ausgangsplasmaproben und gereinigt Exosom Zubereitungen. <ol><li> Zu 100 ul humanem Plasma mit 100 &amp; mgr; l 0,33 N HCl und bei 37 ° C für 1 Stunde. 100 l 0,33 N NaOH auf Säure behandelte Plasma neutralisieren. Hinzufügen Triton X-100, um sowohl das neutralisierte und gereinigte Plasma exosome Proben auf eine fiEndkonzentration von 1%, um die Lyse der Exosomen verursachen. </li></ol></li><li> Für diesen Assay (eine fluoreszierende Kügelchen-basierte Verfahren), Nutzung magnetische Kügelchen mit Antikörpern vom Hersteller vorbeschichtet. Verwenden Sie eine maßgeschneiderte Gruppe von Anti-Human-Zytokin-Antikörper-beschichteten Kügelchen; in Tabelle 1 aufgelistet. vortexen Antikörper-beschichteten magnetischen Perlen aus der Zytokin-Assay-Kit für 30 sec und 50 &amp; mgr; l Kügelchen zu jeder Vertiefung einer 96-Well-Platte in dem Assay verwendet werden. </li><li> Bereiten Sie eine Verdünnungsreihe von Standards in der Plasma-Standardpuffer (beide in der Zytokin-Assay-Kit enthalten ist), wie in der Gebrauchsanleitung für die Zytokin-Assay-Kit beschrieben, um eine 8-Punkt-Standardkurve zu erzeugen. </li><li> Fügen Sie 150 ul 1X Waschpuffer (aus Kit) in jede Vertiefung und Waschen der Kügelchen mit einem magnetischen Kügelchen Scheibe, wie in der Anleitung beschrieben. In 25 ul Plasma-Assay-Puffer (aus Kit) in jede Vertiefung. Hinzufügen von 25 ul Standards und Proben für alle in dem Test verwendet Vertiefungen. Werden 25 ul PlasmaProbenpuffer, um Negativkontrollen. Siegel und schütteln Sie die Platte bei 700 Upm für 60 min bei RT inkubieren O / N bei 4 ° C. </li><li> Fügen Sie 150 ul 1X Waschpuffer in jede Vertiefung und waschen Sie die Platte (wie in Schritt 3.3.4, oben). In 25 ul Nachweis-Antikörper in jede Vertiefung, Dichtung und schütteln Platte bei 700 Upm für 30 min bei RT. Wiederholen Sie den Waschschritt. </li><li> In 50 ul Streptavidin-Lösung (SAPE von kit) in jede Vertiefung, Dichtung und schütteln Platte bei 700 Upm für 30 min bei RT. Wiederholen Sie die Platte wäscht wie in 3.3.4. </li><li> Fügen Sie 120 ul der Lesepuffer (aus Kit) in jede Vertiefung und schütteln auf einem Labortischschüttler bei 700 Upm für 5 min bei RT, damit das Fluoreszenzsignal zu entwickeln. Lesen Platte auf dem Plattenlesegerät gemäß den Anweisungen des Herstellers. </li><li> Um für den Betrag von Exosomen während des Isolierungsverfahrens verloren Konto, verwenden Sie die folgende Gleichung: [(Originallese / Plasmavolumen) x 66,6 = eingestellt Zytokin Lesung]. </li></ol></li></ol> 4. Assay zur Immunmodulatorische Potential <ol><li> Vorbereitung des Kulturmediums mit Exosom verarmten fötales Rinderserum <ol><li> Zentrifuge 500 ml fötales Rinderserum (FBS) bei 100.000 · g für 20 h bei 4 ° C pelletiert kontaminierenden Exosomen und Mikrovesikel. Entfernen Sie vorsichtig und speichern Sie die Exosom verarmten FBS Stand. Entsorgen Sie das Pellet in der biohazard Abfälle. </li><li> Mähdrescher 20% der Exosom abgereicherte FBS Überstand mit 500 ml Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) Medium. Filtern das Medium durch einen 0,45 um-Membranfilter. </li><li> Hinzufügen Streptomycin (100 U / ml), Penicillin (100 U / ml), L-Glutamin (2 mM), HEPES-gepufferter Kochsalzlösung (10 &amp; mgr; M) und IL-2 (20 U / ml) zu dem filtrierten Medium. </li></ol></li><li> Zellkultur und Exosom Exposure <ol><li> Aussetzen Exosomen Spender periphere mononukleäre Blutzellen (PBMC) von gesunden Freiwilligen erhalten Klinik. Suspend PBMC invorbereitet Kulturmedium und zählen Sie die Zellen unter Verwendung eines Zell / Partikelzähler (nach Standardverfahren des Herstellers). HINWEIS: Die PBMC werden in der oben beschriebenen Plasmapräparat erhalten (Schritt 1.2). </li><li> Verwendung von vorbereiteten Mediums aus Verfahren 4.1.3, Co-Kultur 3,0 x 10 6 (PBMC) mit 1 ug / ml des gepoolten Exosomen aus drei (3) HIV-1-seropositiven oder von drei (3) HIV-1-seronegativen Individuen in einer Gesamt Volumen von 1 ml in die Vertiefungen einer 12-Well-Kulturplatte (mit Deckel). Kulturen Inkubieren für 48 Stunden bei 37 ° C. </li><li> Vorbereitung unbehandelten PBMC Kulturen und Kulturen, die mit Concanavalin A behandelt (Con A; 5 ug / ml), um als Negativ- und Positivkontrollen zu dienen, jeweils wie vorstehend beschrieben (4.2.2) beschrieben. Alle PBMC-Kulturen für 48 Stunden bei 37 ° C. </li><li> Unmittelbar vor dem Ernten der Zellen Verdünnungen der folgenden Fluorochrom konjugierten monoklonalen Antikörpern: Alexa Fluor 700-markiertem anti-CD3 (1: 400 Verdünnung), allophycocyanin (APC) / Cyanin 7 (Cy7) -markiertem anti-CD4 (1: 400), Peridinin-Chlorophyll-Protein-Komplex-markierten anti-CD4 (1: 400), V450-markiertem anti-CD8 (1: 400), Biotin- markierten anti-CD45RA (1: 1.000), Phycoerythrin (PE) / Cy7-markierten Anti-CD62L (1: 1000), PE / Cyanin 5 (Cy5) -markierten anti-CD38 (1: 200), PE-Texas Red- markierte Anti-Streptavidin (1: 2.000) und PE / Cy5-markierten Maus IgG1k Isotypkontrolle (1: 200). </li><li> Nach 48 Stunden Inkubationszeit ernten die PBMC. Wasch PBMC in PBS auf Exosomen für 1 h mit einzelnen Fluorochrom-markierten Antikörper zu entfernen und färben die Zellen durch Inkubation bei 4 ° C. Analysieren die gefärbten PBMC mittels Durchflusszytometrie auf die Expression von Chemokinen zu quantifizieren (wie beschrieben 21). </li></ol></li></ol>

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<li>Lässer, C., Eldh, M., Lötvall, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Characterization+of+RNA-Containing+Exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and Characterization of RNA-Containing Exosomes.</a> J. Vis. Exp. (59), e3037(2012).</li>
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</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Chronische Immunaktivierung (CIA) und CD4 + T-Zell-Depletion sind zwei wichtige Merkmale von HIV-1-Infektion. Sie wurden als Prädiktoren für die Pathogenese etabliert, mit der CIA, der beste Prädiktor. Doch die zugrunde liegenden Mechanismen der Fahrt chronische systemische Immunaktivierung und CD4 + T-Zell-Rückgang immer noch nicht vollständig geklärt. Wir und andere Labors haben schlüssige Beweise entwickelt, dass Exosomen von HIV-1 infizierten Zellen sezerniert spielen eine Rolle in beiden Markenzeichen. <p class...

Die HIV-1-Epidemie weiterhin einen erheblichen Einfluss in der ganzen Welt haben. Ab 2013 wurden etwa 35 Millionen Menschen weltweit mit HIV leben und 2,1 Millionen von ihnen waren neu infizierten Personen 1. Präventionsstrategien und den Zugang zu antiretroviralen Therapie waren hilfreich bei der Verringerung der Gesamtübernahme von HIV. Allerdings sind einzelne Bevölkerungsgruppen weiterhin auftritt steigt in den Erwerb von HIV 1. Somit gibt es eine fortlaufende Bemühungen, diese Epidemie. Einer der stärksten Prädiktoren HIV Fortschreiten der Krankheit ist eine chronische Immunaktivierung (CIA) 2-10. Durch anhaltend hohe nachweisbare Zytokine und erhöhte Expression Marker auf der Oberfläche von T-Lymphozyten definiert, CIA, um zurückzuführen: i) kontinuierliche dendritischen Zell Produktion von Typ-I-IFN 11; (ii) direkte Immunaktivierung durch HIV-Proteine ​​Tat, Nef und gp120 12 angetrieben wird; (iii) Translokation von bakteriellen Proteinen in darmassoziierten Immunzellen 6. Der genaue Mechanismus (en) zugrunde liegende chronische, systemische Immunaktivierung bei HIV-Infektion bleibt jedoch vollständig aufgeklärt werden. Unsere Arbeitsgruppe und andere haben eine Rolle von Exosomen in HIV Pathogenese 15-18 demonstriert. Unsere Arbeitsgruppe hat festgestellt, dass das Nef-Protein wird aus infizierten Zellen in Exosomen 15 ausgeschieden und exosomalen Nef (exNef) im Plasma von HIV-infizierten Personen in Nanogramm Stufen 18 vorhanden ist. Wir haben gezeigt, dass Bystander-CD4 + T-Zellen, um exNef ausgesetzt Folge aktivierungsinduzierten Zelltod abhängig von dem CXCR4-Weg 19, 20 gezeigt ist. Alternativ wurden die Monozyten / Makrophagen refraktär exNef induzierte Apoptose, aber zeigte veränderte zelluläre Funktionen und die Zytokinexpression. Aus dem Plasma von HIV-infizierten Personen isoliert jüngster Zeit hat unsere Gruppe gezeigt Exosomen enthalten eine Vielzahl von pro-inflammatorischen Zytokinen. Fuitere naive periphere mononukleäre Blutzellen von Plasma abgeleiteten Exosomen aus HIV-infizierten Patienten induzierte Expression von CD38 auf naiven und Zentralspeicher CD4 + und CD8 + T-Zellen ausgesetzt werden. Dies trägt wahrscheinlich systemische Entzündungen und Virusvermehrung durch Bystander-Zellaktivierung 21, und schlägt vor, Exosomen spielen eine bedeutende Rolle bei der HIV-Pathogenese. Bei der Untersuchung der Rolle von Exosomen bei HIV-Pathogenese, ist eine Herausforderung, der Entwicklung von Techniken zur effizienten separaten Exosomen von HIV-Partikel unter Beibehaltung der exosomalen Inhalten sowie deren funktionale immunmodulatorische Fähigkeit. Es wurden mehrere Verfahren zum Isolieren von Exosomen aus Zellkultur und biologischen Flüssigkeiten 22,23 beschrieben. Aufgrund ihrer geringen Größe und Dichte (Exosomen schweben in einer Dichte von 1,15 bis 1,19 g / ml), Differenz Ultrazentrifugation und / oder Ultrafiltration sind die am häufigsten verwendeten Techniken zum exosome Isolation 23.HIV-infizierten Zellkulturüberständen und Patientenplasma enthalten jedoch beide Exosomen und HIV-1-Viruspartikel. Exosomen und HIV-1-Partikel sind in Größe und Dichte sehr ähnlich. Alternativ, unter Ausnutzung der Expression der eindeutige exosomalen Marker wie CD63, CD45 und CD81, Exosomen isoliert wurden mit Immunaffinitäts-Abscheideverfahren 23. Dieses Verfahren kann Virus von Exosomen trennen. Ist der Nachteil dieser Technik jedoch die dichte Befestigung von Antikörpern gegen die gereinigte Exosomen, die mit der Beurteilung der immunmodulatorischen Potenzial der Exosomen in Kultur stören könnten. Um diese Einschränkungen zu begegnen, ein Verfahren zur Reinigung von Exosomen aus HIV-Partikeln in menschlichem Plasma von Cantin modifiziert und Mitarbeiter 22 unter Verwendung Iodixanol Geschwindigkeitsgradienten entwickelten wir. Exosomen wurden gefunden, um in der von geringer Dichte zu trennen / oberen Fraktionen von Iodixanol Gradienten, während Viruspartikel im Hoch- getrenntDichte / Unterfraktionen. Viruspartikel wurden durch p24 ELISA identifiziert und wurden unter Verwendung von Exosomen exosome Marker AChE, CD9, CD63 und CD45 identifiziert. Die oberen niedriger Dichte Fraktionen gesammelt enthaltenen Exosomen, die negativ für HIV-1 p24-Kontaminierung waren. Die effiziente Reinigung und Trennung von Exosomen aus HIV-Partikeln in menschlichem Plasma ermöglicht eine genaue Prüfung des Inhalts der Exosomen aus Humanplasma, sowie die Untersuchung ihrer immunmodulatorischen Potential und der diagnostischen und prognostischen Wert der Exosomen in HIV-1 Pathogenese abgeleitet.

<table><tbody><tr><td>BD Vacutainer EDTA-Röhrchen (10ml)</td><td>Becton Dickinson</td><td>368589</td><td>rosa obere Röhrchen</td></tr><tr><td>Lymphoprep Ficoll Reagenz</td><td>Cosmo Bio</td><td>AXS-1114545</td><td></td></tr><tr><td>Optiprep Iodixanol Reagenz</td><td>Sigma</td><td>D1556</td><td></td></tr><tr><td>14ml Ultrazentrifugenröhrchen</td><td>Beckman Coulter</td><td>344060</td><td>ultraklare Röhrchen</td></tr><tr><td>Gradient Former Modell 485</td><td>BIO-RAD</td><td>165-4120</td><td></td></tr><tr><td>Acetylthiocholiniodid</td><td>Sigma</td><td>1480</td><td></td></tr><tr><td>Benzoesäure</td><td>Sigma</td><td>D8130</td><td></td></tr><tr><td>Natriumbicarbonat</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Acetylcholinesterase</td><td>Sigma</td><td>C3389</td><td></td></tr><tr><td>96-Well-klare Mikrotiterplatte</td><td>Medizinische Versorgungspartner</td><td>TR5003</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax 190 Mikroplatten-Reader</td><td>Molekulare Geräte</td><td>190</td><td>Fluoreszenzplatten-Reader</td></tr><tr><td>Criterion Gel-Elektrophorese-Zelle</td><td>BIO-RAD</td><td>165-6001</td><td></td></tr><tr><td>Transblot Gel&nbsp;</td><td>BIO-RAD</td><td>170-3910</td><td></td></tr><tr><td>Transfer Cell</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl Criterion Fertiggele</td><td>BIO-RAD</td><td>567-1093</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD45 Antikörper&nbsp;</td><td>Abcam&nbsp;</td><td>Ab10558</td><td></td></tr><tr><td>CD63 Antikörper (H-193)</td><td>Santa Cruz Biotech, Inc.</td><td>SC-15363</td><td></td></tr><tr><td>CD9 Antikörper (H-110)</td><td>Santa Cruz Biotech, Inc.</td><td>SC-9148</td><td></td></tr><tr><td>Kaninchen pAb p24 HIV-1&nbsp;</td><td>ImmunoDX, LLC</td><td>1303</td><td></td></tr><tr><td>Nitrozellulose-Membran&nbsp;</td><td>BIO-RAD</td><td>G1472430</td><td></td></tr><tr><td>Tris gepufferte Kochsalzlösung</td><td>BIO-RAD</td><td>170-6435</td><td></td></tr><tr><td>HRP-konjugierter IgG (H+L) Sekundärantikörper</td><td>Thermo Scientific</td><td>31460</td><td>Ziegen-Anti-Kaninchen</td></tr><tr><td>HRP-konjugiertes IgG (H+L) Sekundärantikörper</td><td>Thermo Scientific</td><td>31430</td><td>Ziegen-Anti-Maus</td></tr><tr><td>Western Blotting Luminol Reagenz</td><td>Santa Cruz Biotech, Inc.</td><td>SC-2048</td><td></td></tr><tr><td>GE LAS-4010 Imager</td><td>GE Healthcare</td><td>LAS-4010</td><td></td></tr><tr><td>Humanes Procarta-Zytokin-Immunoassay-Kit</td><td>Affymetrix&nbsp;</td><td>N/A</td><td>Kundenspezifisches Immunoassay-Panel</td></tr><tr><td>Bio-Plex 200 Immunobead Reader</td><td>BIO-RAD</td><td>171-000201</td><td></td></tr><tr><td>Coulter Z2 Partikelzähler</td><td>Beckman Coulter</td><td>383552</td><td>Zellzähler</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 700-markierter Anti-CD3</td><td>BD Bioscience (UCHT1)</td><td>300424</td><td></td></tr><tr><td>APC/Cy7-markierter Anti-CD4</td><td>Biolegend (OKT4)</td><td>317418</td><td></td></tr><tr><td>PerCP-markiert Anti-CD4</td><td>BD Bioscience (RPA-T8)</td><td>550631</td><td></td></tr><tr><td>V450-markiertes Anti-CD8</td><td>BD Bioscience (RPA-T8)</td><td>560347</td><td></td></tr><tr><td>Biotin-markiertes Anti-CD45RA</td><td>BD Bioscience (HI100</td><td>)555487</td><td></td></tr><tr><td>PE/Cy7-markiertes Anti-CD62L</td><td>Biolegend (DREG-56)</td><td>304822</td><td></td></tr><tr><td>PE/Cy5-markiertes Anti-CD38</td><td>Biolegend (HIT2)</td><td>303508</td><td></td></tr><tr><td>APC/ Cy7-markierte Anti-HLADR-Biolegende</td><td>(L243)</td><td>307618</td><td></td></tr><tr><td>PE-Texas Red-markierte Anti-Streptavidin-Biolegende</td><td>BD Bioscience</td><td>551487</td><td></td></tr> PE<tr><td>/Cy5-markierte Maus IgG1K</td><td>Biolegend (MOPC-21)</td><td>400116</td><td></td></tr><tr><td>APC/Cy7-markierte Maus IgG2aK</td><td>Biolegend (MOPC-173)</td><td>400229</td><td></td></tr></tbody></table>

isolierung der exosomen aus dem plasma von hiv-1-positiven individuen

Isolation of Exosomes from the Plasma of HIV-1 Positive Individuals

Exosomen sind kleine Vesikel mit einer Größe von 30 nm bis 100 nm, das sowohl konstitutiv und nach Stimulation aus einer Vielzahl von Zelltypen freigesetzt werden. Sie sind in einer Reihe von biologischen Flüssigkeiten gefunden und sind dafür bekannt, eine Vielzahl von Proteinen, Lipiden und Nukleinsäuremoleküle tragen. Anfangs angenommen, dass etwas mehr als Reservoire für Zelltrümmer werden die Rollen der Exosomen Regel biologischen Prozessen und bei Erkrankungen mehr geschätzt. Es wurden mehrere Verfahren zum Isolieren von Exosomen aus Zellkulturmedien und biologischen Flüssigkeiten beschrieben. Aufgrund ihrer geringen Größe und Dichte, Differenz Ultrazentrifugation und / oder Ultrafiltration sind die am häufigsten verwendeten Techniken zum exosome Isolation. Ein Plasma aus HIV-1-infizierten Individuen enthalten jedoch beide Exosomen und HIV-Viruspartikel, die eine ähnliche Größe und Dichte. Somit effiziente Trennung der Exosomen aus HIV-Viruspartikeln in menschlichem Plasma wurdeeine Herausforderung. Um diese Einschränkung zu beheben, eine Prozedur aus Cantin et modifizierten entwickelten wir. al., 2008, für die Reinigung von Exosomen aus HIV-Partikeln in menschlichem Plasma. Iodixanol Geschwindigkeitsgradienten wurden verwendet, um Exosomen aus HIV-1-Partikeln in dem Plasma von HIV-1-positiven Individuen zu trennen. Viruspartikel wurden durch p24 ELISA identifiziert. Exosomen wurden auf der Basis von Exosom Marker Acetylcholinesterase (AChE) und das CD9, CD63 und CD45-Antigene identifiziert. Unsere Gradienten Verfahren ergab Exosom Präparate frei von Viruspartikeln. Die effiziente Reinigung von Exosomen aus menschlichem Plasma ermöglichte es uns, den Gehalt an Plasma abgeleiteten Exosomen untersucht und ihre immunmodulatorische Potential und andere biologische Funktionen zu untersuchen.

Exosomen sind effizient von HIV-1-positive Humanplasma gereinigt. Isolated Exosomen von Acetylcholinesterase (AChE) Aktivität identifiziert, getrennt in geringerer Dichte Fraktionen 1-3 an der Spitze der Iodixanol Gradienten, während Viruspartikel, die von HIV-1-Antigen p24 identifiziert , getrennt in den höheren Dichte Fraktionen (10-12, in der Nähe der Unterseite). Die Anwesenheit von Exosomen wurde durch Immunoblot Identifizierung exosome Marker AChE, CD9, CD45 und CD...

Es werden Techniken beschrieben, die ein Gradientenverfahren zur Trennung von Exosomen von Partikeln des humanen Immundefizienzvirus (HIV) beschreiben. Dieses Verfahren wurde verwendet, um Exosomen weg von HIV-Partikeln im menschlichen Plasma von HIV-infizierten Personen zu isolieren. Die isolierten Exosomen wurden auf ihren Zytokin-/Chemokingehalt analysiert.

Isolierung der Exosomen aus dem Plasma von HIV-1-positiven Individuen

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. ...

Während einer HIV-Infektion werden sowohl Viren als auch mikrovesikuläre Strukturen, sogenannte Exosome, von virusinfizierten Zellen produziert. Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Exosome von Viruspartikeln in Plasma-Proben von HIV-infizierten Patienten zu trennen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Exosomenforschung zu beantworten, beispielsweise welche Proteine oder anderen Moleküle in Exosomen vorhanden sind, die während einer HIV-Infektion gebildet werden.Den Ablauf demonstriert Dr. Ming Bo Huang, Dozent in der Abteilung für Mikrobiologie, Biochemie und Immunologie sowie Mitglied der HIV/AIDS-Gruppe am Moorehouse School of Medicine. Nachdem menschliches Blut gesammelt und gemäß dem schriftlichen Protokoll das Plasma isoliert wurde, 10 Milliliter 1X PBS zu 10 Millilitern Plasma in einem 15-Milliliter-Röhrchen hinzufügen. Die Probe bei 10.000 × g und 4 °C 30 Minuten lang zentrifugieren, um zelluläre Trümmer zu entfernen.Überführen Sie mit einer sterilen serologischen Pipette das geklärte Plasmasupernatant in ein sauberes 25-Milliliter-Ultrazentrifugenröhrchen. Zentrifugieren Sie anschließend das geklärte Plasma bei 200.000 × g und vier Grad Celsius zwei Stunden lang, um große Vesikel abzutrennen. Entfernen Sie danach vorsichtig das Überstand und entsorgen Sie ihn im Bioabfall. Das Pellet mit einem Milliliter 1× PBS resuspendieren und 30 Minuten bei Raumtemperatur unter vorsichtigem Schwenken inkubieren, um Partikel zu lösen und zu dispergieren. 24 Milliliter PBS zu der gerade resuspendierten Exosom-Virus-Lösung in einem 25-Milliliter-Ultrazentrifugenröhrchen hinzufügen und das Röhrchen fünfmal umdrehen, um die Lösung zu mischen. Anschließend erneut bei 200.000 × g und 4 °C zwei Stunden zentrifugieren, bevor die PBS-Waschlösung im Bioabfall entsorgt wird.Um Geschwindigkeitsgradienten von sechs bis 18 % mit Iodixanol herzustellen, beginnen Sie mit einer 60 %igen Stammlösung des Iodixanol-Reagenz und verdünnen Sie diese mit 1× PBS auf 6 % und 18 %. Schalten Sie den Rührer ein und pipettieren Sie 5,5 Milliliter der 18 %igen Lösung in die gerührte Kammer und 5,5 Milliliter der 6 %igen Lösung in die Reservoirkammer eines zweikammerigen Gradientenherstellers. Öffnen Sie anschließend den Hahn, schalten Sie die Pumpe ein und lassen Sie beide Lösungen in eine 14-Milliliter-Ultrazentrifugenröhrchen fließen. Danach schichten Sie vorsichtig je einen Milliliter der Exosomen-Virus-Lösung auf die Oberseite jedes 11-Milliliter-Gradienten.Danach die Gradienten mit einem SW-40-Ti-Schwenkkorbrotor bei 250.000 × g und vier Grad Celsius zwei Stunden lang zentrifugieren. In der Zwischenzeit 12 Mikrozentrifugenröhrchen mit je 1,5 Milliliter beschriften. Nach dem Zentrifugieren ein Milliliter von der Oberseite des Gradienten abnehmen und in das Röhrchen Nummer eins übertragen.Übertragen Sie anschließend die verbleibenden einteiligen Milliliter-Fraktionen in aufsteigender Reihenfolge auf die Röhrchen zwei bis zwölf. Stellen Sie das Assay-Reagenz her, indem Sie 100 Teile 1X PBS, zwei Teile Substrat und fünf Teile Farbindikator mischen. Übertragen Sie danach von jeder der 12 einmilliliterigen Gradientenfraktionen jeweils 50 Mikroliter im Duplikat in die Vertiefungen einer 96-Loch-Mikrotiterplatte.Stellen Sie eine Reihe von Standards her, indem Sie zunächst eine 2.000 Milliunits pro Milliliter ACHE-Stammlösung in PBS ansetzen. Führen Sie anschließend 11 zweifache serielle Verdünnungen der Stammlösung durch und geben Sie 50 Mikroliter jeder Verdünnung, beginnend mit 2.000 Milliunits pro Milliliter, in eine einzelne Vertiefung einer 96er-Mikrotiterplatte. Geben Sie 200 Mikroliter der Assay-Reagenzienmischung in jede Vertiefung mit den Standards und den Gradientenfraktionen und inkubieren Sie die Platte 20 Minuten im Plattenreader, um die Farbentwicklung zu ermöglichen.Schließlich wird die ACHE-Aktivität mit einem Fluoreszenz-Mikroplattenreader bei einer Wellenlänge von 450 Nanometern gemessen. Führen Sie zusätzliche Assays gemäß dem Textprotokoll durch. Wie hier gezeigt, konnten isolierte Exosome, die anhand ihrer ACHE-Aktivität identifiziert wurden, in den niedergradigen Fraktionen eins bis drei am oberen Ende der Iodixanol-Gradienten nachgewiesen werden, während Viruspartikel, die über das HIV-Antigen P24 identifiziert wurden, in den höhergradigen Fraktionen 10 bis 12 vorkamen.Diese Tabelle zeigt die Analyse von Exosomen und nichtfraktioniertem Plasma für 21 Zytokine und Chemokine mittels eines Multiplex-Assays. Wie hier angegeben, wurden alle 21 Zytokine und Chemokine in Exosomen von HIV-1-positiven Personen nachgewiesen, und ihre Konzentrationen waren im Vergleich zu Plasma und Exosomen von HIV-1-negativen Kontrollpersonen signifikant erhöht. In dieser Abbildung wurden periphere mononukleäre Blutzellen (PBMCs) von nichtinfizierten Spendern Exosomen aus HIV-1-positiven oder negativen Personen ausgesetzt.Nach 48 Stunden postexposition waren die Spiegel des Aktivierungsmarkers CD38 auf der Oberfläche naiver und zentraler Gedächtnis-CD4-positiver sowie CD8-positiver T-Zellen signifikant erhöht, wenn diese Exosomen aus HIV-1-positivem Material ausgesetzt worden waren, verglichen mit der Behandlung mit HIV-negativem Material. Während des Acetylcholinesterase-Assays ist es wichtig, die Platte vor starkem Licht zu schützen. Diese Technik hat Forschern auf dem Gebiet HIV/AIDS den Weg geebnet, die Rolle von Exosomen bei der HIV-Infektion und bei der Immunaktivierung zu untersuchen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Dieses Papier zeigt Methoden zur Isolierung, Aufreinigung und Detektion von Exosomen, sowie Techniken für die Analyse ihrer molekularen Inhalten. Diese Methoden sind anpassungsfähig für Exosom Isolation von beiden Zellkulturmedien und biologischen Flüssigkeiten, und kann darüber hinaus Analyse molekularer Inhalte auch in funktionellen Studien nützlich sein.

Isolierung und Charakterisierung von RNA-haltigen Exosomen

Die plasmaisolierten Exosomen können als nicht-invasive und wiederholbare Methode zum Nachweis und zur Nachverfolgung der Biomarker zur Früherkennung und zum Fortschreiten der Krankheit verwendet werden. Dieses Video beschreibt das Protokoll für die Trennung von Exosomen aus den Plasmaproben von Patienten mit nicht-kleinzelligem Lungenkrebs, die für DNA- und Proteinextraktionen verwendet werden könnten.

Exosomenisolierung: Eine Technik zur Trennung von Exosomen aus dem Plasma von Patienten mit nicht-kleinzelligem Lungenkrebs

Gallenflüssigkeit ist eine wertvolle Quelle für extrazelluläre Vesikel/Exosomen, die potenziell wichtige Biomarker enthalten. Dieses Protokoll stellt eine robuste Methode zur Isolierung von Exosomen aus menschlicher Galle für weitere Analysen, einschließlich miRNA-Profiling, dar.

Isolation und Profilierung von microRNA-haltigen Exosomen von Human Bile

MicroRNAs spielen eine wichtige regulatorische Rolle und werden als neue therapeutische Targets für verschiedene menschliche Krankheiten entstehen. Es hat sich gezeigt, dass miRNAs in Lipoproteinen hoher Dichte durchgeführt werden. Wir haben ein vereinfachtes Verfahren entwickelt, um schnell gereinigter HDL für miRNA-Analyse von Humanplasma geeignet isolieren.

Schnelle und vereinfachte Verfahren für Hochdurchsatz-Isolierung von miRNA aus Highly Purified High Density Lipoprotein

Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung und Quantifizierung von kleinen RNAs mit hohem Dichtheits-Lipoprotein.

Isolierung von Lipoproteinen hoher Dichte für Non-coding Small RNA Quantification

Hier beschreiben wir eine quantitative Proteomik Verfahren die Technik der Silac (SILAC) mit Hilfe der Wirkung von HIV-1-Infektion auf Host exosomalen Proteome zu analysieren. Dieses Protokoll kann leicht an Zellen unter verschiedenen Stress oder Infektionsbedingungen angepasst werden.

SILAC Based Proteomic Charakterisierung von Exosomen aus HIV-1-infizierten Zellen

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll exosomen von Plasma und Serum mit reduzierter CO Reinigung nicht Exosomal Blut zu reinigen. Das optimierte Protokoll beinhaltet Ultrafiltration, Protease Behandlung und Größe Ausgrenzung Chromatographie. Verbesserte Reinigung von exosomen Vorteile nachgeschalteten Analysen, einschließlich genauere Quantifizierung von Vesikeln und Proteomic Charakterisierung.

Proteinverdauung, Ultrafiltration und Größe Ausgrenzung Chromatographie, die Isolation der Exosomen aus menschlichem Blutplasma und Serum zu optimieren

Dieses Protokoll isoliert extrazelluläre Vesikel (EVs) von Virionen mit hoher Effizienz und Ausbeute, indem EV-Fällung, Dichtegradient-Ultrazentrifugation und Partikelerfassung integriert werden, um einen optimierten Workflow und eine Reduzierung des Startens zu ermöglichen. Mengenanforderungen, die zu reproduzierbaren Präparaten für den Einsatz in allen EV-Forschungen führen.

Reinigung von hochertragreichen extrazellulären Vesikelpräparaten weg vom Virus

Dieser Artikel beschreibt eine Methodik zur Isolierung, Charakterisierung und Quantifizierung von extrazellulären Vesikeln (EV) aus humanem Plasma und stellt einen Arbeitsablauf für die markierungsfreie Analyse des EV-Proteoms mittels Flüssigchromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) vor.

Isolierung, Charakterisierung und proteomische Analyse von aus Plasma gewonnenen extrazellulären Vesikeln zur Entdeckung kardiovaskulärer Biomarker

Wir haben einen lentiviralen Vektor, besitzt neben dem Tat-responsive LTR entwickelt, das Rev-Response-Element (RRE), dass die Expression des Reportergens in einer HIV-1 Tat-und Rev-abhängigen Weise regulieren können. Der Vektor erlaubt den spezifischen Nachweis von HIV Replikation in lebenden Zellen über die Expression von GFP.

Spezielle Kennzeichnung von HIV-1 positiven Zellen mit Hilfe eines Rev-abhängigen Lentivirale Vector mit dem Ausdruck des Green Fluorescent Protein

Erfahren Sie die Gradientenmethode zur Isolierung von Exosomen aus HIV-1-positivem menschlichem Plasma. Diese Technik ermöglicht die Analyse von Zytokinen und Chemokinen zur Untersuchung der HIV-Pathogenese.

Isolierung der Exosomen aus dem Plasma von HIV-1-positiven Individuen

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